分子克隆载体与宿主讲稿.ppt

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1、关于分子克隆载体与宿主第一页，讲稿共一百二十五页哦主要内容n第一节第一节 分子克隆载体的特点分子克隆载体的特点n第二节第二节 大肠杆菌克隆载体大肠杆菌克隆载体n第三节 真核细胞的克隆载体真核细胞的克隆载体n第四节第四节 宿主系统宿主系统第二页，讲稿共一百二十五页哦第一节第一节 分子克隆载体的特点分子克隆载体的特点n1.载体的定义n2.分子克隆载体的功能n3.发展概况n4.载体的特点n5.遗传标记基因第三页，讲稿共一百二十五页哦1.1.分子克隆载体的定义分子克隆载体的定义 分子克隆载体分子克隆载体(vector)是一类可供外源是一类可供外源DNA插入并携带重组插入并携带重组DNA分子进入适当分子

2、进入适当宿主细胞的宿主细胞的DNA分子分子第四页，讲稿共一百二十五页哦第五页，讲稿共一百二十五页哦2.分子克隆载体的功能分子克隆载体的功能:n为外源基因提供进入受体细胞的为外源基因提供进入受体细胞的转移转移能力能力n为外源基因提供在受体细胞的为外源基因提供在受体细胞的复制复制或或整合整合能力能力n为外源基因提供在受体细胞中的为外源基因提供在受体细胞中的扩增扩增和和表达表达能力能力第六页，讲稿共一百二十五页哦3.发展概况发展概况n第第一一阶阶段段（19771977年年前前）：天天然然质质粒粒和和重组质粒的利用重组质粒的利用 如如pSC101,ColE1,pCR,pBR313pSC101,ColE

3、1,pCR,pBR313 n第第二二阶阶段段：增增大大载载体体容容量量，建建立立多多克克隆位点区和新的遗传标记基因隆位点区和新的遗传标记基因 n第第三三阶阶段段：进进一一步步完完善善载载体体的的功功能能以以满足基因工程克隆中的不同要求满足基因工程克隆中的不同要求 第七页，讲稿共一百二十五页哦4.载体的特点载体的特点第八页，讲稿共一百二十五页哦n至少有一个至少有一个复制起点复制起点，因而至少可在一种生物体中，因而至少可在一种生物体中有效复制，稳定遗传有效复制，稳定遗传n至少应有一个至少应有一个遗传标记遗传标记基因，以指示载体或重组基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞分子是否进入宿主细

4、胞n至少应有一个至少应有一个限制酶识别限制酶识别位点，以供外源位点，以供外源DNA插插入入n具有较小的分子量和较高的拷贝数具有较小的分子量和较高的拷贝数n具有对受体细胞的可转移性具有对受体细胞的可转移性,提高载体导入受体细提高载体导入受体细胞的效率胞的效率第九页，讲稿共一百二十五页哦第十页，讲稿共一百二十五页哦第十一页，讲稿共一百二十五页哦第十二页，讲稿共一百二十五页哦第十三页，讲稿共一百二十五页哦第十四页，讲稿共一百二十五页哦5.遗传标记基因遗传标记基因n标记基因的作用标记基因的作用n标记基因的种类标记基因的种类n常用的标记基因常用的标记基因第十五页，讲稿共一百二十五页哦 标记基因的作用：标

5、记基因的作用：n指指示示外外源源DNA分分子子（载载体体或或重重组组分分子子）是是否否进入宿主细胞进入宿主细胞 n指指示示外外源源DNA分分子子是是否否插插入入载载体体分分子子形形成成了重组子了重组子 第十六页，讲稿共一百二十五页哦标记基因的种类：标记基因的种类：n抗性标记基因抗性标记基因 n营养标记基因营养标记基因 n生化标记基因生化标记基因 第十七页，讲稿共一百二十五页哦常用的遗传标记基因常用的遗传标记基因 n四环素抗性基因（四环素抗性基因（Tcr）抑抑菌菌剂剂，Tetracycline 可可结结合合在在核核糖糖体体30s亚亚基基中中的的一一种种蛋蛋白白质质分分子子上上，抑抑制制核核糖糖体

