浓香型白酒窖池发酵过程中酵母类微生物的分析.pdf

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1、四川大学硕士学位论文浓香型白酒窖池发酵过程中酵母类微生物的分析姓名：吴飞申请学位级别：硕士专业：微生物学指导教师：胡承20060501四川大学硕士学位论文浓香型白酒窖池发酵过程中酵母类微生物的分析微生物学专业(工业微生物)研究生：吴飞指导教师：胡承副教授白酒的生产以泥窖窖池为基础，窖池中的多种微生物，特别是栖息于酒醋中的微生物左右着酒的产量和品质。酵母菌同时起着发酵酒精和产生香味物质的作用，是窖池发酵三大菌群之一，它们在发酵过程中的消长情况值得关注。本研究分别选取全兴酒厂的一口窖池以及泸州老窖的两口窖池作为分析对象。分别从原料入窖到出窖蒸馏进行全程跟踪采样，采样方法如下：按发酵0 天(入窖)、

2、7 天、1 4 天、2 l 天、2 8 天、4 9 天、7 0 天(出窖)的时间点取样7 次；每次共计6 个空间区域，即窖池酒醅按纵向分上中下三层，每一层分中心区域和周边区域，同区域取3 点样混合均匀；7 次取样共获3 6 个样品(入窖和出窖样只有上中下3 个样品)。首先，采用传统的分离技术对每份样品进行平板计数，以便分析在各个窖池发酵过程中不同取样位置酵母菌数量的变化J 隋况；然后采用常规的鉴定方法对分离到的菌株进行鉴定，以探讨发酵过程中存在的优势菌群；最后，采用1 8 Sr D N A 序列分析方法，验证常规鉴定结果的准确性，并对各菌属进行系统发育分析。系统发育分析的流程如下：提取用常规方

3、法鉴定后各属代表菌株的基因组D N A，利用基因组D N A 为模扳扩增1 8 Sr D N A，并通过分子克隆等过程测定各属代表菌株1 8 Sr D N A 全序列，最后对测得的序列进行B l a s t 分析，并构建系统发育树。结果发现：从数量七看，泸州两个窖池的酵母菌数远远多于全兴的数最(泸州窖池的总菌数基本上比全兴高两个数量级)，而泸州两个窖池之间在总菌数上没有较大差异。这町能是由于泸州窖池与全兴窖池所在地的气候、水质、土质差异等原因造成的。5婴型盔兰堡兰竺丝苎从消长情况来看，全兴窖池中发酵到7 天左右就完成了酵母的增殖过程，总菌数达到了最高峰；在泸州窖池I 中，发酵到1 4 天和2

4、1 天左右酵母才增殖完毕；在泸州窖池I I 中一开始就接种了大量的菌种，整个发酵过程中酵母菌数从入窖到出窖完全是一个逐渐减少的过程。表明发酵工艺对微生物消长情况有较大的影响。从优势菌群来看，每个窖池都有4 6 个属的酵母优势菌群，但是各个窖池中分布的优势菌又有所差异。全兴窖池中以汉逊酵母(H a n s e n u a)、酒香酵母(B r e t t a n o m y c e s)、固囊酵母(C i t e r o m y c e s)、卵孢酵母(O o s p o r i d i u m)、德克酵母(D e k k e r a)和管囊酵母(P a c h y s o l e n)为主g 泸

5、州窖池I 中以德巴利酵母(D e b a r y o m y c e s)、假丝酵母(C a n d i d a)、毕赤酵母(尸j f c 如)和汉逊酵母(1 4 a n s e n u l a)为主，且德巴利酵母和假丝酵母在发酵的某些时段成为唯一的绝对优势菌：泸州窖池I I 中以德巴利酵母、假丝酵母、毕赤酵母、酵母属酵母(S a c c h a r o m y c e s)、伊萨酵母(1 s s a t c h e n k i a)和红酵母(R h o d o t o r u l a)为主，与泸州窖池I 相似，德巴利酵母和假丝酵母也在某些时段成为唯一的绝对优势菌。系统发育分析结果表明，各菌属

6、在进化上分为不同的支系，相互之间的亲缘关系相对较远，说明它们之间有着较高的遗传多样性和种属多样性。关键词：窖池发酵酵母数量消长优势菌群系统发育四川大学硕士学位论文A n a l y s i so nM i c r o b i a lC o m m u n i t i e so fy e a s ti nC 1 1 i n e s eL u z h o u f l a v o rF e r m e n t a t i o nP i t sM a j o r：M i c r o b i o l o g yG r a d u a t es t u d e n t：W uF e iA d v i s

