分子克隆载体讲稿.ppt

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1、分子克隆载体第一页，讲稿共六十五页哦目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶 DNA ligase重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连第二页，讲稿共六十五页哦基因操作的基本步骤基因操作的基本步骤第三页，讲稿共六十五页哦载体单独一个包括启动子、编码区和终止子的基因，或者组成基因的某个元件，一般是不易进入受体细胞的，即使采用理化方法进入细胞后，也不容易在受体细胞内维持。载体载体(vector):能携带外源基因（或能携带外源基因（或DNA片段）进入细胞复制、整合或表达的工具。片段）进入细胞复制、整合或表达的工具。第四页，讲稿共六十五页哦作为克隆载体的

2、DNA分子具备的条件：1具有对受体细胞的可转移性，能携带外源基因进入宿主细胞；2能在宿主细胞中自主复制，并实现外源基因的增殖；第五页，讲稿共六十五页哦3具有由单一限制酶识别位点组成的多克隆位点(MCS）；4克隆载体必须具有用于选择克隆子的标记基因；5克隆载体必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，并且不会任意转入除受体细胞以外的其他生物的细胞，尤其是人的细胞。第六页，讲稿共六十五页哦多克隆位点多克隆位点ori复制起始点复制起始点遗传标记遗传标记A Ammp pr r MCS克隆载体克隆载体第七页，讲稿共六十五页哦按功能分：克隆载体 表达载体第八页，讲稿共六十五页哦质粒克隆载体(plasmi

3、dcloningvector)第九页，讲稿共六十五页哦 质粒(plasmid):是一种寓于宿主细胞中染色体外裸露的dsDNA分子。一个质粒就是一个DNA分子。PlasmidchromosomePlasmidchromosome 存在于细菌、真菌、蓝藻和绿藻的细胞中，在细菌细胞中最多。存在于细菌、真菌、蓝藻和绿藻的细胞中，在细菌细胞中最多。第十页，讲稿共六十五页哦第十一页，讲稿共六十五页哦质粒的存在形式：一般以超螺旋共价闭环DNA分子(ccc-DNA)的形式存在。也可以开环DNA分子(oc-DNA)和线性DNA分子(L-DNA)的形式存在。第十二页，讲稿共六十五页哦质粒DNA的大小质粒宿主大小（

4、kb）pPbs蓝藻1.5CoLE1大肠杆菌6.4PV21三叶草根瘤菌700多数在10kb左右第十三页，讲稿共六十五页哦质粒的基本性质：1复制按照质粒控制拷贝数的程度，可以将质粒分为:1）严谨型质粒(stringentplasmid)拷贝数少，为拷贝数少，为15个个2）松散型质粒(relaxedplasmid)拷贝数多，可达拷贝数多，可达10个拷贝以上个拷贝以上第十四页，讲稿共六十五页哦某种质粒属于严谨型或是松散型的，与宿主有一定的关系。例子：质粒ColE1-K30在大肠杆菌中属于松散型的，在奇异变形杆菌中是严谨型的。一般来说，希望构建的质粒克隆载体是松散型的，所以在构建的克隆载体中应含有松散型

5、的复制起始位点和调控复制拷贝数的基因。第十五页，讲稿共六十五页哦2质粒的不相容性(incompatibility):两种质粒在同一宿主细胞中不能共存的现象。亲缘关系密切的不同质粒一般属于不亲和性质粒。野生型质粒与其衍生的重组质粒属于不亲和性质粒。当质粒载体承载目的基因转化受体细胞时，考虑受体细胞内原有的质粒与作为克隆载体的质粒是否属于亲和性质粒。作为受体细胞最好不含内源质粒。第十六页，讲稿共六十五页哦3质粒的转移性接合型质粒(conjugativeplasmid)：转移基因tra：指令宿主细胞产生菌毛、合成细胞表面物质，促使宿主细胞与受体细胞的结合，使质粒从一个细胞转移到另一个细胞。非接合型质

6、粒(non-conjugativeplasmid)：顺式作用元件：bom位点移动基因：mob基因(分子质量小、拷贝数多、被动迁移)第十七页，讲稿共六十五页哦构建质粒载体的基本原则1选择合适的出发质粒必备元件：A复制起始点B选择标记基因C克隆位点D启动子E终止子等等.第十八页，讲稿共六十五页哦构建质粒载体的基本原则2正确获得构建质粒载体克隆元件一般用限制酶切割出发质粒DNA分子，获得含有某种元件的DNA片段。为了获得含某种元件的DNA片段，选用的切割位点既要保证元件完整无缺，又要使DNA片段愈小愈好，尽可能不含或少含不必要的序列，使构建的载体尽可能小。第十九页，讲稿共六十五页哦构建质粒载体的基本

