四棱豆乳酸发酵饮料的研制.pdf

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1、465技术应用食品科学2010,Vol.31,No.18四棱豆乳酸发酵饮料的研制肖卓炳1，陈 上2(1.吉首大学 林产化工工程湖南省重点实验室，湖南 张家界 427000；2.吉首大学化学化工学院，湖南 吉首 416000)摘 要：以四棱豆为主要原料，用驯化的乳酸菌种进行发酵制备四棱豆乳酸发酵饮料，实验结果表明制作的最佳工艺条件为按豆水比1:10 磨成豆浆，加入8%(m/m)的蔗糖，经85、20min 灭菌，冷却后接入经豆奶驯化好的乳酸菌剂3%(V/V)，置于4244恒温发酵 3.5h，再置于46冰箱中后熟6h，即成营养丰富、酸甜适中的四棱豆乳酸发酵饮料。关键词：四棱豆；发酵；饮料；研制Pre

2、paration of Fermentation Beverage with Winged BeanXIAO Zhuo-bing1，CHEN Shang2(1.Hunan Provincial Key Laboratory for Forest Products and Chemical Industry Engineering,Jishou University,Zhangjiajie 427000,China；2.College of Chemistry and Chemical Engineering,Jishou University,Jishou 416000,China)Abstr

3、act：Winged bean was used as the major raw material to prepare fermentation beverage through Lactobacillus fermentation.Results indicated that optimal preparation processing conditions were bean-water ratio of 1:10 for milling,sterilization for 20min at 85 after the addition of sucrose 8%(m/m),3%(V/V

4、)inoculation amount of Lactobacilli in cooling milk,fermentationat 4244 for 3.5 h,and mature at 46 6 h in refrigerator.A nutritious fermentation beverage of winged bean with mildsour and sweet taste was obtained.Key words：winged bean；fermentation；beverage；processing中图分类号：TS224.4 文献标识码：B 文章编号：1002-66

5、30(2010)18-0465-06收稿日期：2010-05-23基金项目：湖南省教育厅科学研究项目(08C670)；湖南省科技厅项目(2009FJ3045)作者简介：肖卓炳(1961)，男，教授，硕士，主要从事食品和材料科学研究。E-mail：四棱豆(Psophocarpus tetragonolobus(L.)D.C.)属一年生或多年生，蝶形花亚科，缠绕草本豆科植物，其种子、块根、嫩荚、花、茎、叶均可食用，全身富含人体必需的多种营养成分。其种子含有丰富的优质蛋白质、不饱和脂肪酸、矿质元素、维生素以及多种生物活性物质等营养成分，具有降低血清胆固醇水平作用和维系人类脑进化的生命核心物质，对心脑

6、血管疾病具有预防作用，能够有效地抑制血栓性病症，预防心肌梗塞和脑梗塞，降低血脂，降低血压，抑制出血性中风，抑制癌症的发生和转移，并且具有增长智力、保护视力、延缓衰老等功效，对人体具有重要营养保健作用，有“绿色的金子”、“奇迹植物”和“长寿菜”之称 1-4。由于四棱豆的营养价值、经济价值和药用价值，它已引起全世界的重视和研究，成为许多国家争相开发利用的植物资源，专业人士对四棱豆及其制品的研究也越来越多，但是我国对四棱豆的研究，还仅限于品种引种栽培实验和植物生理学等方面，鲜有涉及将其应用于食品加工行业。为了开发新的植物蛋白资源，给四棱豆的深加工提参考，本研究拟采用有益于人体健康的乳酸菌对豆浆进行发

7、酵，以期获得一种口味极佳、风味特殊、营养丰富且易被广大消费者吸收利用的新型四棱豆发酵乳饮料。1材料与方法1.1材料与试剂四棱豆由湖南怀化学院提供；蔗糖、脱脂奶粉(蛋白质含量 32%)、碳酸氢钠、柠檬酸、蛋白胨、乳糖、猪胆盐、溴甲酚紫、磷酸二氢钾、琼脂、伊红美兰(均为食品级)市购。供试菌种：保加利亚乳杆菌(L a c t o b a c i l l u sbulgaricus)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)，由吉首大学食品科学研究所提供。1.2仪器与设备 2010,Vol.31,No.18食品科学技术应用466SZX-ZP 型标准型净化工作台 上海整新电子厂