7、o r：H uC h e n gT h ep r o d u c t i o no fC h i n e 辩w i n ei sb a s e do nt h el i q u o rp i t，a l lk i n d so fm i c r o o r g a n i s m,e s p e c i a l l yt h a te x i s ti nt h ef e r m e n t i n gg r a i nc o n t r o lt h eq u a l i t ya n dq u a n t i t yo ft h ew i n e Y e a s to n eo ft h

8、em a i nt h m em i c r o o r g a n i s mn o to n l yp r o d u c ee t h a n o lb u ta l s oy i e l df l a v o rd e m e n t,S Oi td e s e r v ea t t e n t i o n O n ep i ti nO u a n x i n gd i s t i l l e r y(q u a n x i n gp i Oa n dt w op i t si nI J I z h o l l td i s t i l l e r y(L u z h o up i t

9、Ia n d Z I Z h O Up j t 毋a 圮c h o s e n 鹄t h eo b j e c ta n a l y z e d T h ew a yo f蛐p l i n gl i k et h i s：S a m p l et h e0-d a yf e r m e n t e dg r a i n,7-d a yf e r m e n t e dg r a i n,1 4-d a yf e r m e n t e dg r a i n,2 1-d a yf e r m e n t e dg r a m,2 8-d a yf e r m e n t e dg r a m,4

10、 9-d a yf e r m e n t e d酏7 0-d a yf e r m e n t e dg r a i n W ed i v i d e dt h ep i ti n t ot h r e el a y e r si n c l u d i n gu p-l a y e r,m i d l a y e ra n db o t t o m l a y e r,a n dc o l l e c tt w os a m p l e si nt h em i d d l ea n dt h ec d g co fe v e r yl a y e rr e s p e c t i v e

11、 l y F i r s t,w ea d o p tt h em e t h o do fC F Ut oa n a l y z et h ec h a n g eo ft h ey e a s tq u a n t i t y；S e c o n d,i d e n t i f i e dt h ei s o l a t e ds t r a i n st oa n a l y z et h ed o m i n a n ty e a s t s；F i n a l l y,m a k es u r et h a tt h er e s u l ta c h i e v e db yt h

12、 et r a d i t i o n a li d e m i f i c a t i o nm e t h o di sc r e d i b l ea n dt h ep h y l o g e n ya n a l y s i si sf i n i s h e da c c o r d i n gt ot h ea n a l y s i so ft h e1 8 Sr D N A T h er e s u l ts h o w s：T h ey c a s lq u a n t i t yo fq u a n x i n gp i tw a sl e s st h a nt h a

13、 ti nb o t ho f1 A I z h o up i t s,b u tt h e r e sn od i f f e r e n c eb e t w e e nt w oI A i z h o up i t sb a s i c a l l y M a y b ei t st h ee f f e c to ft h ed i f f e r e n tw e a t h e r,b e c a u s et h er a i nq u a n t i t yi sl a r g e ri nI A i z h o ut h a nt h a ti nC h e n g d u,

14、a n dt h ee n v i r o n m e n ts u c ha st h ea t m o s p h e r ea n dt h ew a t e ri n7婴型盔兰堡兰竺笙苎L u z h o ni ss u p e r i o rt ot h a ti nC h e a g d u T h e r e sal a r g e s ty e a s tq u a n t i t yi nq u a n x i n gp i ta r o u n d7-d a yf e r m e n t a t i o n,w h i l ei nL u z h o np i tIt h

15、em u l t i p l i c a t i o no fy e a s td i d n ts t o pu n t i l1 4 血d a yO r2 1 醴，h o w e v e r,t h ey e a s tq u a n t i t yi nI A I z h o up i tI Id e c r e a s e da l lt h et i m e A l lt h e s ep h e n o m e n ai n d i c a t et h a tt h et e c h n i cp r o c e d u r eh a sa l le f f e c to nt

16、h ec h a n g eo fy e a s tq u a n t i t y T h e r ea r e4 6k i n d so fd o m i n a n ty e a s tg e n u si nt h et h r e ep i t sr e s p e c t i v e l y,b u tt h e r ea r e5 0 m ed i f f e r e n c e sa m o n gt h e m T h ed o m i n a n ty e a s t si nq u s n x i n gp i ta r eH a n s e n u l a，B r e t

