基因组文库的构建课件.ppt

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1、关于基因组文库的构建现在学习的是第1页，共24页对于高等真核生物而言，基因组对于高等真核生物而言，基因组DNADNA十分十分庞大庞大,基因可达数万个，且基因组成结构基因可达数万个，且基因组成结构复杂，除编码序列，还有非编码序列及复杂，除编码序列，还有非编码序列及调控序列，基因间还存在大量的间隔序调控序列，基因间还存在大量的间隔序列和重复序列，因此，单个目的基因在列和重复序列，因此，单个目的基因在整个基因组中所占的比例极其微小，除整个基因组中所占的比例极其微小，除少数例外，绝大多数基因难以直接分离少数例外，绝大多数基因难以直接分离得到。得到。现在学习的是第2页，共24页为了解决这个难题，一种可行

2、的方法就为了解决这个难题，一种可行的方法就是将这个基因扩增，增加成功分离目的是将这个基因扩增，增加成功分离目的基因的可能性。但是由于要分离的目的基因的可能性。但是由于要分离的目的基因往往是未知基因，因此无法对它进基因往往是未知基因，因此无法对它进行特异性扩增，只能构建该生物材料的行特异性扩增，只能构建该生物材料的基因文库，然后再根据不同的方法将所基因文库，然后再根据不同的方法将所需的克隆筛选出来，最后分离得到目的需的克隆筛选出来，最后分离得到目的基因。基因。现在学习的是第3页，共24页基因组文库基因组文库(Genomic library)：是指将某种生物体的全部基因组是指将某种生物体的全部基因

3、组DNA用限制性用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片片段，再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿段，再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落，这个群体就称为该主细胞获得的所有阳性菌落，这个群体就称为该生物基因组文库。其目生物基因组文库。其目 的是分离有用的目的基因的是分离有用的目的基因 和保存某种生物的全部基因。和保存某种生物的全部基因。现在学习的是第4页，共24页第一节 基因组基因组DNADNA文库的构建文库的构建一、基因组一、基因组DNA文库的类型文库的类型 根据所选用的载体可以分为：根据所选用的载体可以分为：质粒文

4、库、噬菌体文库、粘粒文库、质粒文库、噬菌体文库、粘粒文库、人工染色体文库（细菌人工染色体文库、人工染色体文库（细菌人工染色体文库、酵母人工染色体文库）。酵母人工染色体文库）。现在学习的是第5页，共24页二、基因组二、基因组DNA文库的质量标准文库的质量标准一个理想的基因组一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件：文库应具备下列条件：重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序克隆与克隆之间必须存在足

5、够长度的重叠区域，以利克隆排序克隆片段易于从载体分子上完整卸下克隆片段易于从载体分子上完整卸下重组克隆能稳定保存、扩增、筛选重组克隆能稳定保存、扩增、筛选现在学习的是第6页，共24页三、基因组三、基因组DNADNA文库构建的程序文库构建的程序 载体载体DNADNA的制备；的制备；高高纯纯度度大大相相对对分分子子质质量量基基因因组组DNADNA的的提提取和大片段的制备；取和大片段的制备；高高纯纯度度大大相相对对分分子子质质量量基基因因组组DNADNA的的部部分酶切与脉冲电泳分级分离；分酶切与脉冲电泳分级分离；载载体体与与外外源源片片段段的的连连接接与与转转化化或或侵侵染染宿主细胞；宿主细胞；重组

6、克隆的挑选和保存。重组克隆的挑选和保存。现在学习的是第7页，共24页基因组DNA文库限制性内切酶限制性内切酶基因组DNA基因重组转化细菌体外包装现在学习的是第8页，共24页四、生物基因组DNA文库的构建（一）生物基因组（一）生物基因组DNA的提取的提取 染色体染色体DNA 现在学习的是第9页，共24页（二）基因组（二）基因组DNA的不完全酶切的不完全酶切1、根据实验需要选择合适的限制性内切酶、根据实验需要选择合适的限制性内切酶 a)四个识别位点的限制酶出现的几率四个识别位点的限制酶出现的几率:1/256 b)六个识别位点的限制酶出现的几率六个识别位点的限制酶出现的几率:1/10242、分离目的

7、酶切片段大小的确定、分离目的酶切片段大小的确定 a)克隆单个基因：克隆单个基因：10 kb b)克隆基因族：克隆基因族：20kb3、DNA不完全酶切条件的确定不完全酶切条件的确定 a)确定限制酶用量，改变酶切时间确定限制酶用量，改变酶切时间 b)固定酶切时间，改变限制酶的用量固定酶切时间，改变限制酶的用量现在学习的是第10页，共24页DNA的不完全酶切的不完全酶切现在学习的是第11页，共24页（三）酶切片段与克隆载体连接（三）酶切片段与克隆载体连接、酶切片段的分离与纯化、酶切片段的分离与纯化）低熔点琼脂糖回收目的片段）低熔点琼脂糖回收目的片段）试剂盒回收目的片段）试剂盒回收目的片段现在学习的是

