基于聚丙烯酰胺凝胶的高通量snp检测芯片的研究及应用.pdf

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1、东南大学硕士学位论文基于聚丙烯酰胺凝胶的高通量SNP检测芯片的研究及应用姓名：孙蓓丽申请学位级别：硕士专业：生物医学工程指导教师：陆祖宏20060601摘要中文摘要论文题目：基于聚丙烯酰胺凝胶的高通量S N P 检测芯片的研究及应j j硕士研究生：孙蓓丽导师姓名：陆讥宏教授学校名称：东南大学随着人类基因组序列的绘制完成，生命科学领域的研究热点正迅速转向对基因功能、表达调控、多个基因问以及基因和环境间相互作用等方面。对基因组序列中单核苷酸多态性(s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m S N P)的研究是该阶段的重要研究内容之一

2、。S N P 作为第三代遗传标记，具有数量多、密度大、分布广等特点，可用于疾病基因的定位与克隆、关联分析等，并在疾病的甲I 期诊断、预防和治疗等方面体现重要功能和应用价值。S N P 的分型检测技术种类繁多，各有利弊，探索和建立准确、快速、高通晕的S N P 检测方法仍然十分必要。D N A 微阵列由于其平行性、高通量检测等特点，在S N P 分型上有很大的优势。基于D N A 微阵列的S N P 分型技术有两种：一是将寡聚核苷酸固定在基片上检测靶D N A 中多个S N P 位点：一是将靶D N A 固定在基片上检测大量样本的某些特定位点。本论文在对第一种S N P 检测技术进行优化的基础上

3、，提出了一种新型的基于三维凝胶载体的D N A 微阵列检测S N P 的分型技术，并将其应用于冠心病易感基冈的研究中，主要内容如：1 基于二维D N A 微阵列的S N P 检测技术的优化比较氨基、醛基、多聚赖氨酸三种不同玻片修饰方法，以及不同P C R 产物长度的固定、杂交效率，结果表明，采用醛基修饰的玻片上固定2 0 0 b p 左右的P C R 产物，具有较高的固定，杂交效率和信噪比。但这种二维D N A 微阵列对P C R 产物的需求量大，固液相反府效率较低，用于高通鼍S N P检测还存在灵敏度、重复性、稳定性等多方面的不足。2 基于三维凝胶的S N P 检测芯片的制备与优化与传统的二

4、维核酸微阵列相比，凝胶D N A 微阵列特有的三维网状结构可以固定更多的核酸分子，水凝胶载体提供类似于液相的反应环境，可以作为良好的核酸固定载体进行S N P 检测。我们采川将丙烯酰胺修饰的P C R 产物与丙烯酰胺单体等混合，点样丁玻片上，在充满T E M E D 的真空干燥器内聚合成聚丙烯酰胺凝胶，制备二维凝胶的D N A 微阵列。与分别标记C y 3，C y 5 的荧光探针杂交，通过电泳清除1 r 特异性键合，可有效识别单碱基错配。通过进一步对聚丙烯酰胺凝胶浓度、产物变性方法、探针k 度，电泳条什笛进行了一系列优化，以及通用标签探针的应用，建立了一种新犁的基于三维凝胶D N A 微阵列的

5、S N P 检测技术，具有比二维芯片更理想的准确性、灵敏度、稳定性和重复性，并极大地降低了S N P 检测成本。3 基于凝胶的S N P 检测技术应用于冠心痛易感基因的研究利用生物信息学筛选功能性S N P s，并应用于冠心病研究中。我们初步筛选出了O L R l、M M P-1、M M P 1 3、M M P 1 1、M M P 2 7 和M M P L I 等6 个基阗的7 个S N P s 位点用于冠心病易感基因的研究。基于二维聚丙烯酰胺凝胶D N A 微阵列技术，我们对2 3 8 例冠心病患者和2 3 3 例正常对照进行S N P s分型检测，并采用c a s e c o n t r

