多肽合成入门课件.ppt

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1、关于多肽合成入门现在学习的是第1页，共38页多肽合成简介n多肽简介 n多肽合成原理n氨基保护n羧基保护n侧链功能团的保护n肽键生成的方法现在学习的是第2页，共38页多肽简介n蛋白质的基本结构单位是氨基酸，由20种氨基酸组成的各种各样的蛋白质。n每个氨基酸分子（脯氨酸除外）alpha碳原子上都结合一个-NH2、一个-COOH、一个氢原子，和一个各不相同的-R 现在学习的是第3页，共38页20种构成蛋白质的氨基酸现在学习的是第4页，共38页多肽简介n肽键是蛋白质分子中氨基酸间的主要连接方式，是一个alpha-NH2和一个alpha-COOH脱水缩合而成的酰胺键。一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-

2、氨基之间失去一分子水相互连接而成的化合物称为肽（peptide），由2 个氨基酸缩合形成的肽叫二肽，由3 个氨基酸缩合形成的肽叫三肽，少于10 个氨基酸的肽称为寡肽，由10个以上氨基酸形成的肽叫多肽，因此蛋白质的结构就是多肽链结构。每个肽在其一端有一自由氨基，称为氨基端或N-末端，在另一端有一自由羧基，称为羧基端或C-末端。现在学习的是第5页，共38页n多肽简介 n多肽合成原理n氨基保护n羧基保护n侧链功能团的保护n肽键生成的方法现在学习的是第6页，共38页多肽合成原理n化学合成多肽就把氨基酸按照一定的氨基酸排列顺序和连接方式连接起来。n为了得到具有特定氨基酸顺序的合成多肽，采用逐步缩合的定向

3、合成方法，即先将不需要反应的氨基或羧基用适当的基团保护起来，再进行连接反应，以保证反应的定向进行。现在学习的是第7页，共38页多肽合成原理n对于长肽合成，一般有逐步增长和片段缩合两种方式，前者由起始氨基酸（或肽）开始，每连接一次增长一个氨基酸，后者由C保护肽同N保护肽缩合来得到两者长度相加的新肽链。现在学习的是第8页，共38页n多肽简介 n多肽合成原理n氨基保护n羧基保护n侧链功能团的保护n肽键生成的方法现在学习的是第9页，共38页氨基保护n氨基保护常用的保护基分为烷氧羰基、酰基，和烷基三大类。因为N烷氧羰基的保护的氨基酸在接肽时不易发生消旋化，故烷氧羰基使用最多现在学习的是第10页，共38页

4、氨基保护现在学习的是第11页，共38页n多肽简介 n多肽合成原理n氨基保护n羧基保护n侧链功能团的保护n肽键生成的方法现在学习的是第12页，共38页羧基保护n目前使用的羧基保护大致可以分为三种n一种可以用碱皂化脱去，如甲酯、乙酯n另一种可以用酸脱去，如叔丁酯、对甲氧苄酯，邻苯二甲酰亚胺甲酯等n第三种除了用酸或碱脱去外，还可以用其他的方法选择性脱去，如苄酯、苯羰基甲酯、三甲硅乙酯现在学习的是第13页，共38页羧基保护现在学习的是第14页，共38页n多肽简介 n多肽合成原理n氨基保护n羧基保护n侧链功能团的保护n肽键生成的方法现在学习的是第15页，共38页侧链功能团的保护n由于不少氨基酸的侧链都带

5、有能反应的基团，如羟基、巯基、酚基、B-和r-羧基、胍基、咪唑基、吲哚基和硫醚基等，为了避免副反应的发生，在多肽合成中往往也选用适当的保护基将它们保护起来现在学习的是第16页，共38页20种构成蛋白质的氨基酸现在学习的是第17页，共38页侧链功能团的保护n例 半胱氨酸的S-苄基(S-Bzl)保护 胱氨酸经Na/NH3还原后的溶液同氯化苄反应以及半胱氨酸盐酸盐在碱性溶液中剧烈搅拌下同溴化苄反应都可以导入S-Bzl基得到S-苄基半胱氨酸。S-苄基对酸和碱都比较稳定，它可经得起TFA、HBr/HOAc、HCl/CH3OH等酸处理和碱皂化及肼解等处理，只能用Na/NH3还原、HF(20，30分钟)、F

6、3CSO3H(40，30分钟)等处理脱去。现在学习的是第18页，共38页n多肽简介 n多肽合成原理n氨基保护n羧基保护n侧链功能团的保护n肽键生成的方法现在学习的是第19页，共38页肽键生成的方法n形成肽键的方法基本可以分为四类：一是羧基活化法；二是氨基活化法；三是四组份合成法；四是利用蛋白水解酶的逆反应，亦称酶促合成法。n羧基活化法的基本原理是先将N-保护氨基酸或肽的a-羧基转变成活化型的RCOX，从而有利于NH2R对它进行亲核反应生成RCONHR。一般来说，取代基团X的吸电子性越强，其对羧基的活化能力也越强。现在学习的是第20页，共38页肽键生成的方法n羧基取代基的活化能力顺序现在学习的是

7、第21页，共38页肽键生成的方法n羧基活化法有碳二亚胺法、混合酸酐法、活化酯法、NCA法等n1.碳二亚胺法现在学习的是第22页，共38页n2、混合酸酐法:反应一般分两部进行 副反应：现在学习的是第23页，共38页歧化反应和酸酐分解：现在学习的是第24页，共38页二酰胺的形成：现在学习的是第25页，共38页羧酸酯氨解生成酰胺的反应是胺对酯进行亲核取代，因此增加R基团的吸电子能力必将增加羰基碳原子的正电性而有利于氨解反应的进行3、活化酯法现在学习的是第26页，共38页n活化酯的种类：1）芳基活化酯 2）烯基酯 3）与N-羟基化合物形成的活化酯 4）活化酰胺 5）固相活化酯n活化酯的制备：1）DCC

