动物细胞工程 (2)讲稿.ppt
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1、关于动物细胞工程(2)第一页,讲稿共一百一十一页哦内容介绍内容介绍一般概述一般概述相关概念相关概念细胞培养准备与操作要点细胞培养准备与操作要点(灭菌、营养、保存)(灭菌、营养、保存)动物细胞培养方法动物细胞培养方法动物细胞工程应用动物细胞工程应用2第二页,讲稿共一百一十一页哦第一节第一节 概述概述 动物细胞工程是以动物细胞工程是以动物细胞培养技术动物细胞培养技术为为主要手段,对动物细胞在离体条件下的细胞主要手段,对动物细胞在离体条件下的细胞形态、结构、生理功能进行研究,在此基础形态、结构、生理功能进行研究,在此基础上,采用工程技术手段对细胞的遗传或生理上,采用工程技术手段对细胞的遗传或生理特性
2、进行改造,以获得有价值的细胞产物、特性进行改造,以获得有价值的细胞产物、器官或个体的生物技术。器官或个体的生物技术。3第三页,讲稿共一百一十一页哦动物细胞工程主要包括:动物细胞工程主要包括:动物细胞培养动物细胞培养细胞杂交(融合)技术细胞杂交(融合)技术胚胎培养胚胎培养细胞核移植细胞核移植干细胞培养干细胞培养等。等。4第四页,讲稿共一百一十一页哦一、体外培养技术的产生与发展一、体外培养技术的产生与发展 1919世纪后期,胚胎学的发展极为迅世纪后期,胚胎学的发展极为迅速,人们在研究胚胎学时,将一些活速,人们在研究胚胎学时,将一些活的组织放在体外进行观察,从而拉开的组织放在体外进行观察,从而拉开了
3、培养技术的序幕。了培养技术的序幕。5 5第五页,讲稿共一百一十一页哦1.早期组织培养早期组织培养1859年,法国解剖学家年,法国解剖学家Vulpain将将蛙尾组织蛙尾组织在水中培养,在水中培养,观察到了生长与分化现象。观察到了生长与分化现象。1885年,德国人年,德国人Roux用温用温生理盐水在体外培养鸡胚组生理盐水在体外培养鸡胚组织织并使之存活了数天,被认为是组织培养的萌芽。他并使之存活了数天,被认为是组织培养的萌芽。他首次提出了组织培养的概念首次提出了组织培养的概念。1897年,年,Loeb首次在含有首次在含有血凝块血凝块的试管中培养兔的的试管中培养兔的甲状腺、卵巢、肾脏等,发现这些器官在
4、甲状腺、卵巢、肾脏等,发现这些器官在3天内仍保持天内仍保持正常的组织学结构。他的工作被认为是正常的组织学结构。他的工作被认为是器官培养的最早器官培养的最早尝试尝试。6第六页,讲稿共一百一十一页哦2.2.基本培养技术的建立基本培养技术的建立1907年,实验胚胎学家年,实验胚胎学家Harrison(哈里森)为了研究(哈里森)为了研究神经突起的起源问题而进行了一项著名的实验:在无神经突起的起源问题而进行了一项著名的实验:在无菌条件下将菌条件下将蛙胚神经组织蛙胚神经组织接种在蛙的淋巴液中,放在接种在蛙的淋巴液中,放在一快盖玻片上,然后将盖玻片翻转并密封在一张凹玻一快盖玻片上,然后将盖玻片翻转并密封在一
5、张凹玻片上,因而创建了片上,因而创建了盖片悬滴培养法盖片悬滴培养法。Harrison采用该方法将神经组织培养了数周,并观察采用该方法将神经组织培养了数周,并观察到神经突起的生长。这项工作到神经突起的生长。这项工作标志着体外培养技术的标志着体外培养技术的创立创立。7第七页,讲稿共一百一十一页哦1912年,外科医生外科医生Carrel(卡勒尔)将外科手(卡勒尔)将外科手术的术的无菌操作观念无菌操作观念带入体外培养技术,并连续培带入体外培养技术,并连续培养鸡胚心肌组织长达数年。养鸡胚心肌组织长达数年。无菌观念已经成为体无菌观念已经成为体外培养的最重要理念外培养的最重要理念。Carrel的第二个重要贡