6、o l 方法进行统计和遗传学分析。结果显示：将病人组按照生化指标是否异常分组，在H D L 1 5 5m m o l L 和H D L 1，5 5m m o l L 的女性冠心病人组间、L D L 3 1 2m m o l Ln I 东南人学硕十学位论文与L D L 3 1 2m m o l L d 的全部及男性冠心病人组间，O L R I 基因上5 U T R 位置的S N P(r s l 0 5 0 2 8 3)的基因型分布具有显著性差异(p 值分别为0 0 4 5、0 0 3 6 和0 0 2 7)，表明O L R l 基因与冠心病只有一定的相关性。同时我们的实验结果也进一步表明基丁凝胶

7、的S N P 检测技术具有灵敏度高、成本低、准确性、稳定性和重复性好等特点，在临床检测中具有极大的应用前景。关键词：基冈芯片单核苕酸多态性(S N P)聚丙烯酰胺凝胶通用标签探针冠心病I V 英文摘要(A b s t r a c t)T i t l e：R e s e a r c ha n dA p p l i c a t i o no fH i g h-t h r o u g h p u tS N PG e n o t y p i n gB a s e do nP o l y a c r y l a m i d eM i c r o a r r a y sC a n d i d a t eM

8、 a s t e r：S U NB e i L iS u p e r v i s o r：P r o f e s s o rL UZ u-H o n gN a m eo ft h eU n i v e r s i t y：S o u t h e a s tU n i v e r s i t yW i t ht h es u c c e s so fH u m a nG e n o m eP r o j e c t(H G P)，m o r ea n dm o r er e s e a r c hj n t e r e s t s 1 1t h ef i e l do fl i r es c i

9、 e n c eh a v eb e e nt u r n e dt ot h ef u n c t i o n，e x p r e s s i o na n dr e g u l a t i o no f g e n e s，t h er e l a t i o n s h i pa m o n gg e n e sa n de n v i r o n m e n t s O n eo ft h ef r u i t so ft h eH u m a nG e n o m eP r o j e c ti st h er e s e a r c ho fs i n g l en u c l e

10、 o t i d ep o l y m o r p h i s m(S N P)A st h et h i r dg e n e r a t i o no fg e n e t i cm a r k e r s，S N P sa r es oh i g h l ya b u n d a n tt h a tc a nb eu s ei nm a p p i n go rc l o n i n go fd i s e a s e r e l a t e dg e n e s，a n da s s o c i a t i o ns t u d i e s，w h a t sm o r e，m a

11、yp l a yav e r yi m p o r t a n tr o l ei nd i a g n o s i s，p r e v e n t i o n，a n dt h e r a p yo f c o m p l e xt r a i t s T h a tal a r g en u m b e ro fi n d i v i d u a l sm u s tb eg e n o t y p e dr e q u i r e sa ne f f i c i e n t h i g h-t h r o u g h p u ta n dl o w-c o s tS N Pg e n o

12、 t y p i n gm e t h o d T od a t e t h e r ea r em a i n l yt w om i c r o a r r a y b a s e dm e t h o d sf o rg e n o t y p i n g O n ei sa r r a y i n gt h o u s a n d so fs h o r to l i g o n u c l e o t i d e st og l a s ss l i d ef o rd e t e c t i o no fa l lp o s s i b l eS N P sl o c ii nt

13、a r g e tD N A T h eo t h e ra p p r o a c hi n v o l v e sa r r a y i n ga m p l i f i e dP C Rp r o d u c t s1 0g l a s ss l i d e st od e t e c to n eo rm a n yS N P sl o c i f o ral a r g eo fs a m p l e s T h ea i mo ft h ep r e s e n ts t u d yw a st od e v e l o p ean o v e lm e t h o df o rg

14、 e n o t y p i n go ff u n c t i o n a lS N P si nh u n d r e d so fi n d i v i d u a l sb a s e do n3-Dg e lD N Am i c r o a r r a y T h em a i nc o n t e n t sa r ea sf o l l o w s：1 O p t i m i z a t i o no f 2-DD N Am i e r o a r r a yf o rh i g l l-t h r o u g h p u tS N Pg e n o t y p i n gT h

