浓香型白酒糟醅中真菌菌群的多样性分析.pdf

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1、第3 8 卷第5 期四川大学学报(工程科学版)v 0 1 3 8N 0 52(x)6 年9 月J 0 u R N A LO Fs l c H u A Nu N I V E R s n Y(E N G I N E E R I N Gs c I E N c EE D m 0 N)s e p t 2 0 0 6文章编号：l 0 0 9-3 0 8 7(2 0 0 6 1 0 5 珈9 7 旬5浓香型白酒糟醅中真菌菌群的多样性分析张文学1，乔宗伟1，胡承2，王忠彦2(1 四川大学食品工程系，四川成都6 1 0 0 6 5；2 四川大学生物工程系，四川成都6 l 0 0 6 4)摘要：为了弄清中国浓香型

2、白酒发酵糟醅真菌微生物优势菌群的系统发育规律，对不同发酵时间糟醅样品的微生物1 8 sr D N A 进行了P c R 克隆分析和同源性比较。研究发现糟醅中心样品以风m c k 以缸、死k r D r，巧傥s、A p B 唧f f 淞和E 啪i 啪等4 属的真菌为主要优势菌，分别占全部真菌D N A 克隆数的2 8 6、1 6 9、1 4 3、2 6 o；风口t c k 加梳属酵母菌主要出现在发酵前中期，死如r D m，属霉菌主要出现在发酵前期且在发酵过程中保持一定数量的存在，却e 曙f f f 淞属霉菌则从发酵中期开始数量逐渐增多，眈r o i 帆属霉菌在发酵中后期在数量上占有绝对多数。主要

3、优势真菌的菌群变化及生物学特征说明其代谢活动与浓香型白酒糟醅发酵中大分子物质的降解及白酒风味物质的形成密切相关。关键词：浓香型白酒；窖池糟酷；P C R；生物多样性；真菌菌群中图分类号：r s 2 6 1 1文献标识码：AF u n g a lD i v e r s i t yo fF e r m e n t e dG r a i 璐D u r i n gt h eP r o d u c t i o no fC h i I I e s eS t r o n gA r 哪a t i cS p i r i t s勿烈G 耳龟n 喝獬1，Q M Dz o 昭一加反1，日uc 阮，#，黝?Gz 幻增加

4、n 2(1 D e p t o f f 捌E n g，s i c h u a I lu n i v，C h 蜘g d u6 1 0 0 6 5，c h i n a；2 D e p l o f B i o e n g，s i c h u 吼u n i v，C h e n g d u6 1 0 0 6 4，C h i l l a)A b s t r a c t：T 0p r o b et l ef u n g a lc o m m u n i t i e si nf e m e n t e dg m i n s，c l o n ea n a L l y s i sa I l dp h y l o

5、g e n e t i ct r e e0 f1 8 Sr D N Af h g m e n t sw e r et a k e na f t e ru s i n gP C R 锄p l i f i c a t i o no ns 踟p l e so ft l l ef u n g a lc o m m u n i t yi nc e n t e ro ff e 瑚e n t e dg r a i n sf I 砌d i f f e r e n tf e I m e n t a t i o nt i m e n er e s u l t ss h o w e dt l l a 4g e n

6、e r ao ff u n 舀s u c ha s 缸口砌肌姚，死如r。哟，-唧，却e r g 以琊a n dE n r D i“ma r em a i nd o m i n a I l tc o m m u I l i t i e s，出e yt a k e2 8 6，1 6 9，1 4 3 a n d2 6 0 o fa l lc l o n e s，r e s p e c t i v e l y，a n dg e n u s 厶s 口c k 以玩a n dg e n u s 死Z 口r o m y c 船e x i s t e dm a i n l yi ni n c i p i e n

7、 tp e r i o d0 ff e 珊e n t a t i o n，b u ts o m es t m i n so fg e n u sT a l a I o m y c e sa l s ok e e pu pt oe n do ff e 咖e n t a t i o n，g e n u sA s p 蟛口凇b e c o m em o r e趣e r4w e e k f e 珊e n t e d，b u tg e 眦s 眈r o i H mw a sm o r e 蚰dm o r ei n 出em i d d l ea n de n dp e r i o d f e 啪e n t