6、献是将组织包埋技术、的第二个重要贡献是将组织包埋技术、营养供应和细胞传代技术引入体外培养实验,使营养供应和细胞传代技术引入体外培养实验,使Harrison的的盖片悬滴培养法盖片悬滴培养法更加完善。更加完善。1923年,年,Carrel又设计出又设计出卡氏瓶培养法卡氏瓶培养法,进一,进一步扩大了组织的培养空间,卡氏瓶已成为体外培步扩大了组织的培养空间,卡氏瓶已成为体外培养的重要器皿。养的重要器皿。8第八页,讲稿共一百一十一页哦1925年,年,Maximow又把又把Harrison的悬滴培养的悬滴培养法改良为法改良为双盖片培养双盖片培养,因而极大地方便了培养因而极大地方便了培养液的更换,大大降低了
7、污染的机会。液的更换,大大降低了污染的机会。双盖片双盖片培养培养在体外培养的历史上发挥了重要作用,在体外培养的历史上发挥了重要作用,至今仍有不少学者采用这种方法。至今仍有不少学者采用这种方法。1926年,年,Strangewags设计了设计了试管培养法试管培养法,并改良了器官培养的营养供应方式,开始并改良了器官培养的营养供应方式,开始以以血浆和胚胎提取液混合物代替单纯的血凝块血浆和胚胎提取液混合物代替单纯的血凝块。9第九页,讲稿共一百一十一页哦1933年,年,Go Gey创立了创立了旋转管培养法旋转管培养法,并,并以此建立了许多细胞系。如来源于人的肿瘤以此建立了许多细胞系。如来源于人的肿瘤组织
8、的组织的Hela细胞系细胞系。1949年,年,Polge等人发现等人发现甘油甘油能够用于保护能够用于保护低温下储藏的细胞。同年,低温下储藏的细胞。同年,Hanks等提出了等提出了Hanks平衡盐溶液平衡盐溶液。10第十页,讲稿共一百一十一页哦3.3.体外培养技术的发展体外培养技术的发展l1950年,年,J F Morgan等人提出了等人提出了199培培养基养基。l1951年年Pomerat设计出设计出灌流小室灌流小室,实现,实现了培养液的不断更新了培养液的不断更新;l1954年,年,Earle等建立了等建立了悬浮培养法悬浮培养法。11第十一页,讲稿共一百一十一页哦1957年,年,Dulbecc
9、o采用采用胰蛋白酶消化法胰蛋白酶消化法分分离细胞,创造了离细胞,创造了单层细胞培养法单层细胞培养法,以后的学,以后的学者采用该方法建立了许多细胞系(者采用该方法建立了许多细胞系(cell line)。)。1959年,年,Lovelock等人发现了一种新的等人发现了一种新的化学化学冷冻保护剂冷冻保护剂二甲基亚砜二甲基亚砜(DMSO)1960年,年,Baski观察到两种不同细胞混合培观察到两种不同细胞混合培养所产生的细胞自发养所产生的细胞自发融合现象融合现象。12第十二页,讲稿共一百一十一页哦二、动物细胞的体二、动物细胞的体外培养生长特性外培养生长特性13第十三页,讲稿共一百一十一页哦 除单细胞原
10、生动物外,细胞培养过程具有以下特性;l 细胞生长缓慢细胞生长缓慢,分裂周期长,一般12-48小时,而且易受环境因素的影响;如CHO(中国仓鼠卵巢癌细胞)12.5小时,人胚肺成纤维细胞21小时;易受微生物污染,培养时需用抗生素培养时需用抗生素;l 动物细胞较微生物大得多,无细胞壁,机械强度低,适应环境能力差适应环境能力差;l 培养过程需氧量少需氧量少,对搅拌搅拌或剪切力敏感;1.动物细胞培养特性动物细胞培养特性14第十四页,讲稿共一百一十一页哦 在培养中,细胞相互粘连以在培养中,细胞相互粘连以集群形式集群形式存在,存在,培养过程具有群体效应、锚地依赖性、功能培养过程具有群体效应、锚地依赖性、功能