17、 t a n o m y c e s,C i t e r o m y c e s,O o s p o r i d i u m，D e k k e r aa n dP a c h y s o l e n T h ed o m i n a n ty e a s t si nI A I z h o up i tIa r e D e b a r y o m y c e s,C a n d i d a，P i c h i a，H a n s e n u 蛔a n dt h eD e b a r y o m y c e s，C a n d i d aa r et h es o l ed o m i n a

18、 n ty e a s t si ns o m ep e r i o d s T h ed o m i n a n ty e a s t si n A I z h o up i t1 1a r eD e b a r y o m y c e s,C a n d i d a，P i c h i a，S a c c h a r o m y c e s，I s s a t c h e n k i a,R h o d o t o r u l a，a n dj u s tl i k et h a t i nl A i z h o np i tID e b a r y o m y c e s,C a n d

19、 d aa r et h es o l ed o m i n a n ty e a s t si ns o m ep e r i o d s T h ea n a l y s i so fp h y l o g e n yi n d i c a t e dt h a te a c hg e n u si sO nt h ed i f f e r e n tb r a n c h e so ft h ep h y l o g e n yt r e e,t h er e l a t i o n s h i pa m o n gt h e ma r er e l a t i v e l yf a r

20、 s oi tt o o ko ns o m e k i n d o f g e n e f i c d i v e r s i t y a n d g e n u s d i v e r s i t y o f t h e y e a s t i n t h e p i tK e yw o r d s：f e r m e n t a t i o np i tf e r m e n t a t i o ny e a s tq u a n t i t yc h a n g ed o m i n a n t m i c r o b ep h y l o g e n y8四川大学硕士学位论文浓香型白

21、酒窖池发酵过程中酵母类微生物的分析刖舌中国白酒足我国特有的传统酒种，在漫长的发展过程中形成了独特的工艺和风格特征，在世界范围内享有很高的声誉，与白兰地、威士忌、劳姆酒、伏特加、金酒齐名，被誉为世界著名的六大蒸馏酒之一。中国白酒界内部也是百花齐放，根据主体香型的不同，大体上可分为三大类：浓香型、酱香型和清香型，其中浓香型白酒以其窖香浓郁、绵甜爽净、香味谐调、余味悠长的特征广受消费者的青睐。2 0 0 1 年中国白酒总产量为4 2 0 1 9 万吨，其中浓香型白酒就占据了约7 0 的份额“1。四川省以其独特的地理环境和气候特征孕育了一方美酒，以五粮液、泸州老窖、沱牌、全兴和剑南春为代表的浓香型白酒

22、在四川遍地开花，争奇斗艳，造就了四川省的一大支柱产业一白酒产业，成为了四川省的重要财政收入来源。中国浓香型白酒的生产以泥窖窖池为基础，发酵过程是栖息在窖池糟醅、窖泥中的庞大微生物区系在糟醅固、液、气三相界面的复杂的物质能量代谢过程。发酵过程中产生的黄水充当着窖泥与糟醅物质交换的载体，封盖发酵形成的窖内压力变化使酒糟中的养份和来自曲药、环境的微生物及其代谢产物不断通过黄水进入泥中，而窖泥中的特种微生物种群及其代谢产物又不断地进入糟醅中，在实现窖泥自身新陈代谢的同时，也完成窖泥与糟酩的物质能量交换。窖泥微生物经过长期的驯化和变异发展，微生物种类不断丰富，慢慢形成了以己酸菌，丁酸菌为主的窖泥微生态菌

23、群体系，其生命代谢所产生的复合窖香香气构成了浓香型白酒窖香浓郁的基础。窖池在连续生产过程中，每一个批次，窖池中就产生一次曲药微生物、环境微，物与窖泥微生物的相互迁徙以及微生物菌群在糟酪中的演化交替并趋f 稳定。因而，每一次固态发酵过程，就是窖池微，态环境中微生物区系的一次动态平衡过程。而每一次平衡体系的形成，制约了窖池内物质代谢和能量代谢的走向，决定了白酒不同的风味特征。正因9堕型盔兰堡兰堡笙壅为中国浓香型白酒风格形成的独特性，中外科研工作者对中国浓香型白酒窖池微生态系统特别是其中的微生物区系作了大量的研究工作，并取得了一些可喜的成果。酵母菌在原料淀粉质的糖化，酒精的生成，香气物质的形成等方面