8、a t i o n 弧ec h a n g et r e n da n db i o l o g i c a lc h a r a c t e ro fm a i nd o m i n a n tc o m m u n i t i e si n d i c a t e dt l l a tm e t a b o l i z i n go ft l l e s ef h n g ii s 静1 删c l o s e _ l yt 0t h ed i g e s t i 叽o fb i o m 血e c u l ei nf e m 砌1 t e dg r a i n sm l d 缸曙枷o no

9、fn a v 班i nQ 1 i n e s es n 喀跗o m a t i cs p i r i t 8 K e yw o r 凼：C h i n e s es 咖n ga r o 眦t i cs 曲t s；f e 瑚e n t e dg r a i n s；P C R b i o l o 舀c 且ld i v e r s i 哆；f u n g a lc o 姗t I I l i 哆在世界六大蒸馏酒中，中国传统白酒因其独特的自然固态发酵工艺，糟醅中的微生物区系非常复杂。糟醅中除了细菌、放线菌等原核微生物之外，还收稿日期：2 0 0 5 0 1 2 0基金项目：国家自然科学基金资助项目(3

10、 0 2 7 0 0 3 5)作者简介：张文学(1 9 6 3 一)，男，教授研究方向：食品生物技术存在大量的真核微生物，其中酵母、霉菌等真菌，是窖池中大分子物质降解和发酵产物生成的重要生力军。2 0 世纪8 0、9 0 年代，国内个别学者利用微生物常规分离鉴定方法，对中国浓香型白酒糟醅微生物区系的构成作了一些探索性研究，认为真菌类微 万方数据9 8四川大学学报(工程科学版)第3 8 卷生物主要包括霉菌类的曲霉属、根霉属、毛霉属、青霉属、链孢霉属以及酵母类的汉逊氏酵母属、酵母菌属、球拟酵母属、假丝酵母属、红酵母属、德巴利氏酵母属、针孢酵母属等。其中霉菌类以曲霉属、根霉属为主要优势菌，其数量在发

11、酵前期逐渐减少，后期又出现高峰；酵母类以酵母菌属和汉逊氏酵母属为主要优势菌，酵母菌在前期出现数量高峰后逐渐减少至消失。2 0 世纪9 0 年代，由于分子生物学方法的引入，克服了传统微生物分离鉴定方法对微生物生态学研究的局限，国外学者对海洋、土壤、植物根系、发酵食品等特定微生态作了大量的探讨汪。1，利用P c R R F L P 探讨土壤微生物的多样性J，利用P c R s s c P 考察根系微生物群落的微生态变化H J，利用P C RD G G E 进行食品质量检验L 5 j、疾病诊断瞄1 等，取得了不少应用研究成果。在最近的研究中，借助P c R D G G E 技术及P c R 一克隆分

12、析，对糟醅中优势细菌类微生物的菌系变化进行了调查研究，既对比印证了常规分离培养方法的结果，也极好地补充了窖池复杂微生态中难于培养或不能培养微生物菌系的内容0 7 J。通过对糟醅微生物1 8 S r D N A 的克隆分析和同源性比较，可望对糟醅真菌类优势微生物菌群的构成及变化趋势有更深入的了解，从而对窖池微生物与糟醅物质转化的相互关系以及主要微生物菌群的代谢机理有更清晰的认识。l 材料与方法1 1 窖池糟醅样品四川西部某名酒厂老窖池中心糟醅(窖顶以下1 5 0 一1 7 5c m，中心7 5c m 以内)，双轮底工艺，2 0 0 3年1 0 1 2 月按人窖、发酵1 周、发酵4 周、发酵1 0

13、周分期取样，3 点采样混合均匀，经真空密封后，冷冻保藏。1 2 样品总D N A 提取用1 P B S(1 3 7m m o L LN a C l，2 7m m o l LK C l，4 3m m o L LN a H 2 P 0 4 7 H 2 0，1 4 m m o l LK H：P O。)缓冲液分散糟醅样品，混匀后2 层纱布过滤，然后1 0 0 0 0r m i n 离心1 0m i n 收集菌体；加入5(C T A B)磷酸缓冲液(1 2 0 I 砌o L Lp H8 O)、玻璃珠和P h e n o l：C h l o r o f o n I l：I s o a m y lA k o