11、全能性及全能性及接触抑制性接触抑制性(有(有接触抑制现象接触抑制现象,即,即细胞在培养器皿表面生长到一定程度,相互细胞在培养器皿表面生长到一定程度,相互紧密接触时,细胞停止生长紧密接触时,细胞停止生长):):对环境因素非常敏感对环境因素非常敏感。培养器皿的特性、培。培养器皿的特性、培养液的温度、养液的温度、pH值、溶氧浓度、营养成分及值、溶氧浓度、营养成分及含量等均影响到细胞生长与分裂含量等均影响到细胞生长与分裂 原代培养细胞一般繁殖原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡。代即退化死亡。15第十五页,讲稿共一百一十一页哦2 2、体外培养细胞生长方式、体外培养细胞生长方式 在活体内在活体内,细胞的
12、形态与其功能密切相,细胞的形态与其功能密切相关。如肌细胞呈纤维状,便于收缩;神经细关。如肌细胞呈纤维状,便于收缩;神经细胞发出许多分支,便于形成网络;红细胞呈胞发出许多分支,便于形成网络;红细胞呈圆盘状,便于气体交换;上皮细胞呈不规则圆盘状,便于气体交换;上皮细胞呈不规则状,便于覆盖在器官表面相互挤压。状,便于覆盖在器官表面相互挤压。16第十六页,讲稿共一百一十一页哦在离体条件下,细胞一般表现为三种形态:在离体条件下,细胞一般表现为三种形态:(1 1)贴壁依赖型(贴壁依赖型(anchorage-dependent)anchorage-dependent)细细胞胞;(2 2)非贴壁依赖型(非贴壁
13、依赖型(anchorage-anchorage-independent)independent)细胞细胞:也称为:也称为悬浮型细胞悬浮型细胞,包,包括来源于血液的细胞和许多括来源于血液的细胞和许多肿瘤细胞。肿瘤细胞。(3 3)兼性贴壁细胞兼性贴壁细胞:主要是一些细胞系,如:主要是一些细胞系,如CHOCHO细胞。细胞。17第十七页,讲稿共一百一十一页哦贴壁依赖型细胞包括贴壁依赖型细胞包括:(:(P87P87)1)成成纤纤维维细细胞胞:细细胞胞贴贴壁壁后后呈呈梭梭形形,细细胞胞中中央央有有圆圆形形的的核核,胞胞质质向向外外伸伸出出2-32-3个个长长短短不不一一的的突突起起,生生长长时时细细胞胞群
14、群呈呈放放射射状状。成成纤维细胞、肌细胞、成骨胳细胞均具有这种特点;纤维细胞、肌细胞、成骨胳细胞均具有这种特点;2)上上皮皮型型细细胞胞:细细胞胞贴贴壁壁后后呈呈不不规规则则三三角角形形或或柳柳叶叶形形,细细胞胞中中央央有有圆圆形形的的核核,生生长长时时细细胞胞紧紧密密连连接接,长长成成单单层层片片状状。如如皮皮肤肤表表皮皮细细胞胞、肝肝细细胞胞、肺肺上上皮皮细细胞胞消消化化管管外外皮皮细细胞胞,肝肝脏脏上上皮皮细细胞胞等等等等均均具具有这种特点;有这种特点;3)游游走走型型细细胞胞:如如神神经经胶胶质质细细胞胞,分分散散生生长长,位位置置不不固固定定,外外形形不不规则等;规则等;4)多形型细
15、胞多形型细胞:不常见,形态不规则,如神经组织细胞。不常见,形态不规则,如神经组织细胞。第十八页,讲稿共一百一十一页哦贴壁生长细胞的生长过程:贴壁生长细胞的生长过程:u游离期:细胞变圆游离期:细胞变圆u吸附期:因细胞不同而有差异吸附期:因细胞不同而有差异u潜伏期:细胞不分裂潜伏期:细胞不分裂u繁殖期:细胞分裂增值繁殖期:细胞分裂增值u停止、退化期:营养耗尽,产物积累,停止、退化期:营养耗尽,产物积累,细胞停止分裂并开始退化细胞停止分裂并开始退化19第十九页,讲稿共一百一十一页哦l细胞接种后在培养液中呈悬浮细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态,状态,也称悬浮期。此时细胞质回缩,胞体也称悬浮期。此时细胞