6、体的的转转位位过过程程。抑抑制制细细胞胞蛋蛋白白质质合合成，细胞停止生长。成，细胞停止生长。四环素抗性基因编码一种四环素抗性基因编码一种399 AAs蛋蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。分子进入细菌细胞。第十八页，讲稿共一百二十五页哦n氨苄青霉素抗性基因（氨苄青霉素抗性基因（Apr）杀杀菌菌剂剂，Ampicillin可可抑抑制制细细菌菌细细胞胞膜膜上上参参与与细细胞胞壁壁合合成成酶酶类类的的活活性性，干干扰扰细胞分裂，杀死细胞。细胞分裂，杀死细胞。Apr抗性基因编码一种分泌到细菌细抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，催化胞周间质的酶，

7、催化内酰胺环的水解，内酰胺环的水解，使氨苄青霉素失活。使氨苄青霉素失活。第十九页，讲稿共一百二十五页哦n氯霉素抗性基因（氯霉素抗性基因（Cmr）抑抑菌菌剂剂，Chlorophenicol可可结结合合在在核核糖糖体体50 S亚基上，阻止蛋白质合成。亚基上，阻止蛋白质合成。Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化，导致乙酰化的氯霉素不氯霉素乙酰化，导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。能结合在核糖体上。第二十页，讲稿共一百二十五页哦n卡那霉素卡那霉素(Kanr)、新霉素新霉素(Neor)、G418抗性基因抗性基因(G418r)杀杀 菌菌 剂剂，Kanamycin，

8、Neomycin和和G418均均属属脱脱氧氧链链霉霉胺胺氨氨基基葡葡萄萄糖糖苷苷类类抗抗生生素素，可可结结合合在在核核糖糖体体上上，导导致致mRNA发生错读。发生错读。来来自自转转座座子子Tn5和和Tn903的的Kanr抗抗性性基基因因均均可可使使这这类类抗抗生生素素磷磷酸酸化化，使使之之不不能能进入细胞内进入细胞内。第二十一页，讲稿共一百二十五页哦n半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（lacZ 和和lacZ）半乳糖苷酶基因编码半乳糖苷酶基因编码1021个个 氨基酸氨基酸 其氨基末端称为其氨基末端称为链，羧基末端称为链，羧基末端称为链链 链负责将链负责将链装配为四聚体链装配为四聚体 单单独独的的链

9、链不不具具酶酶活活性性，只只有有在在链链的的帮帮助助下下组组装装成成4才具有酶活性才具有酶活性-互补作用互补作用 为为链编码的基因称之为链编码的基因称之为lacZ(编码编码145 AAs)第二十二页，讲稿共一百二十五页哦第二十三页，讲稿共一百二十五页哦第二十四页，讲稿共一百二十五页哦第二十五页，讲稿共一百二十五页哦半乳糖苷酶基因的优点半乳糖苷酶基因的优点 酶催化酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观水解为兰色产物，检测直观 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactosideLacZ和和链基因的分别表达可使载体小而链基因的分别表达可使载体小而容量的大容量的大 通常

10、以通常以 LacZ作为载体的遗传标记基因，而由作为载体的遗传标记基因，而由 宿主细宿主细胞表达胞表达链链第二十六页，讲稿共一百二十五页哦n葡萄糖苷酸酶基因（葡萄糖苷酸酶基因（GUS）-葡萄糖苷酸酶可将葡萄糖苷酸酶可将X-Gluc降解为降解为兰色产物兰色产物 适用范围十分广泛，因为许多生物适用范围十分广泛，因为许多生物中没有这种基因中没有这种基因第二十七页，讲稿共一百二十五页哦n荧光素酶基因荧光素酶基因 荧荧光光素素酶酶或或由由萤萤火火虫虫产产生生，可可催催化化荧荧光光素氧化，并产生荧光素氧化，并产生荧光 或或 由由 发发 光光 细细 菌菌（Photobacterium fischeri）产生）