14、 h o l(2 4：2 4：1)，机械振动研磨进行细胞破碎，提取D N A；用C l o r o f 曲n：I s o a m y lA l c o h D l(2 4：1)和P h e n o l：C h l o r o f o 瑚：I s o 锄y lA l c o h o l(2 4：2 4：1)除去蛋白质，糖类等杂质；用R N A 裂解酶除去R N A；酒精沉淀D N A；D N A 沉淀经真空干燥后，溶解于l T E 缓冲液2 0 冰箱中保存。1。31 8 Sr R N A 基因片段的克隆操作及有效克隆确认E F 4(5 一G G A A G G G R T G T A T I T

15、 A T I A G 3)和E F 3(5 一T C C T C T A A A T G A C C A A G T I T G 一3)被用作P c R 扩增引物，以质粒聊B l u e 作载体，以E c o 豇D H 5 仪感受态细胞作宿主，采用w i z a r d P l u sS VM i n i p r e p sD N AP u r i f i c a t i o nS y s t e m 进行质粒提取。提取的质粒D N A 经限制性核酸内切酶H i n d 酶切处理后，以入(H i n d m)为标记D N A 进行琼脂糖电泳确认，筛选出含有目的基因片断的克隆并保留其质粒D N

16、A 作进一步的基因序列分析。1 41 8 Sr R N A 基因片段的序列分析采用D y eT e 咖i n a t o rC y c l eS e q u e n c i n gC E Q 2 0 0 0S y s t e m(B E C K M A NC O U L T E R，A m e r i c a n)和C E Q 8 0 0 0G e n e t i cA n a l y s i sS y s e m(B E C K M A Nc O u L T E R，A m e r i c a n)进行测序反应和测序分析。1 51 8 Sr R N A 基因的系统发育分析用美国国家生物技术信

17、息中心的B L A s T 搜索程序，把实验序列信息与基因库中的基因序列进行比较而获得同源性分析结果。用C l u s t a l】【1 8 m s w和M e g a2 软件绘制相关菌种基因的系统发育树。2 结果与讨论2 1 有效克隆的电泳确认从白色转化子的菌落培养物中提取重组质粒D N A，分别经限制性内切酶H i n d 酶切处理后电泳。图l 是6 个转化子酶切重组质粒的电泳图谱。图1真菌类微生物1 8 Sr D N A 片断克隆的重组质粒(4 3k b p)选出H g 1S e l e c t i o no f4 3k b p _ v e c t o rl i g a t e d、j

18、I，i m1 8 Sr D N A 胁鲫e n to f 劬百I I I i c r o b e 万方数据 万方数据 万方数据 万方数据浓香型白酒糟醅中真菌菌群的多样性分析浓香型白酒糟醅中真菌菌群的多样性分析作者：张文学，乔宗伟，胡承，王忠彦，ZHANG Wen-xue，QIAO Zong-wei，HU Cheng，WANG Zhong-yan作者单位：张文学,乔宗伟,ZHANG Wen-xue,QIAO Zong-wei(四川大学,食品工程系,四川,成都,610065)，胡承,王忠彦,HU Cheng,WANG Zhong-yan(四川大学,生物工程系,四川,成都,610064)刊名：四川大

19、学学报(工程科学版)英文刊名：JOURNAL OF SICHUAN UNIVERSITY(ENGINEERING SCIENCE EDITION)年，卷(期)：2006，38(5)被引用次数：9次 参考文献(9条)参考文献(9条)1.Danilo Ercolini PCR-DGGE fingerprinting:novel strategies for detection of microbes in food 2004(3)2.Frank S;Christoph C T Effect of field inoculation with sinorhizobium meliloti L33 o

20、n thecomposition of bacterial communities in rhizospheres of a target plant(Medicago sativa)and a non-target plant(Chenopodium album)Linking of 16S rRNA Gene-based single-strand conformationpolymorphism community profiles to the diversity of cultivated bacteria 2000(08)3.Mazza P;Monciardini P;Cavale

21、tti L Diversity of actionplanes and related genera isolated from anItalian soil 2003(04)4.Gil Zeidner;Oded Bj The use of DGGE analyses to explore eastern Mediterranean and Red Sea marinepicophytoplankton assemblages 2004(05)5.张文学;乔宗伟;向文良 中国浓香型白酒窖池微生态研究进展期刊论文-酿酒 2004(02)6.戴玉成;徐存宝;刘春静 小兴安岭丰林自然保护区的多孔菌期