7、原则3组装合适的选择标记基因构建供转化大肠杆菌用的质粒载体，可组装蓝/白颜色进行选择的(B-半乳糖苷酶基因)lacz基因。但构建供转化蓝藻用的质粒载体不能用这个基因。因为蓝藻含有大量的藻蓝蛋白。第二十页，讲稿共六十五页哦构建质粒载体的基本原则4选用合适的启动子如果用真核生物基因的启动子作为原核生物表达克隆载体的启动子，其功效下降；原核生物和病毒基因的启动子用作真核生物表达克隆载体的启动子，可保留其原来的功效。第二十一页，讲稿共六十五页哦构建质粒载体的基本原则5在能达到预期目的的情况下，构建过程要力求简单。第二十二页，讲稿共六十五页哦构建质粒克隆载体的基本策略1.构建的质粒克隆载体应该是能在转化

8、的受体细胞中进行有效的复制，并作为质粒克隆载体，希望在受体细胞中有较多的拷贝数。2.构建的质粒克隆载体必须含有允许外源DNA片段克隆的位点，并这样的克隆位点应尽可能多。第二十三页，讲稿共六十五页哦3.构建的质粒克隆载体必须含有供选择克隆子的标记基因。4.构建的质粒克隆载体DNA分子应尽可能小。5.根据特殊需要，使构建的质粒克隆载体中组装各种元件，构建成不同用途的质粒克隆载体。第二十四页，讲稿共六十五页哦质粒的命名 用小写字母用小写字母p代表质粒（代表质粒（plasmid），在），在p字字母后用两个或三个大写字母代表发现这一质粒母后用两个或三个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称，再加上质

9、粒编号。的作者或实验室名称，再加上质粒编号。如：如：pBR322：p表示一种质粒，而表示一种质粒，而“BR”则是分则是分别取自该质粒的两位主要构建者别取自该质粒的两位主要构建者F.Bolivar和和R.L.Rodriguez，322为编号。为编号。第二十五页，讲稿共六十五页哦选择标记基因：(用于鉴别目的DNA的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来）(1)(1)氨苄青霉素抗性基因氨苄青霉素抗性基因 (amp(ampr r ap apr r)(2)(2)卡那霉素抗性基因卡那霉素抗性基因 (kan(kanr r km kmr r)(3)(3)四环素抗性基因四环素抗性基因 （tctcr r tet t

10、etr r）(4)(4)氯霉素抗性基因氯霉素抗性基因 (cmp(cmpr r cm cmr r)(5)(5)新霉素抗性基因（新霉素抗性基因（neoneor r）第二十六页，讲稿共六十五页哦 pBR322pBR322pBR322pBR322的的的的大大大大小小小小是是是是4361bp4361bp4361bp4361bp的的的的环环环环状状状状双双双双链链链链DNADNADNADNA，其其其其碱碱碱碱基基基基序序序序列列列列已已已已经经经经全全全全部清楚。是最早应用于基因工程的载体之一。部清楚。是最早应用于基因工程的载体之一。部清楚。是最早应用于基因工程的载体之一。部清楚。是最早应用于基因工程的载

11、体之一。含含含含有有有有24242424种种限限制制酶酶的的单单一一识识别别位位点点，具具有有四四环环素素抗抗性性基基因因(tettetr)和氨苄青霉素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因(ampampr)。将将将将质质质质粒粒粒粒pSF124pSF124pSF124pSF124中中中中含含含含ampampampampr r r r基基基基因因因因的的的的DNADNADNADNA片片片片段段段段和和和和质质质质粒粒粒粒pSC101pSC101pSC101pSC101中中中中含含含含tettetr r r r基基基基因因因因的的的的DNADNADNADNA片片片片

12、段段段段同同同同含含含含ColE1ColE1ColE1ColE1复复复复制制制制起起起起始始始始点点点点(来来来来源源源源于于于于pMB1pMB1pMB1pMB1、松松散散型型)的的的的DNADNA片段片段片段片段重组，构建成质粒克隆载体重组，构建成质粒克隆载体重组，构建成质粒克隆载体重组，构建成质粒克隆载体pBR322pBR322。pBR322 pBR322第二十七页，讲稿共六十五页哦第二十八页，讲稿共六十五页哦普通型载体普通型载体pBR322的结构图的结构图第二十九页，讲稿共六十五页哦pBR322如何筛选？利用Tetr基因内部的BamHI位点来插入外源DNA片段，可以通过插入失活进行筛选。