11、产生第二十八页，讲稿共一百二十五页哦n绿色荧光蛋白基因（绿色荧光蛋白基因（GFP）GFP是由水母产生的一种可发光的蛋白质是由水母产生的一种可发光的蛋白质 第二十九页，讲稿共一百二十五页哦问题n1.一个质粒含有四环素抗性基因（tetr）和LacZ基因，tetr内有一Hind III位点，LacZ中有一EcoR I位点。如用这两种限制性核酸内切酶切割载体一并连接入相应的外源片段，则带有该重组质粒的细胞将（）。n A.有四环素抗性，在X-gal平板上呈现蓝色 n B.对四环素敏感，在X-gal平板上呈现蓝色 n C.有四环素抗性，在X-gal平板上呈现白色 n D.对四环素敏感，在X-gal平板上呈

12、现白色第三十页，讲稿共一百二十五页哦n2.LacZ基因通常用于构建质粒载体的目的是什么？（）n A.编码一种限制性内切核酸酶，在转化细胞时用于切割载体n B.编码蓝色色素产物，可用于示踪转化的细胞 n C.编码一种酶，将RNA转化为DNA n D.编码一种抗生素抗性的酶 n E.编码一种可检测的酶，当基因内部的位点插入任何外源片段，ORF遭到破坏时，产物即不能表达。第三十一页，讲稿共一百二十五页哦第二节第二节 大肠杆菌克隆载体大肠杆菌克隆载体第三十二页，讲稿共一百二十五页哦主要内容n一一.质粒载体质粒载体n二.载体载体n三三.cos 质粒质粒n四四.细菌人工染色体细菌人工染色体第三十三页，讲稿

13、共一百二十五页哦质粒载体n1.质粒的基本特性n2.质粒的改造、构建与使用n3.质粒的分类及用途n4.常用的质粒载体第三十四页，讲稿共一百二十五页哦1.质粒的基本特性质粒的基本特性质粒质粒是一类存在于细菌细胞中能独立于染是一类存在于细菌细胞中能独立于染色体色体DNA而自主复制的共价而自主复制的共价,闭合闭合,环状双环状双链链DNA分子分子(1500 kb)(Covalently closed circular DNA,cccDNA)第三十五页，讲稿共一百二十五页哦第三十六页，讲稿共一百二十五页哦Plasmids:smaller cycles of double-strand DNA that d

14、o not carry essential genes第三十七页，讲稿共一百二十五页哦n1).具有自己的具有自己的复制起始位点复制起始位点(Origing)(ori)和控制复和控制复制频率的控制基因及编码基因，形成独立复制子制频率的控制基因及编码基因，形成独立复制子(Replico)结构。结构。n2）可扩增性可扩增性。n严紧型复制质粒严紧型复制质粒(Stringent)n 每个细胞复制每个细胞复制1-5 个质粒拷贝。个质粒拷贝。n松弛型复制质粒松弛型复制质粒(Relaxed)n 具有高拷贝数具有高拷贝数30-50个。个。第三十八页，讲稿共一百二十五页哦n3)可转移性可转移性在天然条件下，野生型

15、质粒通过细菌接合作在天然条件下，野生型质粒通过细菌接合作用从一个宿主细胞转移至另一个宿主细胞。用从一个宿主细胞转移至另一个宿主细胞。n4)选择标记的插入失活选择标记的插入失活第三十九页，讲稿共一百二十五页哦F plasmid第四十页，讲稿共一百二十五页哦第四十一页，讲稿共一百二十五页哦第四十二页，讲稿共一百二十五页哦n5）不相容性不相容性n相同或相似复制子结构及特征的两种不同质粒不能稳定地相同或相似复制子结构及特征的两种不同质粒不能稳定地存在于同一受体细胞内，这种现象称质粒的不相容性。存在于同一受体细胞内，这种现象称质粒的不相容性。na)两种不同质粒同时进入受体细胞，两者复制的起始两种不同质粒

16、同时进入受体细胞，两者复制的起始频率随机频率随机.nb)分裂前夕的拷贝数不均等，经过若干次细胞分裂后必分裂前夕的拷贝数不均等，经过若干次细胞分裂后必然导致，两种不同质粒的独占性。然导致，两种不同质粒的独占性。第四十三页，讲稿共一百二十五页哦2.质粒的改造、构建与使用质粒的改造、构建与使用n删除非必需区，减小质粒的分子量，提高外源删除非必需区，减小质粒的分子量，提高外源DNA的装载量的装载量(一般来说，大于一般来说，大于20kb的质粒很难导入受体细胞的质粒很难导入受体细胞)n加入遗传标记基因加入遗传标记基因n在标记基因内引入具有多种限制酶识别及切割位点的在标记基因内引入具有多种限制酶识别及切割位