15、 r e ed i f f e r e n tc h e m i s t r y m o d i f i e d(A P T E S，g l u t a r a l d e h y d e，a n dp o l y-L L y s i n e)g l a s ss l i d e s，a n dd i f f e r e n t1 e n g t ho fP C Rp r o d u c t sw e r ee v a l u a t e db a s e do nd u a l c o l o rf l u o r e s c e n c eh y b r i d i z a t i o n

16、 1 1 1 er e s u l t ss h o w e dt h a ta b o u t2 0 0 b pp r o d u c t si m m o b i l i z e do na l d e h y d e-c o a t e ds l i d e se x h i b i t e dm o r es t a b l es i g n a li n t e n s i t yd u et ot h es t e a d ys c h i f fb o n d，a n dh i g hs i g n a l n o i s yr a t i o，H o w e v e r,t h

17、 el a r g ea m o u n t so fp r o d u c t sr e q u i r e m e n ta n dl o we f f i c i e n c yo f h y b r i d i z a t i o ne x p o s e dt h ed r a w b a c ko f t h i sk i n do f 2-Dm i c r o a r r a y 2 P r e p a r a t i o na n do p t i m i z a t i o no f 3 Dg e lm i e r o a r r a yf o rh i g h t h r

18、o u g h p u tS N Pg e n o t y p i n gC o m p a r e dw i t ht r a d i t i o n a l2-Dm i c r o a r r a y,3-Dg e lm i c r o a r r a yc o u l di m m o b i l i z em u c hm o r eD N A，a n dp r o v i d e dah o m o g e n o u s l i k er e a c t i o nc i r c u m s t a n c ea n das t a b l es u p p o r tw i t

19、hl o wf l u o r e s c e n tb a c k g r o u n d T h ea c r y l m o d i f i e ds l i d e ss p o o t e dw i t hp r e p o l y m e rw e r et r a n s f e r e di nav a c u o u sc h a m b e rf i l l e dw i t hT E M E D I n c u b a t e df o ro n eh o u r，p o l y a c r y l a m i d eg e l b a s e dm i c r o a

20、r r a yf o rS N Pg e n o t y p i n gw a sp r e p a r e db yc o p o l y m e r i z i n gp a r a l l e la m p l i f i e da c r y l a m i d e m o d i f i e dP C Rp r o d u c t sw i t ha c r y l a m i d em o n o m e r s A f t e rd u a l c o l o rf l u o r e s c e n c eh y b r i d i z a t i o n，n o n s p

21、e c i f i cb i n d i n gl a b e l e dt a r g e t sw e r er e m o v e db ya p p l y i n ga ne l e c t r i cf i e l d，F u r t h e r m o r e，o p t i m i z a t i o na b o u tp o l y a c r y l a m i d ec o n c e n t r a t i o n，d e n a l u r em e t h o do fs a m p l em i c r o a r r a y t e n g t bo f p

22、r o b e s c o n d i t i o no f e l e c t r o p h o r e s i sw e”c a r r i e do n T h ea s s a yf o r m a tb a s e do ug e l i m m o b i l i z a t i o na c h i e v e sah i g hp r o b ed e n s i t ya n dh a st h ea b i l i t yt ou s eu n p u r i f i e dP C Rp r o d u c t sf o ra r m yf o r m a t i o n

23、 M e a n w h i l e，u n i v e r s a lt a gp r o b e sw e r ep r o p o s e dt od e c r e a s et h ec o s tg r e a t l y 3 A s s o c i a t i o na n a l y s i so fS N P sw i t hr i s ko fc o r o n a r yh e a r td i s e a s e(C H D)b a s e do np o l y a c r y l a m i d eg e lm i c r o a r r a yM e t h o