13、BamHIG/GATTC第三十页，讲稿共六十五页哦第三十一页，讲稿共六十五页哦经重组DNA分子转化处理的受体菌在不含标记药物tc的琼脂培养基上培养，则含或不含重组DNA分子的受体菌都能长出菌落。然后取菌落的一部分接种在含tc的琼脂培养基上，不会长出菌落的原菌落才是真正在tcr基因区插入外源DNA片段的克隆子。（为什么？）第三十二页，讲稿共六十五页哦 pUC pUC质粒质粒 pUC质粒系列是在pBR322基础上改建成的；包括pBR322的ampr基因；缺乏控制拷贝数的rop基因。第三十三页，讲稿共六十五页哦pUC的主要优点：的主要优点：（1 1）分子量更小分子量更小分子量更小分子量更小，仅为，仅

14、为2686bp，容纳外源，容纳外源，容纳外源，容纳外源DNADNA量增大；具有量增大；具有量增大；具有量增大；具有更高的拷贝数更高的拷贝数更高的拷贝数更高的拷贝数（每个细胞含（每个细胞含（每个细胞含（每个细胞含500-700500-700个拷贝）。个拷贝）。个拷贝）。个拷贝）。（2 2）含易于检测是否有外源）含易于检测是否有外源）含易于检测是否有外源）含易于检测是否有外源DNADNA插入的标记基因插入的标记基因插入的标记基因插入的标记基因LacZLacZ，可利用可利用可利用可利用 -互补原理进行互补原理进行蓝白筛选。蓝白筛选。蓝白筛选。蓝白筛选。（3 3）多克隆位点区（多克隆位点区（多克隆位点

15、区（多克隆位点区（MCSMCS）由人工合成的多个单一酶切位由人工合成的多个单一酶切位点构成。点构成。第三十四页，讲稿共六十五页哦pUC18pUC19含四个部分：含四个部分：（1）来自）来自pBR322的质粒复的质粒复制起点（制起点（ori）；）；（2）ampr;（3）大肠杆菌大肠杆菌半乳糖苷酶基半乳糖苷酶基因（因（lacZ）的启动子及其编码）的启动子及其编码-肽链的肽链的DNA序列；序列；（4）多克隆位点）多克隆位点（MCS）lacZOriAmprMCS第三十五页，讲稿共六十五页哦BlueWhiteampramprInsertInsertNoinsertLac ZLac Z第三十六页，讲稿共六

16、十五页哦噬菌体载体噬菌体载体（lambdaphagevectorlambdaphagevector）第三十七页，讲稿共六十五页哦 把感染细菌的病毒称为噬菌体。把感染细菌的病毒称为噬菌体。把感染细菌的病毒称为噬菌体。把感染细菌的病毒称为噬菌体。病病病病毒毒毒毒主主主主要要要要有有有有DNADNADNADNA（或或或或RNARNARNARNA）和和和和外外外外壳壳壳壳蛋蛋蛋蛋白白白白组组组组成成成成。通通通通过过过过感感感感染染染染，病病病病毒颗粒进入宿主细胞。毒颗粒进入宿主细胞。毒颗粒进入宿主细胞。毒颗粒进入宿主细胞。第三十八页，讲稿共六十五页哦T2噬菌体结构示意图噬菌体结构示意图第三十九页，讲

17、稿共六十五页哦噬菌体的性质噬菌体的性质1噬菌体由噬菌体由噬菌体由噬菌体由DNA和外壳蛋白组成。和外壳蛋白组成。和外壳蛋白组成。和外壳蛋白组成。22在噬菌体中在噬菌体中DNADNA是线性的，全长是线性的，全长48502bp48502bp，左右各有，左右各有，左右各有，左右各有1212个核苷酸组成的个核苷酸组成的个核苷酸组成的个核苷酸组成的55凸出黏性末端，而且是互补的。凸出黏性末端，而且是互补的。凸出黏性末端，而且是互补的。凸出黏性末端，而且是互补的。5GGGCGGCGACCTNN.NN35GGGCGGCGACCTNN.NN33NN.CCCGCCGCTGGA53NN.CCCGCCGCTGGA5把