17、点的DNA序列，即多克隆位点序列，即多克隆位点(multiple cloning sites，MCS)n根据不同要求，插入特殊的基因表达调控序列根据不同要求，插入特殊的基因表达调控序列n灭活某些质粒的编码基因灭活某些质粒的编码基因第四十四页，讲稿共一百二十五页哦第四十五页，讲稿共一百二十五页哦第四十六页，讲稿共一百二十五页哦质质粒粒载载体体克克隆隆的的一一般般步步骤骤 第四十七页，讲稿共一百二十五页哦see movie第四十八页，讲稿共一百二十五页哦3质粒的分类及用途n1）克隆质粒克隆质粒：用于克隆和扩增外源基因。n2）测序质粒测序质粒：na)高拷贝复制，便于DNA片段克隆和扩增。nb)含多酶

18、切口的接头片段，在接头片段两端邻近区域，设有两个不同的引物序列，重组质粒变性后即可测序。第四十九页，讲稿共一百二十五页哦n3）整合质粒整合质粒：n含有整合酶编码基因和特异性整合位点序列，克隆在整合质粒上的外源基因进入受体细胞后，准确重组整合在染色体的特定位置上。第五十页，讲稿共一百二十五页哦n4）穿梭质粒穿梭质粒na)分子上含有两个亲缘关系不同的复制子结构及相应选择标记基因，因此能在两种不同种属的受体中复制并检测。n大肠杆菌-链酶素穿梭质粒，大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒。nb)克隆在穿梭质粒上的外源基因不用更换载体直接从一个受体菌转移至另一个受体菌中复制并遗传。第五十一页，讲稿共一百二十五页哦n5

19、）探针质粒探针质粒na)设计用来筛选克隆基因的表达调控元件，如启动子，终止子。nb)装有定量检测表达程度的报告基因，（抗生素的抗性基因）nc)缺少启动子，终止子，载体本身不能表达报告基因nd)当含有启动子，终止子的DNA片段插入合适的位点，报告基因才能表达。ne)表达量的大小直接反应被克隆基因的表达调控元件的强弱。第五十二页，讲稿共一百二十五页哦n6）表达质粒表达质粒na)在多克隆位点的上游和下游分别装有两套转录效率较高的启动子，合适的核糖体结合位点（SD 序列），终止子结构。使得克隆在合适位点上的任何外源基因都可在受体细胞中,高效表达。nb)大肠杆菌常用启动子：Lac,Tac,Trp 和来自

20、噬菌体强启动子 PL,PR。它们由大肠杆菌 RNA 聚合酶识别起始.第五十三页，讲稿共一百二十五页哦nc)来自T7 噬菌体的T7 启动子。必须由T7 噬菌体来源 T7 RNA聚合酶识别起始转录。nd)表达载体用T7 启动子必须用能产生T7 RNA 聚合酶的受体菌株 JM109,DE3。第五十四页，讲稿共一百二十五页哦问题：n4.关于穿梭质粒载体，下面哪种说法最正确（）n A.在不同的宿主中具有不同的复制机制 n B.在不同的宿主细胞中使用不同的复制起点 n C.在不同的宿主细胞中使用不同的复制酶 n D.在不同的宿主细胞中具有不同的复制速率第五十五页，讲稿共一百二十五页哦4.常用的质粒载体常用

21、的质粒载体npBR322第五十六页，讲稿共一百二十五页哦第五十七页，讲稿共一百二十五页哦筛筛选选重重组组子子的的示示意意图图第五十八页，讲稿共一百二十五页哦npBR322质粒载体的优点质粒载体的优点:具有较小的分子量具有较小的分子量 (经验表明经验表明,为避免在为避免在DNA纯化过程中发生链的断裂纯化过程中发生链的断裂,克隆载体克隆载体的分子大小最好不要超过的分子大小最好不要超过10kb)具有两种抗生素的遗传标记基因具有两种抗生素的遗传标记基因,易于选择重组易于选择重组DNA分子分子 具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后，每个细胞中可累积10003000个拷贝 第五十九页，讲稿共一百二十五页