8、法 2）转酯反应 3）加成 4）混合酸酐法现在学习的是第27页，共38页n4、NCA法优点：1）反应速度快，肽合成周期短 2）得到的氨基游离的肽可直接用于第2轮的肽合成 3）侧链可以较少的保护，除NCA的侧链需保护外，氨基组分只有Lys和Cys必须保护 4）反应有可能在水溶液中进行。现在学习的是第28页，共38页nNCA的合成：酰氯法、光气法现在学习的是第29页，共38页n例 ValAla的合成 0.89克L-Ala和1克Na2CO3用1N NaOH(10ml)和水(40ml)溶解，加入50ml乙腈，溶液分两层。将此两相溶液冷却到-10，在剧烈搅拌下于2小时内加入预先冷却到-20 含有1.57

9、克Val-NCA的乙腈溶液(15.7ml)，在-10 反应。反应结束后分去上相的乙腈溶液，水相在冷却下用50ml乙腈洗尽未反应的NCA。水溶液用浓硫酸中和，再加入100ml乙醇，滤去析出的Na2SO4结晶。滤液减压浓缩，加入50ml乙醇和50ml乙醚，得结晶。用水重结晶后得1.37克。现在学习的是第30页，共38页固相合成 固相合成的主要设计思想是：先将所要合成肽链的末端氨基酸的羧基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组分经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组分反应接长肽链。这样的步骤可以重复的多次进行下去，即缩合洗涤去保护中和和洗涤下一轮缩合，

10、最后达到所需要合成的肽链长度。现在学习的是第31页，共38页n固相合成流程示意：现在学习的是第32页，共38页n氨基酸在进入目的肽之前，氨基端需要保护基。根据保护基的不同，多肽固相合成方法可以分为两大类：Boc方法和Fmoc方法。现在学习的是第33页，共38页n例合成H2N-Gly-Gly-Gly-Cys-Ser-Asp-Tyr-Asn-His-His-Trp-Cys-COOH 1、树脂的选择及活化处理 取二氯树脂1.5 g 加入到用DCM 浸泡过的反应柱中,用DCM 15 mL 浸泡30 min 使树脂充分膨胀,以活化待用。2、第一个氨基酸的连接 称取Fmoc-Cys(Acm)-OH 0.3

11、1 g(依据为:树脂量取代度氨基酸分子量过量倍数)于DCM 中溶解,再加入DIEA 0.5 mL,混合加入反应容器中,吹N2 反应2 h,将反应液过滤除去加入MeOH 5 mL封闭反应1 h 后用DCM、异丙醇、DMF 各洗涤树脂3 次。3、脱除氨基保护基 加入约15 mL 20%哌啶的DMF 溶液反应5 min,滤掉,再加入15 mL 反应20 min 后用异丙醇洗涤树脂2 次、DMF 洗涤树脂3 次。4、肽键的形成 称取0.55 g Fmoc-Trp(boc)-OH,0.35 g TBTU 以DMF 溶解,与0.6 mL HOBt(2 mol/L),0.2 mL DIEA混合加入盛有树脂的

12、反应容器中,吹N2 反应2 h 后用异丙醇洗涤树脂2 次、DMF 洗涤树脂3 次。重复上述步骤(脱保护和接肽),按还未成环前的直链肽的序列由羧基端氨基端的顺序依次连接氨基酸。5、侧链脱保护及环肽脱离树脂 洗涤、脱除最后一个氨基酸的Fmoc 保护后用N2 将肽-树脂复合物吹干,加入50 mL 小烧瓶中,按10 mL/0.5 mL/0.25 mL/0.5 mL/0.75 g 的比例加入TFA/苯甲硫醚/巯基乙醇/水/苯酚配成的切割试剂。室温磁力搅拌反应3 h 后,过滤入冰乙醚中,置冰箱2 h,离心收集,沉淀用纯水溶解,再置冰箱冷冻,后将冻结的冰状物置真空冷冻干燥机,冻干至恒重即得粗肽。现在学习的是

13、第34页，共38页合成设计中的几点考虑 合成的目的主要是为了进一步验证所得到的结构是否正确或者进一步确定它的生物功能。n保护基的选择：1）首先确定用片段缩合的方式还是逐个接长的方式，在前者的情况下，除去C末端肽段的末端可以用与侧链羧基相同的保护基或不保护外，其他要作为羧基组分片段的末端羧基，应根据将来在片段缩合时所用的活化方法的不同来适当选用保护基 2）确定保护方式，大保护、中等或最小的保护方式 3）从整个反应过程的要求出发并根据各种保护基的稳定性和选择性之间的综合考虑来设计和选择保护基 4）脱保护基试剂和方法现在学习的是第35页，共38页D、L命名法n费歇尔(E.Fischer)投影式 该法是将与手性碳原子相连的四个不同基团(U,V,S,T)中的两个(U,V)处于水平面、朝向观察者；另两个(S,T)处于垂直方向、朝后，然后朝纸面投影。这样，在纸面上的横线上连接向前（水平方向）的基团；竖线连接向后（垂直方向）的基团。手性碳原子处于两条直线交叉点。现在学习的是第36页，共38页D、L命名法 费歇尔选择甘油醛作为标准，将主链竖向排列，氧化态高的碳原子放在上方，氧化态低的碳原子在下方，写出甘油醛的费歇尔投影式。并人为规定羟基在碳链右边者为右旋甘油醛，称为D型，在左边者为左旋甘油醛，称为L型。现在学习的是第37页，共38页感感谢谢大大家家观观看看现在学习的是第38页，共38页