24、do ff u n c t i o n a lS N P ss e l e c t i o nb a s e do nb i o i n f o r m a t i c sw a sp r o p o s e d 7S N P so f6g e n e s(O L R l，M M P 1。M M P 一1 3，M M P 一11，M M P-2 7，M M P L I)w e r es e l e c t e d 2 3 8C H Dp a t i e n t sa n d 2 3 3h e a l t h yV 东南人学硕士学位论文c o n t r o l sw e r eg e n o

25、t y p e db a s e dO i lp o l y a c r y l a m i d eg e lm i c r o a r r a y，a n dw e r ea n a l y z e db yc a s e c o n t r o ls t u d y T h er e s u l t ss h o w e d：f e m a l ep a t i e n t so fH D L I 5 5m m o l La n d 1 5 5m m o l 几m a l ea n da l lp a t i e n t so fL D L 3 1 2m m o l La n d GF 2

26、：5 一T A C T A T C C T T C C C A G C T C C T-3 巢式P C R1 3 54 8 R 2：57 一T T T T C A G C A A C T T G G C A T-3 F 1：57 T A C A A C G A G G A G C T G T T T A T G 一37常规P C R3 9 55 5 R 1：5。A G A G A G C T G A G T T C A G A G G G T 一3 U T R C TF 2：5-C T G T C A T T T A G C T G G C T G 一37巢式P C R1 9 84 8 R 2

27、：5。T T C A G A G G G T T T T C A A G C 一3 2 2 3 2 P C R 扩增1 常规P C R 扩增采用2 5p1 标准反应体系：1 0 X P C Rb u f f e r(1 0 0m MK C l，8 0m M(N H 4)2 S 0 4，1 0 0 m M T r i s-H C I p H9 O)2 5u l：2 5 m M M g C l 2 1 5 uh1 0 m Md N T P s0 5“h2 0p M 上下游普通引物备0 5i 1l；T a qD N A 聚合酶1 U；正常样本抽提基因组D N A5 0n g；去离子灭曲水补至2 5“

28、1 6 6 。2 反应体系置于P C R 仪中，反应条件为：9 5 C 预变性5 分钟；9 4 C 变性3 0 秒，5 5。C 退火4 5秒，7 2 C 延伸4 5 秒，循环4 0 次；最后7 2 C 延伸5 分钟。-1 7 奎童查兰婴圭堂垡堡壅3 巢式P C R 扩增采用5 0 川标准反应体系：1 0 X P C Rb u f f e r(1 0 0m MK C ，8 0m M(N H 4 h S 0 4，1 0 0 m M T r i s H C I，p H9 O)5 I t l；2 5 m M M g C l 23ph1 0 m Md N T P s1 I th2 0u M 上游巢式引物

29、、下游氮基修饰巢式引物各lp l；T a qD N A 聚合酶2 u：常规P C R 产物稀释5 0 倍，取1 5 I t l 作为模板：去离子灭菌水补至5 0 ul。4 巢式P C R 反应条件为：9 5 (2 预变性2 分钟；9 4 C 变性3 0 秒，4 8 C 退火3 0 秒，7 2 0 延伸3 0 秒，循环3 5 次；最后7 2 (2 延伸5 分钟。2 2 3 3 产物的纯化与处理P C R 扩增产物中可能含有反应未耗尽的寡核苜酸引物、d N T P 单体以及离子、蛋白、引物二聚体等物质，会对后续的杂交效果产生影响，故需要对产物进行纯化。1 混合2 0 0 I t lP C R 产物

30、，用P C R 产物纯化试剂盒进行纯化，最后以3 0 p l1 T E 缓冲液重新溶解产物；2 加入5 倍体积9 5 冰乙醇，混合均匀后置于2 0 C2 小时以上，对产物进行洗提；3 4 0，1 3，0 0 0r p m 离心4 5 分钟，弃去上层乙醇，将离心管置于3 7 (2 烘箱中烘干；4 洗提后的产物重新用3 X S S C 溶解，充分振荡离心后静置：5 样品移入3 8 4 孔点样板中待点样用。2 2 34 样品微阵列的制备通过机械臂将3 8 4 孔点样板中的样品接触式点样于三种不同化学基团修饰的玻片上，形成P C R产物阵列。阵列大小为8 8，包含1 1 个冠心病人样品、2 0 个正常