22、哦npUC系列载体系列载体 是在是在pBR322基础上衍生出来的一基础上衍生出来的一系列质粒载体系列质粒载体第六十页，讲稿共一百二十五页哦第六十一页，讲稿共一百二十五页哦第六十二页，讲稿共一百二十五页哦第六十三页，讲稿共一百二十五页哦第六十四页，讲稿共一百二十五页哦第六十五页，讲稿共一百二十五页哦npUC质粒载体的优点质粒载体的优点:具有更小的分子量和更高的拷贝数具有更小的分子量和更高的拷贝数 （2.7kb,500700 copies/cell）适用于组织化学法检测重组体，一步适用于组织化学法检测重组体，一步实现对阳性克隆的鉴定实现对阳性克隆的鉴定具有多克隆位点区（具有多克隆位点区（MCS）第

23、六十六页，讲稿共一百二十五页哦 Common plasmid vectors can carry up to 15kb foreign DNA第六十七页，讲稿共一百二十五页哦问题n1.质粒具备下列特征，因此适合作为克隆载体，除了（）。n A.赋予宿主细胞某种可检测的特性n B.可通过一定的纯化步骤与宿主细胞基因组分离n C.独立复制的能力n D.可复制自身DNA以及插入的外源DNAn E.甲基化防止宿主的限制性内切核酸酶对其降解n2.下列对质粒特性描述中，不正确的是（）。n A.既能以单链环状又能以双链环状的形式存在n B.是独立于细菌染色体DNA以外的复制子 n C.没有线性的质粒DNA n

24、 D.能够自身复制。第六十八页，讲稿共一百二十五页哦二.载体载体（Lambda vector）第六十九页，讲稿共一百二十五页哦主要内容：n1.噬菌体的基本特点噬菌体的基本特点n2.DNA作载体的优缺点和解决办法作载体的优缺点和解决办法n3.载体载体第七十页，讲稿共一百二十五页哦1.噬菌体的基本特点噬菌体的基本特点n1 1）.是大肠杆菌温和型噬菌体是大肠杆菌温和型噬菌体n2 2）.大肠杆菌大肠杆菌宿主细胞裂解释放噬菌体颗粒宿主细胞裂解释放噬菌体颗粒，n 噬菌体颗粒又感染附近大肠杆菌,形成新一轮裂解周期，-噬菌体悬浮液加到大肠杆菌液体培养基，37C培养6小时，培养液由混浊变澄清，说明大肠杆菌完全被

25、裂解。第七十一页，讲稿共一百二十五页哦第七十二页，讲稿共一百二十五页哦nLife cycle:lytic cycle(裂解周期）裂解周期）lysogenic cycle（溶源周期）（溶源周期）第七十三页，讲稿共一百二十五页哦第七十四页，讲稿共一百二十五页哦1.噬菌体的基本特点噬菌体的基本特点n3）.噬菌斑噬菌斑nA.噬菌体悬浮液加到大肠杆菌，和琼脂糖固体培养基，37C 过夜。nB.固体平板培养基出现透明斑点（噬菌斑）.噬菌斑是经过若干裂解周期形成宿主菌死亡区域。同体培养基限制，透明圈外围大肠杆菌仍能生长.n4）.一个噬菌斑中有上百万个噬菌体颗粒一个噬菌斑中有上百万个噬菌体颗粒，均由一个噬菌体无

26、性繁殖所产生的，是入-噬菌体DNA 用于分子克隆的基本原理。第七十五页，讲稿共一百二十五页哦第七十六页，讲稿共一百二十五页哦 5）.噬菌体的基因组噬菌体的基因组 48514bp，线状双链，线状双链DNA 线状分子两端具有线状分子两端具有12n.t的的5-端突起的可互补端突起的可互补的粘性末端（的粘性末端（cohensive end，cos），该末端称），该末端称为为cos位点，可被位点，可被编码的编码的A蛋白所识别蛋白所识别 当当侵入宿主细胞后，线装侵入宿主细胞后，线装DNA分子借助粘性末端分子借助粘性末端连接成环状分子连接成环状分子 第七十七页，讲稿共一百二十五页哦DNAcos位点位点 co