16、质回缩,胞体呈圆球形。呈圆球形。l10分钟一分钟一4小时小时游离期:游离期:吸附期:吸附期:l细胞附着于底物上,游离期细胞附着于底物上,游离期 结束。细胞株结束。细胞株平均在平均在10分钟一分钟一4小时贴壁。小时贴壁。l 底物:胶原、玻璃、塑料、其它细胞等底物:胶原、玻璃、塑料、其它细胞等20第二十页,讲稿共一百一十一页哦 血清中有促使细胞贴壁的血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白(生长基质),素、胶原等糖蛋白(生长基质),这些带正电荷这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上,悬浮的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上,悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。细
17、胞再与吸附有促贴壁因子的附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质(化学合成的进口塑料培养瓶涂有生长基质(化学合成的功能基团)功能基团)为何会贴壁?为何会贴壁?21第二十一页,讲稿共一百一十一页哦细胞贴壁的过程:细胞贴壁的过程:22第二十二页,讲稿共一百一十一页哦l对数生长繁殖期:对数生长繁殖期:细胞数随时间变化成倍增长,呈细胞数随时间变化成倍增长,呈对数生长对数生长状态,状态,活力最佳,最适合进行实验研究。活力最佳,最适合进行实验研究。l潜伏期潜伏期 此时细胞有生长活动,而无细胞分裂。细胞此时细胞有生长活动,而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为株潜伏期一般为624小时。小时。23第二十三页,讲稿共一百一十
18、一页哦v对数生长期是细胞活力最好的时期,在接种细对数生长期是细胞活力最好的时期,在接种细胞数量适宜情况下,指数生长期持续胞数量适宜情况下,指数生长期持续3-5d后,后,随细胞数量不断增多,生长空间日趋减少,细随细胞数量不断增多,生长空间日趋减少,细胞相互接触汇合成片,呈现胞相互接触汇合成片,呈现接触抑制接触抑制(Contact inhibition)。)。而恶性细胞则无而恶性细胞则无接触抑制现象,因此接触抑制可作为区分正常接触抑制现象,因此接触抑制可作为区分正常与癌细胞标志之一。与癌细胞标志之一。v癌细胞则由于营养成分的消耗和细胞代谢产物癌细胞则由于营养成分的消耗和细胞代谢产物的影响而发生的影
19、响而发生密度抑制密度抑制(Density inhibition)24第二十四页,讲稿共一百一十一页哦l停止期(平台期)停止期(平台期):细胞长满瓶壁后,细胞虽有活力但不再分裂细胞长满瓶壁后,细胞虽有活力但不再分裂 机制:接触抑制、密度依赖性。机制:接触抑制、密度依赖性。l退化期退化期:代谢产物积累,代谢产物积累,PH下降,细胞中毒受损,大量下降,细胞中毒受损,大量细胞出现死亡。细胞出现死亡。25第二十五页,讲稿共一百一十一页哦26第二十六页,讲稿共一百一十一页哦容易更换培养基;容易更换培养基;可采用灌注培养;可采用灌注培养;方便产物表达;方便产物表达;方便调节培养液与细胞的比例;方便调节培养液
20、与细胞的比例;易于观察等。易于观察等。细胞贴壁生长优点细胞贴壁生长优点(P104):27第二十七页,讲稿共一百一十一页哦3、体外培养细胞的生长与增殖1)、潜伏期()、潜伏期(Latent phase)2)、指数生长期、指数生长期(Logarthmic growth phase)3)、停滞期)、停滞期(Stagnate phase)4)、死亡期)、死亡期28第二十八页,讲稿共一百一十一页哦胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健肽健,除去细胞间,除去细胞间粘蛋白及糖蛋白粘蛋白及糖蛋白,影响细,影响细胞骨架,从而使细胞分离胞骨架,从而使细胞分离。胰蛋白酶液浓