31、人样品、一个不包含D N A 的空白对照。每个样品重复2 次，每个点体积为2 0 0 n l。点样后荆定方法如下：1 氨基修饰玻片和多聚赖氨酸修饰玻片1)点样好的玻片放入垫有潮湿滤纸的表面皿中，封闭室温放置3 0 分钟：2)玻片经湿盒水化3 0 秒后，放置于1 5 0 热盘上，烘烤3 0 秒；3)玻片正面朝上，立即放入紫外交联仪中，设置总量为4 0 0 m J 的吸收值，进行交联作用；4)置于8 0 烘箱中烘烤2 小时，完成芯片的固定。2 醛基修饰玻片1)点样好的玻片放入垫有足够潮湿滤纸的表面皿中，3 7 (2 恒温箱中放置过夜，使氨基与醛基S c h i f r 碱反应充分；2)配置硼氢化钠

32、封闭溶液：1 2 m l9 5 乙醇与3 8 m lI X P B 混合均匀，加入0 5g 删氢化钠振荡混匀；3)双蒸水洗净玻片并吹干，放入新鲜配置的封闭液中，置丁摇床上，室温摇荡3 0 分钟，将玻片表面的醛基还原成羟基，以免在后期处理中再次附着上杂质影响背景；4)弃去封闭液，用双蒸水充分清洗3 遍，每遍3 0 秒，吹干玻片完成固定过程。2 2 35 双色荧光探针设计在本课题中，我们设计双色荧光标记探针，分别对等傍基因的两种类型进行检测。C y 3 与C y 51 8-第二章二维S N P 检测芯片的制备与优化荧光分别标记在野生型和突变型探针的5 端，整个探针的长度均为1 3 个碱基，中间位置

33、的碱基特异性识别S N P 位点，其余1 2 个碱基完全相同。据此原理设计的探针如表2 4 示。表2-4 针对O L R l 基因的S N P 设计的荧光探针列表检测位点探针名称探针序列E x o n-C5 -C y 3 一G G A A A A 卧G C C A A 一3 r s l1 0 5 3 6 4 6E X O n G5 -C y 5-G G A A A A 卧G C C A A-3 U T R C5 c y 3-T A G C T A 目C T G T A T-3 r s i 0 5 0 2 8 3U T R T5-C y 5-T A G C T 怫T G T A T-3 2 2

34、36 芯片杂交配置杂交缓冲溶液：2 0u13 杂交缓冲溶液，2 0 u M 野生型探针与突变型探针各3u1，去离子灭菌水补至6 0 p l。玻片浸入9 5 C 水浴中3 分钟，进行变性处理，固定于玻片上的反义链保留，正义链解开后脱离玻片。取出后，迅速浸入冷冻的无水乙醇中3 0 秒，防止未脱离正义链复性。吸耳球吹干玻片后，用记号笔在玻片反面标记出点样阵列位置。吸取适量的杂交液，加在阵列上，小心覆以盖玻片，防止产生气泡。玻片置于潮湿的杂交盒中，封闭后，入杂交箱3 7 杂交2 小时。2 2 37 数据的获取与分析1 杂交后处理1)玻片移出杂交盒，去离子水冲洗残余的杂交液与盖玻片，正面朝上置于干净的表

35、面皿中，倒入清洗液l(2 X S S C，O 1 S D S)缓慢摇洗5 分钟：2)弃液体，倒入清洗液2(O 1 S S C，O 0 1 S D S)缓慢摇洗5 分钟；3)倒入双蒸水摇洗3 次，每次半分钟，取出后氮气吹干。2 杂交结果的获取使刚激光扫描仪对玻片进行扫描。针对C y 3 与C y 5 两种荧光，选用激发波&为5 3 2 n m 和6 3 5 n m 的两种激光源进行芯片扫描，设置激光功率(P o w e r)8 0，光电倍增管效率(P M T G a i n)7 5，分别得到C y 3 扫描图与C y 5 扫描图。进一步，使用Q u a n t A r r a y 软件分析每一样