27、s位点位点 第七十八页，讲稿共一百二十五页哦第七十九页，讲稿共一百二十五页哦2.DNA作载体的优缺点和解决办法作载体的优缺点和解决办法n优点：优点：DNA进入细菌细胞容易进入细菌细胞容易 由由于于能能裂裂解解宿宿主主细细胞胞，因因此此提提取取DNA或基因表达产物都比较容易或基因表达产物都比较容易 用用噬噬菌菌体体颗颗粒粒包包装装的的DNA易易于于长长期期保存保存 第八十页，讲稿共一百二十五页哦n缺点及解决措施缺点及解决措施：头部只能容纳自身头部只能容纳自身DNA的的78-105%，即，即3851 Kb，天然，天然仅可插入仅可插入2.5Kb外源外源DNA片段片段除去除去所有与所有与裂解无关的基因

28、和空白区裂解无关的基因和空白区同一种限制酶有多个识别位点，不利于外源同一种限制酶有多个识别位点，不利于外源DNA插插入入体内突变和建立新的克隆位点体内突变和建立新的克隆位点 重组的重组的DNA分子难于直接导入宿主细胞分子难于直接导入宿主细胞利用利用体外包装成病毒颗粒，然后通过感染的方法注入体外包装成病毒颗粒，然后通过感染的方法注入DNA 第八十一页，讲稿共一百二十五页哦3.载体载体DNA 基因结构基因结构 B2区区和和重组基因区重组基因区是是噬菌体进入裂解周期的非必噬菌体进入裂解周期的非必需区（需区（15kb），可将该区缺失或用外源），可将该区缺失或用外源DNA片段片段取代，对噬菌体的感染和生

29、长都不会造成影响取代，对噬菌体的感染和生长都不会造成影响第八十二页，讲稿共一百二十五页哦 LA 19.9 LacZ RA 21.9 LA Lac Bio RA Charon 16ACharon 4A EcoRIEcoRIEcoRIXbaIInsertion vector 插入型载体插入型载体Replacement or substitution vector 取代型载体取代型载体第八十三页，讲稿共一百二十五页哦第八十四页，讲稿共一百二十五页哦第八十五页，讲稿共一百二十五页哦第八十六页，讲稿共一百二十五页哦第八十七页，讲稿共一百二十五页哦第八十八页，讲稿共一百二十五页哦 vectors can

30、carry DNA fragments up to 15kb第八十九页，讲稿共一百二十五页哦n1.关于噬菌体，下列描述有误的是（）n A.既能高效感染大肠杆菌，又能高效感染枯草杆菌n B.在成熟的噬菌体颗粒中，其DNA呈双链环状分子n C.改造成载体后，可携带较长的外源DNA片段n D.重组的噬菌体易于筛选和储存n2.限制性内切核酸酶EcoR I在野生型的噬菌体DNA中有5个切点，Hind III有7个切点，BamH I有5个切点。调整这些酶切位点的数量，主要通过（）n A.体内突变n B.完全酶切后连接n C.部分酶切n D.先用甲基化酶修饰后再酶切第九十页，讲稿共一百二十五页哦三、三、co

31、s 质粒质粒（cosmid）n载体的容量理论上为载体的容量理论上为23kb，实际有效，实际有效克隆大小为克隆大小为15kb，可满足一般的基因克，可满足一般的基因克隆需要。但有的真核生物基因很大，可隆需要。但有的真核生物基因很大，可达达3540kb甚至更大甚至更大 第九十一页，讲稿共一百二十五页哦 Cosmid was constructed by inserting the cos sequence of,which is necessary for packing phage DNA into phage protein coats,into a plasmid vector 在普通质粒载体