22、刊论文-中国森林病虫 2001(01)7.姚一建;魏铁铮;蒋毅 菌物学概论 20028.Zhang W X;Qiao Z W;Toru Shigematsu Analysis of the bacterial community in Zaopei during productionof Chinese Luzhou-flavor liquor 2005(02)9.徐美林;吴秉铨;钟镐镐 PCR-TGGE法检测p53基因突变诊断肺癌淋巴结微转移期刊论文-癌症 2004(07)相似文献(6条)相似文献(6条)1.期刊论文 张文学.向文良.乔宗伟.胡承.王忠彦.ZHANG Wen-xue.XIAN

23、G Wen-liang.QIAO Zong-wei.HU Cheng.WANG Zhong-yan 浓香型白酒窖池糟醅原核微生物区系的分类研究-酿酒科技2005(7)为了探讨中国传统白酒窖池糟醅中的原核微生物区系的构成及变化,运用PCR扩增技术和16S rDNA序列同源性分析等方法测定糟醅中原核微生物的16SrDNA基因全序列,根据与基因数据库中相似菌群16S rDNA序列的同源性,分析窖池糟醅中原核微生物的生理特性和区系分布.结果发现,发酵60 d的浓香型白酒糟醅中,真细菌主要分为6个菌群:低G+Cmol%革兰氏阳性菌、高G+Cmo1%革兰氏阳性放线菌群、革兰氏阴性拟杆菌群、革兰氏阴性变形杆

24、菌群、革兰氏阳性纤毛菌群和TM7门,其中-变形杆菌群约占窖池糟醅中原核微生物的80%;古菌主要为产甲烷古细菌,包括Methanoculleus群和Methanospirillum群.通过不同窖池的比较分析得出,微生物的多样性与窖池微生态密切相关.2.学位论文 乔宗伟 中国浓香型白酒窖池微生物区系解析 2005 在浓香型白酒窖池发酵过程中，糟醅微生物区系的形成和演变左右着发酵过程中糟醅内微生物物质能量代谢的走向，与浓香型白酒独特风格的形成息息相关。在本研究中，利用克隆分析、DGGE等现代分子生物学技术结合传统的分离鉴定技术，从时间和空间两个层面对浓香型白酒窖池糟醅微生物区系的消长变化进行了较为全

25、面的调查。研究结果表明：入窖时，上中层酒醅中以酵母菌为主，下层各种菌的含量均在103/g数量级以下；发酵第一周，上中层酒醅中酵母菌、好氧细菌、兼性庆氧细菌都实现了迅速增殖，下层中的好氧细菌、兼性厌氧细菌也实现了迅速增殖；发酵14天以后，酵母菌、好氧细菌和兼性厌氧细菌以及霉菌均急剧减少；发酵21天以后，各种菌的含量都下降到104/g数量级以下，兼性厌氧细菌逐渐占据主体地位。上中层霉菌在入窖后的第一周保持在一个较高的水平，后逐渐下降，中期上层有所回升，而后又下降；下层霉菌在入窖后的第一周急剧上升，后又急剧减少，14天以后，数量稳定在102/g左右。通过分析发现同一层面的同类微生物变化趋势基本趋于一

26、致。通过对糟醅发酵过程中的微生物进行解析，对糟醅微生物的发酵过程作出如下描述：在发酵初期，蓝状菌属(Talaromyces)霉菌在部分酵母菌的协助下完成淀粉质的糖化。与此同时，伊萨酵母属酵母菌开始大量增殖，在其他酵母菌的协助下完成酒精发酵；以芽孢梭菌属和未分类的Clostridiales目类微生物为主的细菌类微生物在前期大量增殖，积累乙酸、丁酸、乳酸、己酸等有机酸，为后期的酯化增香提供前体。发酵中后期，细菌类微生物以乳酸杆菌属细菌为优势菌，除与乳酸乙酯的形成密切相关外，可能在浓香型白酒独特风格的形成过程中起重要作用；蓝状菌属和曲霉属霉菌可能对发酵中后期的淀粉质的糖化有重要作用，散囊菌属霉菌则可