24、都起着重要的作用，因此探讨酵母微生物区系的变化，甚至特定发酵阶段的种群结构对白酒生产都有重要的指导意义。特定的地理、气候条件，不同的发酵工艺造就了特定的微生物生长环境，形成了特定的微生物种群，这就是为什么不同的酒厂生产的白酒会呈现出不同风味和品质。不仅如此，微生物自身也在代谢过程中影响着其赖以生存的微生态环境，因此随着发酵时间的推移微生态环境的改变，微生物种群结构也会相应的发生变化。综合以上两点，我们选取了3 个窖池进行作为研究对象，分别是全兴的一个窖池和泸州老窖的f 两个窖池。3 个窖池不仅从地域上形成了差异(全兴地处成都，泸州老窖地处川南的泸州)，在发酵工艺上也有所不同。另外，我们不局限于

25、对发酵的某个时间或窖池的某个区域进行考察，而足对整个发酵周期和窖池不同的位点进行全面的分析。近年来，以P E R 技术为主的分子生物学技术(如R A P D，A F L P,F I S H，s s gP C R-D G G E T G C E,A R D R A 等)的广泛应用，为从分子水平揭示微生物多样性提供了新的方法，开拓了分子生物学与生态学的交叉领域。1 8 Sr D N A 是真核生物染色体上编码核耱体小亚基R N A 的基因，在长期的进化过程中，分子功能几乎保持恒定，而且其分子的排列顺序有些部位变化非常缓慢，从这种排列顺序即可探讨种系发育上的深远关系。1 8 Sr D N A 在结构

26、上既具有保守性，又具有高变性。保守性能反映出生物物种的亲缘关系，为系统发育藿建提供线索；高变性则能揭示出生物物种的特征核酸序列，是属种鉴定的分子基础。随着D N A测序技术的发展，越来越多的D N A 序列被测定出来，并储存在网络数据库(如G e n B a n k)中供免费使用，其中r D N A 序列涉及的生物种类最多。把待测真菌的1 K Sr D N A 序列测定出来，然后与数据库中的已知菌种进行比较，即可确定供试真菌的分类地位。这是一种不同于表型鉴定的以生命本质核酸为基础的分类鉴定方法，因此可以最大程度的保证结果的准确性和客观性。鉴于此，本试验还通过对分离到的菌株进行1 8 Sr D

27、N A 的序列分折，探讨酒酩中酵母菌的组成情况。四川大学硕十学位论文第一章窖池发酵过程中酒醅内酵母菌的分离与分类统计长期以来，微生物的平板分离计数法(即活菌计数法，C F U 法)一直是我国科研工作者研究窖池微生物区系的重要手段。本法将样品用无菌生理盐水进行系列稀释，取合适的稀释度(一般三个稀释度)，以涂布法接种于平板，或以混碟法进行操作，经过一定时间的培养之后，直接统计平板的菌落。该方法测定的是样品中所含的现时可培养的活的微生物数量，所以称之为活菌计数法。平板分离计数法中，每个菌落由一个单细胞繁殖而成，为肉眼可见的细胞群体，一般来说在每个平板形成3 0 3 0 0 个菌落属于有效范围，该法所

28、测数值有可能偏低，因为有可能两个或以上的单细胞在一起形成一个菌落，也可能培养条件不适。平板分离计数法仅能对可培养微生物进行统计且存在一定的偏差，虽然有其一定的缺陷性，但它可以得到活的菌落培养物，再通过纯化分离可得到纯种的微生物培养物，更全面地保留了特定微生物的信息，这是当前微生物分子生态学技术所不能做到的。1 实验材料1 1 样品来源1 1 1 分离培养基选择用样品材料与方法采自睾谷酒厂一窖池的出窖糟醅。四J tr 大学硕士学位论文1 1 2 分析样品选取四川全兴酒厂的一个窖池，以及泸州老窖酒厂的两个窖池分别进行跟踪采样，采样方法如下：按发酵。天(入窖)、7 天、1 4 天、2 1 天、2 8

29、 天、4 9天、7 0 天(出窖)时间点跟踪取样7 次；每次共计6 个空间区域，即窖池酒醅按纵向分上中下三层(窖顶以下5 0-7 5 c m，1 5 0-1 7 5 c m，2 5 0-2 7 5 c r n)，按横向分中心区域(中心区7 5 c m 以内)和周边区域(距窖顶各边5 2 0 c m 环带)，同区域取3 点样进行混合平均；7 次取样共获3 6 个样品(入窖和出窖样只有上中下3 个样品)。1 2 培养基1 2 1 酵母分离用培养基1 2 1 1I P I)培养基伽葡萄糖蛋白胨酵母膏琼脂蒸馏水1 1 3 灭菌3 0 r a i n2 0 92 0 91 0 92 0 91 0()0