36、本点的荧光强度，得到样本在两种激光源扫描一F 的荧光强度及背景强度，求得实际信号的强度，及C y 3、C y 5 两种信号的比值，据此获得样品的基因型，修正肉眼直接观察的结果。2 3 实验结果2 3 1 抽提外周血基因组D N A 方法的选择分别用三种不同方法提取1 0 0 m l 和5 0 0 m l 的5 管外周血样品，经紫外分光光度计检测，D N A 样品的纯度(D N Ar a t i o=O D 2 6 0 O D 2 8 0)及D N A 样品浓度如表2 5 与表2 6 所示，其浓度已换算为原溶液1 9-东南大学硕士学位论文浓度。表2 5 不同基因组D N A 抽提方法提取1 0

37、0 m l 外周血的比较表2 6 不同基因组D N A 抽提方法提取5 0 0 m l 外周血的比较移取5pl c 类基闲组D N A，用l 琼脂糖凝股电泳检测，结果如图2 一l 所示。其条带强度基本和检测D N A 浓度一致。图2-1K l 方法抽提基因组D N A 电泳图结果显示，1 0 0 m l 外周血提取基冈组D N A，N a l 方法提取的D N A 略微偏低；两种K I 方法提取基因组D N A，O D 值适中，D N A 含鼍较高，但加入酚与否筹别不大。5 0 0 m l 外周血提取基因组D N A，N a l 方法与K I 方法O D 值普遍偏低而改进后的K I 方法在除蛋

38、白步骤中加入了饱和酚，降解蛋白的能力增强，O D 值普遍在1 8 2 1 之间，D N A 浓度也较高，具有明显优势。与常规盐析法、酚氯仿比较，这种方法抽提质量高，操作简便，成本低廉，可望成为基因研究中较为理想的方法。-2 0 第一章二维S N P 检测芯J 的制蔷t j 优化2 3 2 不同修饰玻片杂交结果的比较1 双色荧光检测s N P 的原理激光扫描仪分别获取C y 3 扫描图与C y 5 扫描图，进行叠加后，对于C y 3 野生犁纯合子，c y 3 扫描图有信号，C y 5 扫描图没有信号，叠加图显示绿色；对于C y 5 突变型纯合子，C y 5 扫描图有信号，C y 3扫描图没有信号

39、，番加图显示红色；对于杂台子，c y 3 和C y 5 都有信号，叠加后显示信号为黄色(如图2 2 所示)。因此。根据叠加图的颜色即可实现对样品的分型。C，3C abc图2 2 双色荧光检测S N P 的原理示意图：a 野生纯合子：b 杂合于：c 突变纯合子2 不同修饰玻片杂交结果比较氨基、醛基、P L L 修饰玻片的杂交结果如图2 3(A-C)所示。空白对照的吸附探针已被清除掉，根据叠加固上点的颜色，我们得到如图2-4 所示的分犁结果，从中选取l 一1、4-2、8 1 4 三个样褊采用3 7 7 型测序仪(英俊公司)进 一测序，结果与我们的分型结果一致。将阵列中1 8 个野生纯合子(c C)

40、的信号荧光强度与背景荧光强度分别取均值，氦基、酵基、P L L三种修饰基底的比较结果如幽2-5 所示。酵基修饰的信号强度与背景强度都最高，P L L 修饰次之，氨基修饰的强度最低。相应的数点图(图2-3，D F)表明，醛基修饰玻片对三种基因型的区分最有效，氨基修饰玻片对于部分C C 基因型的区分不太明显，P L L 修饰玻片的区分最差，且样品的均一性不好。图2 3 不同修饰方法的杂交结果比较：A，氟基修饰；8 醛基修饰：CP L L 修饰；D 氨基修饰玻片杂交信号散点图；E 醛基修饰玻片杂交信号散点圈：F P L L 修饰玻片杂交信号散点围2 1 东南大学硕士学位论文样品位置234C CC r