27、能与中后期的酯化增香息息相关。3.期刊论文 张文学.乔宗伟.胡承.王忠彦.ZHANG Wen-xue.QIAO Zong-wei.HU Cheng.WANG Zhong-yan PCR技术对浓香型白酒糟醅细菌菌群的解析-四川大学学报（工程科学版）2005,37(5)为探索中国浓香型白酒发酵糟醅中细菌类微生物区系的形成和演变规律,通过发酵全过程跟踪取样和借助PCR扩增技术,对窖池中心糟醅样品进行了DGGE分析和16SrDNA同源性比较.研究发现,发酵初期表现出明显的微生物多样性分布,共检出Erwinia、Kozakia、Acetobacter、Bacillus、Staphylococcus、La

28、ctobacillus、Granulicatella、Arthrobacter、Microbacterium、Shewanella、Clostridium以及未分类Clostridiales等11个以上的细菌分类属;随着发酵的进行,Lactobacillus属细菌成为主要优势菌,检出的有效克隆达到全部克隆的56.1%,并全部为Lac.Acetotolerans(98%)菌株.主要细菌菌群的数量分布及变化趋势揭示,在浓香型白酒糟醅发酵过程中,Lactobacillus属细菌可能充当着重要的角色.4.期刊论文 张其圣.张文学.方晓璞.刘忠华.岳元媛.刘齐妍.胡承.王忠彦.ZHANG Qi-shen

29、g.ZHANG Wen-xue.FANGXiao-pu.LIU Zhong-hua.YUE Yuan-yuan.LIU Qi-yan.HU Cheng.WANG Zhong-yan 新型白酒糖化发酵剂的制作工艺研究-中国酿造2006(11)针对传统浓香型白酒制曲的时间长、工艺复杂、不易控制等问题进行了新型制曲工艺的研究.结果显示,采用窖池糟醅中分离的微生物制成菌悬液,加入2.4%细菌类培养物,5%酵母菌类培养物,4%霉菌类培养物,37培养4d制作糖化发酵剂,测其糖化力、液化力、发酵力均与传统优质曲接近且制作方法简便、快速,为理想的糖化发酵剂制作工艺.5.期刊论文 张其圣.刘忠华.张文学.方晓璞

30、.胡承.王忠彦.ZHANG Qisheng.LIU Zhonghua.ZHANG Wenxue.FANGXiaopu.HU Cheng.WANG Zhongyan 新型白酒糖化发酵剂的制作工艺研究-中国酿造2008(3)针对传统浓香型白酒制曲时间长、质量受地域环境影响大、不易控制等特征,进行了多菌株复合制曲新工艺的研究.结果显示,采用从浓香型白酒窖池糟醅中分离纯化的微生物菌株,配合基因工程菌株的使用,制作成新型白酒糖化发酵剂,用于实验室模拟窖池发酵生产新型白酒,其产品的口味较好,并为优化新型制曲工艺提供了有价值的参考数据.6.学位论文 张丽莺 窖池微生态资源库的建立、管理及菌种保藏 2006

31、本论文主要从微生物区系、环境理化因子以及酒醅香气成分等三个方面探讨了浓香型白酒窖池微生态在发酵期间的变化情况，在此基础上开发了窖池微生态信息管理库和菌种资源管理库软件，并通过建立菌种保存库对分离得到的菌种资源进行了有效的保管。泸州老窖酒醅第二轮取样研究结果表明：1)入窖微生物含量10-10个/克数量级，以好氧细菌、兼性厌氧细菌和酵母为主，其中上层较多；发酵第一周，大量微生物的增殖使窖池很快进入厌氧状态，7天时检测到微生物数量迅速减少，并持续到第2周，下层微生物数量相对更少；发酵中期各层酒醅中微生物含量有增加现象，主要以兼性厌氧菌和芽孢菌为主；发酵后期微生物数量进一步减少，但中层酵母和上层霉菌有