8、；YXQ-LS-50SI型立式蒸汽灭菌器 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；TG328B 型电子分析天平 湘仪天平仪器厂；PHS-2F型精密 pH 计 上海精密科学仪器有限公司；5415D 型台式离心机 德国Effendorf公司；DNP-9082 型电热恒温培养箱 郑州南北仪器设备有限公司；SHY-2A型水浴恒温振荡器 金坛市瑞华仪器有限公司；TCL216型电冰箱 广东 TCL 集团；高剪切混合乳化机 南通克莱尔混合设备有限公司；XSP-18A 型显微镜 江南光学仪器厂。1.3培养基的制备51.3.1乳酸菌培养活化用培养基脱脂乳培养基：将新鲜牛乳在 5000r/min 离心15min，去掉上层

9、油脂，再用 108灭菌 15min。1.3.2大肠菌群测定用培养基乳糖胆盐发酵管：蛋白胨 20g、猪胆盐 5g、乳糖10g、0.04%溴甲酚紫水溶液 25mL、蒸馏水 1000mL，pH7.4。115高压灭菌 15min。伊红美兰琼脂：蛋白胨 10g、乳糖 10g、磷酸二氢钾 2g、琼脂 17g、2%伊红 Y 溶液 20mL、0.65%美兰溶液 10mL、蒸馏水 1000mL，pH7.1。121高压灭菌 15min。乳糖发酵管：蛋白胨 20g、0.04%溴甲酚紫水溶液35mL、乳糖 10g、蒸馏水 1000mL，pH7.4。115高压灭菌 15min。1.3.3致病菌检测用培养基按 GB/T

10、4789 2003食品卫生微生物学检验5有关部分要求配制。1.4发酵饮料生产工艺流程四棱豆除杂、选豆浸泡脱皮酶钝化磨浆过滤配料(加蔗糖、脱脂奶粉)均质杀菌冷却、接种装杯发酵成熟检验成品1.5乳酸菌发酵剂的制备1.5.1乳酸菌种的活化将实验室提供的原始菌种在无菌操作条件下分别移接到灭菌的鲜牛乳中，接种量为 1%(V/V)，混合均匀后，在 4244的恒温生化培养箱中培养 45h 至凝乳，如此连续多次培养活化，直到牛乳凝固快速、呈“豆腐脑”状而无乳清析出为止，置于 46冰箱内保存，备用 6。1.5.2乳酸菌种的驯化将豆乳与牛乳按 1:9、2:8、4:6、6:4、8:2、9:1的体积比配成6 种培养基

11、(总体积为 10mL)，用20mm 200mm大试管分装(每管装10mL)，于0.1MPa灭菌20min，冷却至室温，接种活化好的菌种1%(V/V)，于4244的恒温生化培养箱中培养 45h，直至试管中豆乳牛乳混合培养基凝固呈“豆腐脑”状。按豆乳含量由低到高逐步驯化培养使其发酵能力达到最大且稳定。待其驯化好后按 1:1 的比例接种混合培养，制成混合菌发酵剂，为后续实验用 7。1.6豆乳的制备1.6.1四棱豆的浸泡称取 0.5、1、1.5g 碳酸氢钠用适量水溶解后，分别在1L 的容量瓶中定容，配成质量分数0.05%、0.1%、0.15%的碳酸氢钠溶液，挑选无霉变、虫蛀的四棱豆粒，然后称取适量四棱

12、豆用 0.05%、0.1%、0.15%等 3种不同质量分数的碳酸氢钠溶液进行浸泡(浸泡液体积为四棱豆质量的 23 倍)，以不加碱液者为对照，浸泡时间均为 10、12、14h 等 3 个不同的时间段，各设 3 个重复处理8，观察不同碱液及浸泡时间对四棱豆脱皮效果，确定四棱豆的最佳浸泡脱皮工艺。1.6.2四棱豆的脱皮浸泡后的四棱豆用手搓法脱皮，使四棱豆外皮脱除。1.6.3四棱豆的脱腥四棱豆的脱腥主要采取热烫脱腥法9。将脱皮后的四棱豆粒分别采用“热水处理法”、“酸处理法”、“碱处理法”3 种方法脱腥。(a)热水处理法：将浸泡好的四棱豆预先在8590的热水中浸泡510min，然后热水法磨浆；(b)酸处