8、第12页，共24页2、酶切片段与克隆载体连接克隆载体的选择、酶切片段与克隆载体连接克隆载体的选择 a）质粒载体可承载）质粒载体可承载15kb DNA左右片段左右片段(有效的范有效的范围为围为10kb)b）载体可承载载体可承载25kb DNA左右片段左右片段(有效的范围有效的范围为为15 kb)c）Cosmid 载体可承载载体可承载45kb DNA左右片段左右片段(有效有效的范围为的范围为40 kb)现在学习的是第13页，共24页（四）重组转化受体细胞（四）重组转化受体细胞、根据克隆载体的性质选择合适的受体细胞、根据克隆载体的性质选择合适的受体细胞常见的宿主细胞：DH5:用于铺制与培养质粒平板和

9、粘粒平板的重组缺陷型的抑制型菌株，可与pUC编码的半乳糖苷酶氨基端实现互补。HB101:用于大规模制备质粒的抑制型菌株，转化效率高JM101:可支持带有琥珀突变载体生长的宿主菌JM109:支持带有琥珀突变载体生长的重组缺陷的抑制型菌MZ-1:温度敏感的溶源性菌株，用于含有噬菌体启动子质粒载体的宿主菌现在学习的是第14页，共24页、重组质粒转化受体细胞、重组质粒转化受体细胞1）转化法）转化法(transformation)(transformation)2 2）转导法）转导法(transduction)(transduction)3 3）转染法）转染法(transfection)(transfe

10、ction)现在学习的是第15页，共24页（五）基因组（五）基因组DNA文库克隆子的保存与筛选文库克隆子的保存与筛选 1、基因组基因组DNA文库的保存文库的保存 1)影印膜滤保存法影印膜滤保存法现在学习的是第16页，共24页2）文库在液体培养基中扩增保存）文库在液体培养基中扩增保存方法：从琼脂糖平板上挑取已长出的克隆方法：从琼脂糖平板上挑取已长出的克隆 子转入含适当的抗生素培养基中，混子转入含适当的抗生素培养基中，混 合的细菌生长数代后，其培养物于合的细菌生长数代后，其培养物于-70 oC储存（加终浓度为储存（加终浓度为25%的甘油）。的甘油）。缺点：因文库菌落生长的不均匀性而导致缺点：因文库

11、菌落生长的不均匀性而导致 文库中某些特定的序列过多或过少。文库中某些特定的序列过多或过少。现在学习的是第17页，共24页3)保存单个克隆子于含有甘油的培养基中保存单个克隆子于含有甘油的培养基中方法：从平板上挑选单个克隆子接种于合方法：从平板上挑选单个克隆子接种于合 适的含抗生素的培养基中，菌体生适的含抗生素的培养基中，菌体生 长到一定浓度后，加入终浓度为长到一定浓度后，加入终浓度为25%的甘油，于的甘油，于-70 oC或或-25 oC下保存。下保存。缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大现在学习的是第18页，共24页2、基因组文库的筛选、基因组文库的筛选 分子

12、杂交法：利用分子探针对文库进行分子杂交法：利用分子探针对文库进行筛选筛选PCR筛选法：根据保守序列合成引物，筛选法：根据保守序列合成引物，扩增特异性片段扩增特异性片段现在学习的是第19页，共24页 基因文库的筛选与鉴定现在学习的是第20页，共24页PCRPCR筛选法筛选法 利利用用合合适适的的引引物物，以以从从初初选选出出来来的的阳阳性性克克隆隆中中提提出出的的质质粒粒为为模模板板进进行行PCRPCR，通通过过对对PCRPCR产产物物的的电电泳泳分分析析，确确定定目目的的基基因因是是否否插插入到载体中。入到载体中。现在学习的是第21页，共24页现在学习的是第22页，共24页 菌落原位杂交法菌落原位杂交法 （colony in situ hybridizationcolony in situ hybridization）1 19 97 75 5年年，M M.G G r ru un ns st te ei i n n和和D D.H H o os sn ne es se e根根据据检检测测重重组组子子D DN NA A分分子子的的核核酸酸杂杂交交技技术术原原理理，对对S So ou ut th he er rn n印印迹迹技技术术作作了了一一些些修修改改，提提出出了了菌菌落落原原位位杂杂交交技技术术。现在学习的是第23页，共24页感感谢谢大大家家观观看看现在学习的是第24页，共24页