32、中插入一个或两个来自在普通质粒载体中插入一个或两个来自的的cos位点位点DNA片段（长约片段（长约200 bp）第九十二页，讲稿共一百二十五页哦第九十三页，讲稿共一百二十五页哦第九十四页，讲稿共一百二十五页哦第九十五页，讲稿共一百二十五页哦第九十六页，讲稿共一百二十五页哦nCos质粒载体的优点质粒载体的优点：容量大（可达容量大（可达45 kb），用于基因簇的克隆），用于基因簇的克隆具有具有噬菌体的特性，形成的重组噬菌体的特性，形成的重组DNA分子可分子可进行体外包装，并能感染进行体外包装，并能感染E.coli细胞（在细胞细胞（在细胞内不能形成子代噬菌体颗粒，因而不能形成噬内不能形成子代噬菌体颗

33、粒，因而不能形成噬菌斑）菌斑）具有质粒的特性，操作简便具有质粒的特性，操作简便 对重组对重组DNA分子长度具有选择性包装（分子长度具有选择性包装（3045kb）第九十七页，讲稿共一百二十五页哦 Cosmids can carry up to 45kb of insert DNA第九十八页，讲稿共一百二十五页哦问题：n1.cosmid是一种人工构建的载体（）n A.它具有cos位点，因而可进行体外包装 n B.它具有质粒DNA的复制特征 n C.进入受体细胞后，可引起裂解反应 n D.进入受体细胞后，可引起溶原化反应n2.cosmid质粒中，cos位点的功能是（）n A.复制起点 n B.限制酶

34、切位点n C.参与包装进入病毒外壳n D.选择标记 n E.用于筛选重组子第九十九页，讲稿共一百二十五页哦四、细菌人工染色体四、细菌人工染色体Bacterial artificial chromosome(BAC)Derived from F plasmid,can carry inserts of about 300kb第一百页，讲稿共一百二十五页哦第一百零一页，讲稿共一百二十五页哦问题：n1.下面关于细菌人工染色体（BAC）的特征描述，除了（）外都是正确的。n A.通过电激法将大质粒转化到大肠杆菌比酵母的转化率高了10-100倍 n B.BAC载体在细菌中以环状超螺旋状态存在，使分离操作起

35、来相对容易 n C.BAC载体在大肠杆菌宿主保持高拷贝n D.克隆到BAC载体上的外源片段可以直接进行测序以获得末端序列第一百零二页，讲稿共一百二十五页哦第三节 用于真核细胞的克隆载体用于真核细胞的克隆载体 Yeast Artificial Chromosome(YAC)酵母人工染色体酵母人工染色体 Carry 12 Mb DNA 1Mb=1,000,000 bp 第一百零三页，讲稿共一百二十五页哦YAC载体的特点：载体的特点：两个两个TEL位点，一个位点，一个CEN，一个，一个ARS（自主复（自主复制序列）制序列）三个酵母菌遗传标记基因三个酵母菌遗传标记基因 克隆片段大小约克隆片段大小约1M

36、bYAc载体缺点载体缺点：易出现嵌合体，某些克隆不稳定：易出现嵌合体，某些克隆不稳定 第一百零四页，讲稿共一百二十五页哦第一百零五页，讲稿共一百二十五页哦第一百零六页，讲稿共一百二十五页哦第一百零七页，讲稿共一百二十五页哦Some possible vectors for plant and animal cellsCell typeVector typeGenomeExamplesPlant cellsPlasmidViralDNADNARNATi plasmid for A.tumefaciensCaMV,GeminivirusesTMVAnimalsPlasmidViralTranspo

37、sonDNADNARNADNAVarious types,many contain SV40 genomeBaculovirusesSV40,et alRetrovirusesP elements in Drosophila第一百零八页，讲稿共一百二十五页哦Summary第一百零九页，讲稿共一百二十五页哦n1.下列哪种克隆载体对外源DNA的容载量最大（）nA.质粒 nB.cosmid 质粒 nC.酵母人工染色体 nD.噬菌体 nE.cDNA表达载体n2.能够用来克隆32Kb以下大小的外源片段的质粒载体是（）nA.charomid nB.plasmid nC.cosmid nD.phagemid