13、理法：磨浆前将四棱豆置于 pH 值为 3.04.5 的柠檬酸溶液中浸泡，然后利用热水磨浆；(c)碱处理法：磨浆前将四棱豆置于pH 值为 8.09.0 的碳酸氢钠溶液中，然后配合使用热水磨浆。磨浆时加入适量 8590的热水进行磨制，重复磨浆一次，以提高细度，利于蛋白质溶出，再将磨出的豆浆过滤，滤出豆渣后将豆浆再煮沸，以达到钝化脂肪氧化酶的作用，进一步消除四棱豆中的豆腥气味。1.6.4豆水比的确定将四棱豆与水按1:8、1:10、1:12、1:14(g/mL)不同比例混合，磨浆杀菌后，接入菌种发酵，测定其 p H值，通过 pH 值与感官确定豆与水的最适比例10。1.6.5加糖量的确定在备好的豆浆中分

14、别添加 4%、6%、8%、10%、12%(m/m)5 种不同量的蔗糖，杀菌后，接入4%(V/V)的菌剂进行发酵，经感官评定确定蔗糖的最佳添加量11。1.6.6豆乳的调配将磨制好的豆浆分别加入为 0%、5%、1 0%、15%、20%(V/V)5 种不同量的牛乳，再向每组豆乳、牛乳的混合料中加入 8%的蔗糖，杀菌后，接入 4%(V/V)的菌种进行发酵。再通过发酵后的感官评价确定发酵豆乳中的牛乳添加量12。467技术应用食品科学2010,Vol.31,No.181.6.7豆乳的均质将调配好的豆乳分别预热至 75、80、85、90 4种不同的料温，再在 20MPa 条件下进行均质13。1.6.8豆乳的

15、灭菌将调配好的豆乳采用适当的方法灭菌。本实验采用两种灭菌方法：(a)121灭菌 10min；(b)85灭菌20min14。1.7豆乳的发酵1.7.1乳酸菌剂接种量将驯化扩大活化好的乳酸菌剂按 1%、2%、3%、4%(V/V)4 种不同的接种量接种于灭菌好的豆乳中，均各设置 3 个平行处理，以其发酵凝乳后的产品的感官评价来确定最适的接种量15。1.7.2豆乳的发酵温度将接种后的豆乳置于 38、39、40、42、43 5种温度下进行发酵3.5h，以其发酵凝乳后的产品的感官评价来确定最适的发酵温度16。1.7.3豆乳的发酵时间的试验将接种后的豆乳在 42条件下发酵5.5、4.5、3.5、2.5h，以

16、其发酵凝乳后的产品的感官评价为指标来确定最适的发酵时间17。1.7.4后熟将发酵好的豆乳置于 4冰箱中保存，在冷藏期间，酸度会有所上升，同时风味成分含量增加，此为后发酵，又叫后熟，时间不少于 6h。1.8四棱豆发酵饮料的最佳配比豆乳中牛乳的含量、蔗糖的添加量、四棱豆与水的比例和菌种的接种量直接影响到产品的口感、气味、色泽等指标，为此根据上述试验结果进行四因素三水平的正交试验18。产品的感官评价方法见表 1。得分凝乳状态色泽香味口感2520凝乳好色泽好香味好口感细腻、爽口2015凝乳一般色泽较深香味较淡口感一般1510凝乳差色泽深香味淡、无口感粗糙表1 感官评价标准Table 1 Standar

17、d of sensory evaluation1.9理化指标的测定方法固形物含量采用重量法测定；蛋白质含量采用凯氏定氮法测定；脂肪含量采用索氏提取法测定；酸度的测定方法采用梯涅尔测定法19。1.10微生物质量的测定方法乳酸菌数、大肠菌群、致病菌按GB/T 4789 2003食品卫生微生物学检验标准相关部分进行测定5。2结果与分析2.1乳酸菌种驯化结果采用豆乳含量由低到高进行发酵以逐步驯化达到菌种发酵能力达到最大且稳定目的。试验结果见表 2。注：“+、”表示凝乳效果的评价，+越多表示凝乳越好，越多表示凝乳越差，有乳清释出。比例1:92:84:66:48:29:1凝乳效果+表2 乳酸菌种驯化试验结