30、l l l l1 2 1 2 米曲汁培养基嘲米曲汁培养基的制法：1)将千米曲磨碎，一份米曲加四份水。在6 5 水浴锅中糖化3 4 h，糖化程度可用碘滴定之。2)将糖化液用4 6 层纱布过滤，滤液如混浊不清，可用及蛋白澄清。方法是将一个鸡蛋白加水约2 0 m l，调匀至泡沫时为止，然后倒在糖化液中搅拌煮沸后在过滤。3)将滤液稀释到5 6 波荚度，P H 约6 4，加入2 琼脂。1 2 1 灭菌2 0 m i n四l 大学硕七学位论文1 2 1 3 麦氏琼脂培养基闽葡萄糖K a酵母浸膏醋酸钠琼脂蒸馏水1 1 3 灭菌2 0 r a i n1 2 1 酵母鉴定用培养基旧l g1 8 92 5 98

31、2 92 0 91 0(】0 m l麦芽汁液体培养基：将麦芽汁调至l O 波林的糖度，p H 至5 4；过滤后分装试管，每管4 m l；1 1 3灭菌2 0 m i n。麦芽汁固体培养基：以1 0 波林麦芽汁，加2 琼脂，加热熔解，分装试管；1 1 3 灭菌2 0 m i l l；摆斜面。M c C l a r y 培养基：葡萄糖0 1，K C l0 1 8，酵母膏0 2 5，醋酸钠O 8 2，琼脂2，用蒸馏水配：装试管；1 1 3 灭菌1 5 m i n：搁黄斜面。K l e y n 培养基：K H 2 P 0 40 0 1 2，K 2 H P 0 40 0 2，醋酸钠0 5 葡萄糖0 0

32、6 2，N a C l0 0 6 2，蛋白胨O 2 5，水洗琼脂2，生物素2 O 微克，每1 0 0 m l 加混合盐类l m l，蒸馏水配，p V l 6 9 7 1；装管；1 1 3 灭菌2 0 r a i n；搁置斜面。混合盐溶液：M g s 0 4 7 H 2 0O 4，N a C lO 4，C u S 0 4 7 H 2 00 0 0 2，M n S 0 4 4 H 2 00 2，F e S 0 4 4 H 2 00 2。G o r o d k o w a 培养基：葡萄糖0 1，蛋白胨l，N a C l1 2，水沈琼脂2，蒸馏水配：装管；婴业盔兰堡兰堡丝奎1 1 3 灭菌2 0 r

33、a i n：搁黄斜面。马铃薯块培养基：将马铃薯去皮，切成长条斜面；装入试管(在底部预先垫上一小团湿棉球)；1 1 3 灭菌3 0 r a i n。马铃薯葡萄糖琼脂培养基：去皮马铃薯2 0 0 克，葡萄糖2 0 克，琼脂2 0 克，自来水1 升。将马铃薯洗净，去皮，切成小块，立即放入水中，以免被氧化。煮沸3 0分钟，经纱布过滤，滤液加水至1 生，加入葡萄糖和琼脂，溶解后分装三角瓶或试管，1 1 3 灭菌2 0 r a i n。玉米粉琼脂：称取1 2 5 克黄玉米粉，加水3 0 0 m l 搅匀，以6 0 水浴保温l h，用纸过滤，滤液加水至3 0 0 m l，加3 8 9 琼脂，1 2 1 C

34、1 5 m i n 灭菌，趁热用脱脂棉过滤，装大试管，每管2 0m l，1 1 3 灭菌1 5 r a i n。糖发酵基础培养基：1)1 2 5 豆芽汁：黄豆芽1 2 5 9 加水1 L，煮沸半小时，过滤后补足水至l L o1 1 3 灭菌3 0 r a i n 备用。2)0 6 酵母浸汁：加6 0 9 干酵母粉于l L 水中，必要时加一些蛋清澄清滤液；1 2 1 灭菌1 5 m i n，趁热用双层滤纸过滤；1 1 3 灭菌2 0 r a i n 备用。同化碳源基础培养基：(N H D2 s 0 40 5，K H 2 P 0 40 1，M g S 0 4 7 H 2 00 0 5，酵母膏0 0