32、少量增加。2)酒醅中的细菌类微生物共发现肠杆菌(Enterobacter)，醋酸杆菌(Acetobacter)，乳杆菌(Lactobacillus)，芽孢杆菌(Bacillus)，芽孢乳杆菌(sporolactobacillus)等5个属，以芽孢杆菌和芽孢乳杆菌为主要类群；另外，还鉴定到了放线菌类的链霉菌属(Streptomyces)；酒醅中的酵母类微生物发现有德巴利酵母属(Debaryomyces)，汉逊氏酵母属(Hansenula)，毕赤氏酵母属(Pichia)，红酵母属(Rhodotorula)等4个属，以德巴利酵母属为主要菌群；酒醅中的霉菌类微生物发现有曲霉属(Aspergillus)

33、，青霉属(Penicillium)，犁头霉属(Absidia)等3个属。3)酒醅含水量变化趋势在各层面相似，均为发酵前期上升、末期下降，上层含水量基本维持在60左右，中、下层含水量较高，最高可达到80；pH除下层周边以外，各取样点酒醅在发酵前两周保持pH3.5左右，第三周迅速下降到pH3.1附近，之后又回升、下降，出窖时pH3.3左右；酒醅各层面的总酸度变化呈总体波动上升趋势，出窖时达到38-40度；各层酒醅中粗淀粉和还原糖含量呈现整体下降趋势；乙醇在主发酵期含量升高较快，发酵前两周各层酒醅酒精含量从小于1ml100g增加到45.5ml100g，之后稳定中有所下降，出窖时为4-5ml100g左

34、右；粗蛋白在第一周除下层周边以外，其余位置的含量在发酵过程中有不同程度增加，上层出窖样7.06 g，中、下层出窖样分别为6.97g/和5.98 g/。4)在对下层周边糟醅样的香气成分分析测定中，发现糟醅中含量最高的香气成分是乳酸乙酯，然后是己酸，其余物质含量相对较少；乙酸乙酯、己酸乙酯和丁酸乙酯的含量在发酵前期呈增加趋势，分别依次在发酵第一周、第两周、第三周后接近各自最高值：乳酸乙酯在发酵第一周含量下降，随后逐渐增加，到发酵第五周后上升到最高值；乙酸、丁酸、己酸和乳酸等有机酸成分的变化趋势与之对应的乙酯生成趋势大体一致。窖池微生态数据的调查和收集以及窖池糟醅菌种的分离鉴定和保藏，为开发建立浓香

35、型白酒窖池微生态信息平台以及窖池微生物菌种管理库提供了基础条件；而微生态资源信息库及菌种(基因)库的建立，对于分析研究浓香型白酒窖池微生态各物质的消长变化和相互关系，探究并阐明白酒窖池发酵机理，进一步科学地指导实际生产过程以及窖池菌种(基因)资源在更多领域的普及应用奠定了理论和技术基础。引证文献(9条)引证文献(9条)1.施思.张文学.邓宇.钟方达.胡锋 用DGGE技术构建白酒酿造微生物指纹图谱的初步研究期刊论文-中国酿造2010(1)2.张磊.施思.张文学.李波.唐云容.杨开梅 浓香型白酒大曲中酵母菌的分离和鉴定期刊论文-酿酒科技 2010(5)3.施思.邓宇.李波.李中泰.唐云容.毛晓红.

36、张文学 DGGE法在盛夏习酒酒醅的微生物菌群结构解析中的应用期刊论文-酿酒科技 2010(3)4.周瑞平.陈云宗.游玲 多粮浓香型白酒糟醅中的酵母区系的初步研究期刊论文-酿酒科技 2010(3)5.罗惠波.黄治国.李浩.张强.沈才萍 浓香型大曲真核微生物群落的PCR-SSCP解析期刊论文-中国酿造 2009(8)6.王旭亮.王德良.韩兴林.胡建华.张五九 白酒微生物研究与应用现状期刊论文-酿酒科技 2009(6)7.陈建尧.曹钰.谢广发.陆健 黄酒机械成型麦曲制曲过程中真菌动态变化的研究期刊论文-食品与发酵工业2008(8)8.曹钰.谢广发.陈建尧.李旺军.陆健 加饭酒大罐发酵过程中真菌群落的动力学研究期刊论文-食品与发酵工业2008(11)9.刘忠华.张文学.张其圣.岳元媛.胡承.王忠彦 模拟窖池发酵过程中各环境因子的变化规律研究期刊论文-酿酒科技 2006(12)本文链接：http:/