18、果Table 2 Results of Lactobacillus species domestication注：+.脱皮效果好，“+”越多表示脱皮越好；.脱皮效果较差。碱液质量浸泡时间/h分数/%1012140+0.05+0.1+0.15+表3 不同浓度碱液处理对四棱豆脱皮的效果Table 3 Effect of alkaline solution with various concentrations on thepeeling of winged bean脱腥方法豆渣含量/%色泽脱腥得分风味等级热水处理法23.5黄白色85良好酸处理法25黄白色84良好碱处理法20乳白色90优秀表4 不同

19、豆乳脱腥方法的结果Table 4 Results of soymilk deodorization using different methods由表2 可以看出，通过对乳酸菌种的驯化试验，以感官评价为指标可以得出：乳酸菌种在豆乳与牛乳体积比为 8:2 的培养基中凝乳效果最好。2.2不同方法对四棱豆脱皮的效果不同的碱溶液浓度及浸泡时间对四棱豆脱皮效果有所不同，采用不同的碱液浓度溶液对四棱豆进行浸泡脱皮处理实验，观察其脱皮效果，结果见表 3。由表 3 可知，利用 0.1%碳酸氢钠溶液浸泡 12h 可以达到最佳的脱皮效果。2.3不同脱腥方法产品品质的影响四棱豆一经加工处理，其含有的脂肪氧化酶能迅速

20、催化脂类底物发生氧化作用，生成乙醇、乙醛和乙烯酮等，使得豆浆产生特殊的豆腥味，极大地影响了酸豆奶的风味，本实验分别采用了热水处理法、酸处理法、碱处理法 3 种方法进行脱腥处理，不同脱腥方法对豆乳感官品质影响的结果见表 4。2010,Vol.31,No.18食品科学技术应用468豆水比例(g/mL)pH凝乳状态色泽风味等级1:85.1状态较好黄色良好1:105.15状态较好淡黄色优秀1:125.2出现分层淡黄色良好1:145.3出现分层淡黄色中等表5 不同豆水比例对豆乳发酵的影响结果Table 5 Effect of bean-water ratio on soybean milk fermen

21、tation由表 4 可知，采用碱处理法，再结合热磨浆法可以达到较好的脱腥效果，即先用 pH 值为 8.09.0 的碳酸氢钠溶液浸泡 12h，再加适量的 8590的热水磨浆，其脱腥效果最佳。2.4不同的料水比对产品品质的影响豆浆配制中的豆水比与产品品质密切相关：如果磨制时加水量过少，不利于蛋白质的提取，并且生产的成品凝固结实、不易吸饮，口感粗糙；如果加水量过大，成品不易凝固，香味淡，口感不柔和，风味差。由于浸泡四棱豆时，干四棱豆吸收了部分的水分，故磨浆时加入的磨浆水均以原料的干质量为标准，豆水比例为原料干质量与加入水的体积比(g/mL)。本实验通过pH 值与感官确定豆与水的最适比例，结果见表

22、5。表 5 表明，豆与水的比例为 1:10(g/mL)时，比较适合乳酸菌的发酵，并制品口感、状态、风味良好。2.5不同的加糖量对产品品质的影响酸豆奶制作中的加糖量非常重要，如果加糖量过多，渗透压过大，能抑制乳酸菌的生长；加糖量过少，则不能满足乳酸菌对碳源的需要，同时也影响产品的风味口感。本实验对添加不同量蔗糖的产品进行感官评定，其结果见表 6。加糖量/%酸豆乳的感官评价评分(满分为10 分)4酸味、甜味差7.06酸味差、甜味较差7.58酸甜味较适宜9.010酸味适宜、甜味较重8.512味偏酸、甜味重8.0表6 不同加糖量对产品品质的影响结果Table 6 Effect of sucrose a

23、mount on product quality注：产酸量是发酵完毕后测定的 pH 值。牛奶添加量/%05101520感官品质 豆腥味重 豆腥味较重 豆腥味较少 豆腥味较少 豆腥味较少硬度大硬度大硬度较大硬度适中硬度较小产酸量5.65.45.14.84.4表7 豆浆中牛奶添加量对产品品质的影响结果Table 7 Effect of milk amount on product quality由表 6 可知，豆乳中最适合的加糖量是 8%(m/m)。2.6豆浆与牛乳的配比对产品品质的影响豆浆发酵时添加牛乳可改善成品的口感风味，但更重要的是为了保证乳酸菌的良好生长。四棱豆酸奶虽有类似酸牛奶的凝乳状态