35、 2，C a C l 2 2 H 2 00 0 1，N a C l0 0 1，糖或其他碳源O 5，用蒸馏水配，培养基过滤后分装小试管，每管约3 m l，1 1 3 灭菌加m i n。同化乙醇基础培养基：(N I-h)2 S 0 40 1，K H 2 P 0 40 1，M。g S 0 4 7 H 2 00 0 5，酵母膏0 0 1，用蒸馏水配，过滤后每管定量装5 m l，1 1 3 灭菌1 5r a i n，使用时加3 乙醇。同化氮源基础培养基：葡萄糖2，K H 2 P 0 4O 1，M 萨0 4 7 H 2 00 0 5，酵母膏0 0 2，水洗琼脂2，用蒸馏水配，过滤后装大试管，每管约2 0

36、m l，1 1 3 灭菌1 5m i n。产类淀粉化合物培养基：(N H 4)z S 0 4 0 5，K H 2 P 0 4 0 1，M g s 0 4 0 0 5，酵母膏O 1，C a a 2,2 H 2 00 0 1，N a a0 0 1，葡萄糖3，用蕉馏水配，分装于5 0 m l 三角瓶中，约5 m l，1 4明川大学硕士学位论文1 1 3 灭菌2 0r a i n。产酯培养基：葡萄糖5，用1 0 豆芽汁配制，分装于5 0 m l 三角瓶中，每瓶2 0 r i d，11 3灭菌2 0 i n i n。无维生素基础培养基：(N H 4)2 s 0 4O 5，K I-I z P 0 4o 1

37、，M g S 0 4 7 1 1 2 00 0 5，C a C l 2 2 O0 0 1，N a C l0 0 1，葡萄糖2，加蒸馏水1 0 0 r i d，分装试管，每管5 m l，11 3灭菌2 0 r a i n。石蕊牛奶：取新鲜牛奶，煮沸1 5n d n，冷却后，置冰箱过夜，用虹吸管吸取下层液，除去上层脂肪，即成脱脂牛奶。每l L 脱脂牛奶加2 5 石蕊水溶液4 m l。分装试管，儿3 灭菌1 5m i l l。2 实验方法2 1 菌株分离培养基的选择2 1 1 菌株的分离参照周德庆等嘲，采用稀释平板菌落计数法，培养温度为2 8 C，培养2 3天观察计数。具体操作如下：1)取3 支无菌

38、空试管(1 5 X 1 5 0 r a m)，依次编号为1 0 1、1 0。、1 0，Y P D培养基平扳也分别编号为1 0 一、1 0 、1 0，每个稀释度各3 只平板；2)按无菌操作，用5 m l 移液管分别吸取4 5 m l 无菌水于编好号的各无菌空试管中；3)称取2 9 酒酩样品，加入到装在三角瓶中的2 0 0 m l 无菌水中，充分振荡摇匀：4)用I m l 无菌移液管精确吸取0 5 m l 菌液f 标为“1 0 1”试管中，另取一支l m l 的无菌移液管，先在“1 0”菌液管中柬回吹吸数次，再精确吸取0 5 m l菌液于标为“l O“试管中，按刚样的方法吸取0 5 m l 菌液于

39、杯为“1 0”试管中；1 5四川大学硕士学位论文5)分别精确吸取三个稀释梯度的菌液0 2 m l，对号加在Y P D 培养基平板上，立即用涂棒迅速将菌液均匀涂开；6)将涂布后的平板倒置于2 8 恒温箱中培养，2 3 天后观察计数。2 1 2 分离效果的评价主要从菌落数量、形态类别、分离效果等指标进行判断。选择分离效果好的作为后续试验的培养基。2 2 发酵过程中菌株数量的分析2 2 1 菌株分离培养及计数以Y P D 为酵母分离培养基，2 8 1 2 培养2 3 天，采用稀释平板菌落分离计数法进行计数嘲。具体操作方法参见2 1 1。2 2 2 整个周期菌株数量的变化分别对3 个窖池，不同取样时间