41、C Cc r_ 2c rc r荫性C C3C Tc Tc cC C4C C盟C CC Cc cT r6C Cc r盯C C7C rT rC CC C8c cC Cc cT fAB图2 _ 43 2 个样品的S N P 分型结果示意图(A)及其中3 个样品的3 7 7 型测序仪测序结果(B)t y p$“h w“图2 5 氧基、醛基、P L L 修饰玻片信号强度、背景强度比较示毫图2 3 3 不同长度的P C R 产物杂交比较四种不同长度的P C R 产物闽定于醛基修饰的玻片，杂交的结果显示：长度为5 5 7 b p 与3 9 5 b p 的P C R 产物杂交的信号分型不明确：长度为1 3 5

42、 b p 的P C R 产物在杂交后清洗过稃中有点脱离现象，杂交信号较弱：长度为1 9 8 b p 的P C R 产物杂交信号强且分犁准确。我们分析其原因在于：过长的D N A在变性过程中可能会变性不完全，从而导致探针结合不牢固，杂交信号弱：过短的D N A 则易在变性与杂交后清洗过程中冈固定不牢固而发生脱离现象。对于醛基修饰玻片这种二维芯片米说，长度为2 0 0 b p 左右的产物l 古l 定与杂交的结果较好。-2 2 誊Iu：x第二章二维S N P 检测芯片的制备与优化2 4 讨论1 不同化学修饰玻片的固定原理不同，影响了P C R 产物的同定效率和稳定性，以及杂交的效果【”。1)氨基修饰

43、玻片：A P T E S 处理过的玻片上修饰有氨基，在中性条什下，带正电荷；D N A 的每个碱基上都有带负电荷的磷酸基，可与氢基以离子键的方式结合。通过紫外线(U V)照射后，D N A 胸腺嘧啶残基与烷基胺上的碳之间以自由基作用形成1 E 特异偶联。氨基化玻片通过这种静电作用或非特异性共价结合的方式，可使核酸样晶稳定地固化在玻璃表面(如图2-6 示)。因氨基修饰玻片处理方便，操作简单，这种固定核酸的方法是我们实验室前期工作的主要选择。但这种固定方式是随机性的，即P C R 产物上任意位置碱基都可与玻片上的氮基结合，一方面会提高崮定的强度，另一方面，已经固定上的D N A 可能会形成空间位阻

44、影响后续闯定的D N A，且固定不稳定，尤其是高温变性过程中产物易脱落，重复性较差。忡2 p 叼一稍叼降翱r冉嗨H H 2。毒图2 7 核酸固定于P L L 修饰玻片的原理示意围2 3 东南大学硕士学位论文3 1 醛基修饰玻片：戊二醛是一个双功能团，可通过其两个醛基分别与两个不同或相同的分子上的氨基键合，以五碳链形式将两个分子连接起来。中性、室温条件下，酵基与氨反应形成S c h i f f 碱，戊二醛浸泡过的氨基玻片上，戊二醛作为双功能偶联试剂一端联接玻片上的氨基，一端联接修饰有氨基的D N A 分子，实现核苷酸的固定(如图2-8 示)。一o Il卜n、lI一。一s|-t e l l；，N

45、m+牌I 曲I)I _ _ c _ 毒；一。一s 1(c m I l-c f c 地】一c H卜o 孓一i 州I m r 蕊羹图2-8 核酸固定于醛基修饰玻片的原理示意图这种方法固定和杂交效率高，扫描信号比较饱满，强度和外形上都优于另外两种玻片，虽然背景荧光强度较高，但经封闭液作用后，信嗓比可大大提高，优势更为明显。对于蚝度为2 0 0 b p左右的D N A 片断，已固定上的产物对后续固定产物造成的空间位阻影响比较小，因此可以采取醛基修饰玻片进行S N P 位点的有效分型。2 氨基修饰P C R 产物固定于醛基修饰玻片上，与双色荧光标记探针进行杂交的方法对于实现高通鼋的S N P 分犁还存在