24、，但与酸牛奶相比，其口味较淡，口感不细腻，香味不足。发酵后产品品质见表 7。由表7 可知，豆浆与牛乳的配比以8.5:1.5 为最佳，经乳酸菌发酵后可以获得感官状态，口感较优的产品。2.7均质温度对豆浆口感和色泽的影响均质的温度对豆浆的口感和色泽的影响也很大，四棱豆在磨浆后，经不同温度进行均质、煮沸后进行感官评价，结果见表 8。均质温度/75808590色泽黄色淡黄微黄微黄口感细腻细腻很细腻很细腻表8 均质温度对豆浆口感和色泽的影响结果Table 8 Effect of homogenization temperature on taste and color ofsoybean milk由表

25、8 可知，当均质温度小于 85时，随均质温度升高色泽逐渐变浅，当均质温度大于 85时，豆浆色泽变化不明显，均质温度在85和90时口感很好，综合考虑到能耗和成本，选择最适的均质温度为 85。2.8不同的灭菌条件对产品品质的影响制作发酵饮料，在接入发酵菌种前一定要进行杀菌处理。由于蛋白质遇热容易变性，所以生产过程中对加热温度应严格控制。不同的灭菌条件对产品品质的影响见表 9。灭菌方法凝乳状态色泽气味凝乳时间/h高温高压灭菌良好黄色香味淡5巴氏灭菌好淡黄色有香味3.5表9 不同的灭菌条件对产品品质的影响Table 9 Effect of sterilization condition on prod

26、uct quality由表9 可知，豆乳采用巴氏灭菌(85、20min)，既可以制得品质良好的酸豆奶，同时还可以减少生产成本。2.9不同接种量对产品品质的影响产品发酵时接入的菌种用量过大，发酵快，产酸快，培养时间短，但成品风味不佳，口感粗糙、有砂粒感；相反，接种量过少，则发酵时间过长，成品有酸败味，并且有较多的乳清析出。因此，确定接种量是生产的一个关键，本实验选取不同接种量，发酵后对成品进行感官评价结果如表 10 所示，由表 10 可知，配料发酵时最适宜的接种量为 3%(m/m)。469技术应用食品科学2010,Vol.31,No.18接种量/%1234凝乳时间/h64.53.53.5酸味酸味

27、差酸味较差酸味适宜偏酸凝乳状态差良好好好口感柔和柔和柔和较粗糙表10 不同接种量对产品品质的影响结果Table 10 Effect of inoculation amount on product quality发酵温度/硬度甜度酸味38较硬淡偏酸39较硬淡较酸40适中适中酸味适宜42适中适中酸味适宜43适中适中酸味较淡表11 不同的发酵温度对产品品质的影响Table 11 Effect of fermentation temperature on product quality发酵时间/h 凝乳状态甜度酸味乳清析出5.5凝固较好，但偏硬淡偏酸有乳清析出4.5凝固较好适中偏酸有乳清析出3.5凝

28、固好适中适中无乳清析出2.5出现分层适中淡无乳清析出表12 不同的发酵时间对产品品质的影响Table 12 Effect of fermentation time on product quality因素水平123A 牛乳含量/%51015B蔗糖/%6810C 接种量/%123D四棱豆:水1:81:101:12表13 正交试验因素与水平Table 13 Factors and levels of orthogonal experiments试验号ABCD综合评分111115821222803133370421236652231906231270731328683213609332182K120

29、8210188230K2226230228236K3228222246196k169.337062.6776.67k275.3376.677678.67k376748265.33R6.676.6719.3313.34表14 L9(34)正交试验设计及结果Table 14 Result of L9(34)orthogonal experiments2.10 不同的发酵温度对产品品质的影响由表 11 可知，发酵温度为 42，产品的外形、口感均较好。2.11 不同的发酵时间对产品品质的影响表 12 表明，发酵时间为 3.5h，产品的外形、口感均较好。2.12 四棱豆发酵饮料配方的正交试验根据单因素试