40、和不同取样位置的酵母菌数进行计量，并进行相互之间的比较。2 2 3 不同窖池中菌株数量的比较按同一取样时间，同一取样位置，对3 个窖池的酵母菌数进行横向比较。2 3 不同窖池优势菌群的比较2 3 1 菌种鉴定菌落经纯化后，参考中科院微，物所常见与常用真菌、张纪中微，1 6婴型盔兰塑主兰丝堡奎物分类学、周德庆等微生物学实验手册峨。”等相关的微生物分类鉴定系统的方法，对分离菌株进行以下两方面的考察：1)形态特征：细胞形态学观察，固体及液体培养特征，子囊孢子的形成，假菌丝的形成和形态，以及掷孢子的形成和形态；2)生理特性：糖类发酵，碳源同化，氮源同化，产类淀粉化合物的测定，产酯测定，牛奶胨化或凝固，

41、脂肪分解，在无维生素培养基中的生长实验，3 7下的生长温度测试等。2 3 2 优势种群的分析根据菌种鉴定的结果，对3 个窖池中酵母菌优势种群进行比较。结果与讨论1 酵母分离用培养基的选择酵母在Y P D 培养基、米曲汁培养基、麦氏培养基的分离培养情况见表卜l。表1-1 酵母用培养基的分离培养效果所有的平板采用同一菌悬液稀释度(1 0 1)及涂向量(O 2 r a l)进行培养和计数，实验中采用的是#谷酒厂的出窖酒酪。由实验结果可以看出，三种培养基在酵母形态及类别上几乎一致，但从酵母的生长菌落数及分离效果而占，明显以Y P D 培养基为好，可见采用Y P D 培养基町以对浓香型白酒糟酩中的酵母菌

42、1 7I-rL婴型查兰堡兰竺丝塞达到最好的分离培养效果。由于在对窖池糟醅酵母菌变化的研究中，微生物的分离培养足基础，因而培养基的选择足关键，能较好地满足多种类型微生物的生长和繁殖，才能最大限度和比较客观地反映稽醅中微生物的种类及其数量，探讨其变化规律。根据实验结果，我们认为对浓香型白酒糟醅中酵母的分离培养，以Y P D 培养基为宜，其配方及配制情况如下：葡萄糖2 0 9，蛋白胨2 0 9，酵母膏l o g，琼脂2 0 9，蒸馏水1 0 0 0 m l，p H 自然，1 1 3 灭菌3 0 m i n。2 整个发酵周期中酵母菌数的变化2 1 全兴窖池全兴窖池在发酵过程中各发酵时间点及各空间位置的

43、酵母菌的动态变化结果如表2 一l。表2-1 全兴窖池发酵过程中酵母菌的动态变化从发酵时l B J 来看，酵母菌数鼍从入窖到发酵7 天总体上柬说是一个迅速增加的过程，含最最高时每克酒醅样中酵母菌数量为1 0 5 数鼍级。过了7 天这个高峰后，随时问的推移，菌数基本上是逐渐减少。发酵三周后，酵母菌数基本1 8婴型盔兰婴兰垡堡苎趋于稳定，没有大的变化，且各个取样点的数量都处在一个较低的水平上，大都只达到1 0 2 数量级。结合相关理化的分析结果，发现在发酵一周内，由于霉菌对淀粉质原料的糖化作用，还原糖含量达到最大值，因此酵母菌数量呈一个急剧增加的过程。7 天后，酒醅中酒精浓度迅速增加，2 1 天后达

44、到最大值，以后略有下降并逐渐趋于稳定。发酵温度在1 4 天后达到最高点(3 4 左右)并维持到2 8 天，说明在7 天左右，就基本完成了酵母菌从菌体增殖向酒精发酵的转变，第二周至第四周是酒精发酵最旺盛时期，2 8 天后趋于减弱。从各空间位置来看，酵母菌数在同一取样层的中间和边沿总体上是一致的，最多只有倍数的差距，没有达到数量级的差距。以不同的取样层相比较，除入窖样中上层菌数大大低于中层菌数而外，在以后的发酵过程中这两层的菌数基本没有大的差异。而下层样的菌数却远远低于上层和中层，大都处于1 0 2的数量级，且在入窖和出窖样中都没检测到。可能是由于在多轮底发酵工艺中，下层多轮不出窖蒸馏，经过多轮发

45、酵的窖底酒醅一直未经更换，形成了一个极度厌氧和酸性的环境，加上一些不利酵母增殖的代谢产物的积累，因此酵母菌数量从入窖开始就维持在一个很低的水平。2 2 泸州窖池I泸州窖池I 在发酵过程中各发酵时间点及各空白J 位置的酵母菌的动态变化结果如表2-2 所示。从发酵时间来看，酵母菌数量从入窖到发酵7 天总体上来说是一个迅速增加的过程，这和全兴有一致性。但是每克酒醅样中酵母菌数量大都达到1 0 6 数鼍级，最高到达l 矿，这是远远超过全兴的。且在上层样中从第7 天到2 1 天，总菌数不降反呈缓慢上升的趋势，在中层样中也是到了1 4 天以后总菌数才开始减少。从各空间位置来看，同处一层的中间和边沿样的酵母