46、一些不足和需要改进的地方。1)为达到一定的核酸固定量。一般需要2 0 0l ll 左右的P C R 产物，浪费模板D N A 与试剂；2)产物需经纯化处理才可进行点样，既增加了实验繁琐性，又会造成产物的损失，因此导致杂交质量难以监控；3)这种方法对P C R 产物的崮定是二维结构，单层组装的D N A 微阵列很容易受到外界条件的影响，包括灰尘、化学试剂成分的细微变化等条件均可能影响芯片制备的质量与杂交时探针的吲定效率，因而芯片的重复性和稳定性成为一个重要问题。4)杂交后采用缓冲液洗涤进行S N P 分型的方法，容易造成探针甚至样品脱落，从而无法有效区分单碱基错配。进行高通量分析时，由于不同样本

47、的有效固定量不同，这一现象尤其明显，影响了检测的可靠性。5)硬质玻璃为载体的D N A 芯片是在固一液界面发生杂交反应，其真实性和可靠性及反应效率比液。液反席环境有较大的差距。因此有必要发展种新的核酸嘲定方法，提高基囚芯片方法进行S N P 分型的重复性、稳定性及高效性。-2 4-第三章基于三维凝胶的高通量S N P 检测芯片的制备与优化第三章基于三维凝胶的高通量S N P 检测芯片的制备与优化3 1 聚丙烯酰胺凝胶3 1 I 聚丙烯酰胺凝胶的形成3 1 II 聚丙烯酰胺凝胶的形成原理丙烯酰胺(a c r y l a m i d e，A M)是一种不饱和酰胺。其单体为无色透明片状结晶，易溶于水

48、、甲醇、乙醇、丙醇，稍溶于乙酸乙酯、氯仿，微溶于苯，在酸碱环境中可水解成丙烯酸。丙烯酰胺分子具有两个活性中心，兼具弱酸性和弱碱性，其分子结构如图3 1 示。H，c 夕。H c 夕ofN H 2a c r y l a m=d e图3 1 丙烯酰胺分子结构示意图丙烯酰胺单体在室温下很稳定，但当处于熔点或以上温度、氧化以及紫外线照射时，丙烯酰胺和交联剂在催化剂的作用下很容易发生聚合反应形成聚丙烯酰胺凝胶。其中，交联剂是N N 甲叉双丙烯酰胺(N，N 一m e t h y l e n e-b i s(a c r y l a m i d e)，B i s)，催化刑包招引发剂与加速剂。引发剂在凝胶形成中提

49、供始自由基，通过自由基的传递，使丙烯酰胺单体成为自由基，发动聚合反应，加速剂则可加快引发剂释放自由基的速度。聚合作用可以通过两种方式来实现。化学聚合反应中，引发剂为过硫酸铵(N H 4)2 S 2 0 8，A m m o n i u m p e r s u l f a t e，A P S)，加速剂为N，N N，N 一四甲基乙二胺(t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e，T E M E D)或1 3-二甲基胺基丙晴(D M A P N)。T E M E D(或D M A P N)的碱基催化A P S 产生氧自由基，激活单体形成自由基

50、，通过B i s 的架桥作用使单体发生聚合(图3 2)。化学聚合形成的凝胶孔释较小，重复性好。光聚合反应中，引发剂为核萸素(V B 2)，在痕量氧存在F，经强光照射反应液，V B 2 光解形成无色墓，无色基再被氧氧化成自由基，激活单体发生聚合。光聚合形成的凝胶孔行较大，很不稳定。2 5 东南大学硕士学位论文AB图3-2 丙烯酰胺聚合反应的化学式(A)及反应过程(B)示意图3 1 12 聚丙烯酰胺聚合反应的影响因素1 大气中的氧能淬灭自由基，使聚合反应终止，所以在聚合过程中要使反应液与空气隔绝2 某些材料如有机玻璃，能抑制聚合反应：3 某些化学药物可以减慢反应速度，如赤血盐；4 温度高聚合快，温