30、验结果，选取每个因素的最佳效果值的上、下(左、右)各一个值(数)，作为饮料配制时正交试验中各因素的 3 个水平，其设计方案见表 13。由表 14 可知，4 个因素的主次关系为：C D A=B。最佳水平组合为 A3B2C3D2，即牛乳含量 15%、蔗糖添加量 8%、接种量 3%、四棱豆与水的比例 1:10。在最佳水平条件下进行实验，并对结果进行综合评分，结果为 92 分。2.13 产品的感官评定、理化和微生物检测色泽：呈均匀一致的乳白色、稍微黄。风味：具有豆奶和酸牛奶的复合香味，酸甜爽口适中，无异味。组织状态：细腻均匀，不分层，无乳清析出。蛋白质含量 3.02%、脂肪含量 2.0%、酸度 88

31、T。乳酸菌活菌数 7.9 106CFU/mL、大肠菌群数3MPN/100mL、致病菌未检出。3结 论本实验研制了一种口味极佳、风味特殊、营养丰富且易被广大消费者所容易吸收利用的、新型四棱豆发酵饮料。通过单因素和正交试验确定了四棱豆发酵饮料制作的最佳工艺条件为用质量分数0.1%碳酸氢钠溶液浸泡四棱豆12h 后脱皮，用pH 值8.09.0 的碳酸氢钠溶液浸泡12h 来钝化四棱豆的脂肪氧化酶，再用85的热水进行磨浆，豆水比例为 1:10(g/mL)，牛乳含量为 15%(V/V)，加蔗糖量为 8%(m/m)，采用巴氏灭菌(8 5，20min)，接种量为 3%(V/V)，发酵温度为 42，发酵时间为 3

32、.5h，能制得色泽、风味、状态均较好乳酸发酵豆乳。参 考 文 献：1全妙华.四棱豆的营养保健作用与开发利用J.中国食物与营养,2006(3):49-50.通过正交试验和感官评价对四棱豆发酵饮料的配方进行研究。其试验结果见表 14。2010,Vol.31,No.18食品科学技术应用4702ADEBOWALE Y A,ADEYEMI I A,OSHODI A A.Functional andphysicochemical properties of flours of six Mucuna spesiesJ.AfricanJournal of Biotechnology,2005,4(12):14

33、61-1468.3李娘辉,徐颂军,刘静艳.四棱豆的营养价值和利用J.华南师范大学学报,1996(2):84-89.4IGENE F U,OBOH S O,ALETOR U A.Effects of some processingtechniques on the functional properties of winged bean seed floursJ.Jorunal of Food,Agriculture and Environment,2005,3(2):28-31.5GB/T 4789 2003 食品卫生微生物学检验S.北京:中国标准出版社,2003.6王欣德.多菌种发酵饮料的研

34、究J.食品科学,1989,10(6):18-20.7杨洁彬.乳酸菌:生物学基础和应用M.北京:中国轻工业出版社,1996:88-92.8郭兰兰.酸豆奶生产工艺的研究J.安徽农业科学,2003,31(2):337-338.9贺长生.发酵豆奶饮料生产工艺J.食品科学,2002,23(2):29-30.10马涛.乳酸发酵豆奶研究J.塔里木农垦大学学报,1997(1):34-39.11黄书铭.发酵豆奶的生产工艺和营养研究J.中国食品工业,1999(6):42-43.12张钟,扬宏顺,章绍兵,等.玉米酸豆奶的研制J.农业工程学报,2001,17(5):135-138.13毛健,马海乐.富硒灵芝酸豆奶的研

35、制J.食品科学,2009,30(22):406-411.14黄亮.功能性酸豆奶的研制J.食品与机械,2004,20(6):49-51.15邵伟,张亚雄,熊泽,等.双歧杆菌发酵酸豆奶的研制J.食品工业科技,1999,20(6):38-39.16蒋立文,付海平.发酵型含醇酸豆奶的研制J.食品科技,2001(3):43-45.17黄卫文,王俊,李安平,等.发酵型薏米酸豆奶的研制J.食品与机械,2009,25(4):121-123.18王钦德,杨坚.食品试验设计与统计分析M.北京:中国农业大学出版社,2003:330-435.19QB/T 2132 2008 植物蛋白饮料豆奶(豆浆)和豆奶饮料S.北京:中国轻工业出版社,2008.