21、度越高,作用越强,但超过一定限度会损伤细胞。胰蛋白酶是一种黄白色粉末,用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25,用滤器过滤除菌。胰蛋白酶液消化时间:2-10分钟。用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 胰蛋白酶消化液胰蛋白酶消化液29第二十九页,讲稿共一百一十一页哦第二节第二节 常见概念常见概念30第三十页,讲稿共一百一十一页哦一、原代培养与传(继)代培养一、原代培养与传(继)代培养1 1、原代培养(、原代培养(primary culture):primary culture):将组织将组织取出来后,先用胰蛋白酶等使组织分散取出来后,先用胰蛋白酶等使组织分散成单个细
22、胞,然后配制成一定浓度的细成单个细胞,然后配制成一定浓度的细胞悬浮液,再将该悬浮液放入培养瓶中,胞悬浮液,再将该悬浮液放入培养瓶中,在培养箱中培养,这个过程称为在培养箱中培养,这个过程称为原代培原代培养养 。31第三十一页,讲稿共一百一十一页哦2 2、传(继)代培养(、传(继)代培养(secondary culture,secondary culture,passage,split):passage,split):细胞在培养瓶中贴壁生长。细胞在培养瓶中贴壁生长。随着细胞的生长和增殖,培养瓶中的细胞越来随着细胞的生长和增殖,培养瓶中的细胞越来越多,需要定期地用胰蛋白酶使细胞从瓶壁上越多,需要定期
23、地用胰蛋白酶使细胞从瓶壁上脱离下来,配制成细胞悬浮液,分装到两个或脱离下来,配制成细胞悬浮液,分装到两个或两个以上的培养瓶中培养,这称为两个以上的培养瓶中培养,这称为传代培养传代培养。32第三十二页,讲稿共一百一十一页哦小细节问题小细节问题 v当细胞生长达到一定密度后,都需要做传代处理,当细胞生长达到一定密度后,都需要做传代处理,传代的频率传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的数或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖速度有关。量和细胞增殖速度有关。v所谓细胞所谓细胞“一代一代”,即从细胞接种到分离再培养,即从细胞接种到分离再培养的一段时间。如某一细胞系为的一段时间。如某一细胞系为5
24、0代即该细胞已传代代即该细胞已传代50次。次。第三十三页,讲稿共一百一十一页哦二、细胞二、细胞株株与细胞系与细胞系1、细胞株(、细胞株(cell strain):原代培养的细胞原代培养的细胞一般传至一般传至10代左右就不容易传下去了,代左右就不容易传下去了,细胞的生长就会出现停滞,大部分细胞细胞的生长就会出现停滞,大部分细胞衰老死亡。但是有极少数的细胞能够度衰老死亡。但是有极少数的细胞能够度过过“危机危机”而继续传下去,这些存活的而继续传下去,这些存活的细胞一般能够传到细胞一般能够传到4050代,这种传代代,这种传代细胞叫做细胞叫做细胞株细胞株。细胞株细胞的遗传物。细胞株细胞的遗传物质没有发生
25、改变。质没有发生改变。34第三十四页,讲稿共一百一十一页哦2、细胞系、细胞系(cell line):当细胞株传至当细胞株传至50代以代以后又会出现后又会出现“危机危机”,不能再传下去。但,不能再传下去。但是有部分细胞的遗传物质发生了改变,并是有部分细胞的遗传物质发生了改变,并且带有癌变的特点,有可能在培养条件下且带有癌变的特点,有可能在培养条件下无限制地传代下去,这种传代细胞称为无限制地传代下去,这种传代细胞称为细细胞系胞系。35第三十五页,讲稿共一百一十一页哦三、有限细胞系与无限细胞系三、有限细胞系与无限细胞系1 1、有限细胞系、有限细胞系(finite cell linefinite ce
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