38、问题第一百一十页，讲稿共一百二十五页哦第四节第四节 宿主系统宿主系统n用于基因转移的受体菌或细胞n 受体细胞应具备的条件n 各种基因工程受体的特性n 实验室常用的基因工程受体第一百一十一页，讲稿共一百二十五页哦受体细胞应具备的条件n限制性缺陷型n 外切酶和内切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-）n重组整合缺陷型n 用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-）n具有较高的转化效率n具有与载体选择标记互补的表型n感染寄生缺陷型n 防止重组细菌扩散污染，生物武器除第一百一十二页，讲稿共一百二十五页哦各种基因工程受体的特性n大肠杆菌n遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重

39、组子n产结构复杂、种类繁多的内毒素n适用于外源DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的构建，是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌第一百一十三页，讲稿共一百二十五页哦各种基因工程受体的特性n枯草杆菌n遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全，生长迅速，培养简单，不产内毒素n遗传欠稳定，载体受体系统欠完备n适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌第一百一十四页，讲稿共一百二十五页哦各种基因工程受体的特性n链霉菌n抗生素的主要生产者，分子遗传相对操作简便，不产内毒素n主要用于抗生素生产菌株的改良n遗传不稳定，生长相对缓慢第一百一十五页，讲稿共一百二十五页哦各种基因工程受体的特

40、性n酵母菌n具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定n内源性蛋白产物种类繁多且含量高n适用于外源DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是DNA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌第一百一十六页，讲稿共一百二十五页哦各种基因工程受体的特性n昆虫细胞（家蚕）n具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较快，培养成本低廉，遗传稳定nDNA重组操作系统欠完善n适用于真核生物基因的高效表达第一百一十七页，讲稿共一百二十五页哦各种基因工程受体的特性n哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞CHO）n与人的亲缘关系近，

41、分子重组表达系统健全，具有合适的糖基化修饰系统n细胞培养条件苛刻，生长缓慢n适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产，是DNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体第一百一十八页，讲稿共一百二十五页哦各种基因工程受体的特性n植物细胞（拟南芥菜、烟叶）n农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细胞培养简单且成本低廉，具有光合作用n遗传操作繁琐n适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产，农作物品质的改良第一百一十九页，讲稿共一百二十五页哦Types of host cell used for gentic engineeringMajor groupTypeExample

42、sBacteriaProkaryoticGram+GramE.coliB.subtilisFungiEukaryoticMicrobialFilamentousS.cerevisiaeA.nidulansPlants EukaryoticProtoplastsIntact cellsWhole organismVarious typesVarious typesVarious typesAnimalsEukaryoticInsect cellsMammalian cellsOocytesWhole organismVarious typesVarious typesVarious types第

43、一百二十页，讲稿共一百二十五页哦nThe type of host cell used for a particular application will depend mainly on the purpose of the cloning experimentnOften a simple primary host is used to isolate a sequence that is then introduced into a more complex system for expression.第一百二十一页，讲稿共一百二十五页哦1.Prokaryotic hostsnE.col

44、inBacillus（芽孢杆菌）nStreptomyces（链霉菌）nPseudomonas（假单孢菌）-Shuttle vector（穿梭载体）（穿梭载体）第一百二十二页，讲稿共一百二十五页哦2.Eukaryotic hostsnSaccharomyces serevisiae（酿酒酵母）nPlantsnAnimals第一百二十三页，讲稿共一百二十五页哦 作作 业业n当一当一DNADNA片段插入片段插入pUC18pUC18后，在后，在X-galX-gal平板上出现两类菌平板上出现两类菌落，兰色菌落和白色菌落。从白色菌落中分离纯化的质落，兰色菌落和白色菌落。从白色菌落中分离纯化的质粒经电泳检查，均比原载体粒经电泳检查，均比原载体DNADNA分子大；但从兰色菌落分子大；但从兰色菌落随机分离的质粒随机分离的质粒DNADNA却有两类，其中一类与载体大小相同，却有两类，其中一类与载体大小相同，另一类却与白色菌落中分离的质粒大小相同。如何解释这另一类却与白色菌落中分离的质粒大小相同。如何解释这一实验结果一实验结果?可设计何种实验证明你的解释是正确的可设计何种实验证明你的解释是正确的?第一百二十四页，讲稿共一百二十五页哦感感谢谢大大家家观观看看9/26/2022第一百二十五页，讲稿共一百二十五页哦