46、菌数总体上没有太大差别，这一点也同全兴是一致的。以不同的取样层相比较，仍然是入窖样中上层菌数大大低于中层菌数，在以后的发酵过程中，上层菌数却稍多于中层。而下层样的菌数却远远低于上层和中层，大部处于l 旷的数量级，有的样品中甚至没有检测到。其原因应该与全兴是一致的。四川大学硕十学位论文2 3 泸州窖池II泸州窖池I I 在发酵过程中各发酵时间点及各空间位置的酵母菌的动态变化结果如表2 _ 3 所示。表2-3 泸州窖池l I 发酵过程中酵母菌的动态变化2 0婴型查兰堡兰垒至苎从发酵时间来看，从入窖到出窖酵母菌数量是一个逐渐减少的过程，这和全兴及泸州窖池I 呈现的趋势都不相同。但是每克酒醅样中酵母菌

47、数量较大，与泸州窖池I 有相似之处，最高也到达1 0 7 数量级，同样远远超过全兴。从各空间位置来看，同处一层的中间和边沿样的酵母菌数总体上仍然没有太大差别，这与前两个窖池是一致的。以不同的取样层相比较，大体呈现上层样总菌数多于中层，中层又多于下层的趋势。但是在入窖样中，中层菌数却低于下层菌数，7 天以后下层还足能难检测到有酵母的存在。这也许是本窖池采用了与前两个窖池不同的非双轮底发酵工艺，同时在拌料时人为加大了酵母接种量，所以才出现下层能检测到大量酵母存在以及整个入窖样中菌数基本都比以后多的现象。3 发酵过程中优势酵母菌群的变化3 1 全兴窖池中的优势菌群在全兴窖池中，先后检测到了汉逊酵母(

48、H a n s e n u l a)、酒香酵母(B r e t t a n o m y c e s)、固囊酵母(C i t e r o m y c e s)、卵孢酵母(O o s p o r i d i u m)、德克酵母(D e k k e r a)和管囊酵母(P a c h y s o l e n)。它们在整个发酵过程的时日】上，以及整个窖池空间中的分布情况分述如下。从表中可以看出，汉逊酵母在入窖样的上层和中层都有所检出，且主要集中在入窖和发酵1 4 天的样品中。下层中在任何发酵时间点都没有检测到它的存在。结果见表3-l 所示。在入窖的上层和中层中榆测到了酒香酵母，而且中层的数最多于上层样

49、，这与整个酵母的情况是一致的。在其他的时间点及位置中没育检测到它的存2 1四川大学硕十学位论文在。结果见裹3 之所示。表3-1 汉逊酵母属在全兴窖池中的检出时间及检出位置上层边样上层中样中层边样中层中样下层边样下层中样发酵天数(1 0，g)(1 0 3 g)(1 0 3，g)(1 0 3 g)(1 0 3 g)(1 0 3 g)1 2 1 01 2 8 01 2 1 02 2 43 8 2 04 1 71 4 23 8 2 00 0 8 3注：“一”表示没有检测到，后面所有表格中与此相同。表3 _ 2 酒香酵母属在全兴窖池中的检出时间及检出位置上层边样上层中样中层边样中层中样下层边样下层中样发

50、酵天数(1 0 g)(1 0 g)(1 0 a g)(1 0 3 g)(1 0 3 g)(1 0 V g)(g)()(3 1 3 固囊酵母属：C t o r o f#y c e s)周囊酵母属在时间和空间上都有较广泛的存在。我们分别在发酵7 天、2 1天、2 8 天和4 9 天的样品中检测到了同囊酵母，并且数鼍较多，特别足第7 天，在总菌数种占了非常高的比例。另外，发酵后期的F 层样中也有其存在，表明O7H 牡穹S 阳姗二二二O，Hn 勰柏砷四J i I 大学硕七学位论文固囊酵母对下层的恶劣环境有一定的耐受性。结果见表3-3 所示。表3-3 固囊酵母属在全兴窖池中的检出时间及检出位置卵孢酵母主