18、此末端称为把此末端称为把此末端称为把此末端称为 COSCOS位点位点位点位点(cohesiveendsite)(cohesiveendsite)33其有其有其有其有5050个以上基因个以上基因个以上基因个以上基因4有有5656种限制酶识别位点种限制酶识别位点种限制酶识别位点种限制酶识别位点55生长途径有溶源途径和溶菌途径。生长途径有溶源途径和溶菌途径。生长途径有溶源途径和溶菌途径。生长途径有溶源途径和溶菌途径。第四十页，讲稿共六十五页哦溶菌途径：噬菌体感染宿主细胞后，其DNA不插入染色体DNA，经过一段时间的潜伏期，就大量增殖新的病毒颗粒，使宿主细胞破裂，释放的病毒颗粒又感染其他细胞。（左图示

19、）第四十一页，讲稿共六十五页哦 溶源途径：感染宿主细胞后，其DNA与宿主细胞染色体DNA整合，一起复制和传代，无感染其他细胞的能力。（右图示）第四十二页，讲稿共六十五页哦裂解循环裂解循环溶源态溶源态噬菌体的生长途径噬菌体的生长途径第四十三页，讲稿共六十五页哦噬菌体的基因组分区噬菌体的基因组分区左区：左区：Nul基因基因J基因之间的基因基因之间的基因其产物用于噬菌体其产物用于噬菌体DNA的包装和噬菌体颗粒的的包装和噬菌体颗粒的形成。形成。第四十四页，讲稿共六十五页哦噬菌体的基因组分区噬菌体的基因组分区中区：中区：J基因右边基因右边gam基因之间的基因基因之间的基因溶源状态的发生和维持以及遗传重组

20、所需要的溶源状态的发生和维持以及遗传重组所需要的基因。（外源基因。（外源DNA片段的插入）片段的插入）第四十五页，讲稿共六十五页哦噬菌体的基因组分区噬菌体的基因组分区右区：右区：gam基因右边基因右边Rz基因之间的基因基因之间的基因主要用于噬菌体的复制和裂解宿主菌。主要用于噬菌体的复制和裂解宿主菌。第四十六页，讲稿共六十五页哦用用噬菌体作为克隆载体的依据噬菌体作为克隆载体的依据1 它是一种温和噬菌体。2 能承载比较大的外源DNA片段。野生型的头部能包装DNA分子大小75%105%的DNA片段，约36.451kb。3 在DNA分子上有许多限制性酶识别位点。第四十七页，讲稿共六十五页哦 DNA D

21、NA的限制性核酸内切酶谱（的限制性核酸内切酶谱（KbKb）第四十八页，讲稿共六十五页哦噬菌体载体的构建过程噬菌体载体的构建过程1去除非必须区，建立外源DNA片段的克隆或替换位点；2在DNA的非必须区内插入选择标记基因cI基因：它的表达使噬菌体进入溶原状态，基因产物活性受到影响会促进噬菌体进入裂解循环。如果外源DNA片段插入基因cI中，将高效地使hfl突变的E.coli进入裂解生长状态。第四十九页，讲稿共六十五页哦3建立重组DNA分子的体外包装系统在实验室重组的DNA分子，必须经过体外包装成噬菌体颗粒后才有效地感染受体细胞。噬菌体突变株D-和E-当两个突变株分别感染受体细胞时，两者都可复制DNA

22、，但不能把复制合成的DNA包装成噬菌体颗粒。二者蛋白混合，能有效地包装。第五十页，讲稿共六十五页哦噬菌体的主要类型1插入型载体(insertionvector):通过特定酶切位点允许外源DNA片段插入的载体。外源DNA片段大小06kb。2置换型载体(replacementvector):允许外源DNA片段替换非必须DNA片段的载体。外源DNA片段大小923kb。第五十一页，讲稿共六十五页哦插入型载体第五十二页，讲稿共六十五页哦主要用于cDNA克隆，允许插入的外源DNA片段大小为06kb。基因cI内的E.coRI位点作为唯一位点，可以用于外源DNA的插入。第五十三页，讲稿共六十五页哦主要用于cD

23、NA文库、基因组文库和表达融合蛋白。允许插入的外源DNA片段的大小为07.2kb。基因lac5编码区终止密码子之前有一个E.coRI，可以用于外源DNA的插入。第五十四页，讲稿共六十五页哦置换型载体在填充片段两端有对称分布的MCS，这两个载体的差别是MCS位点的排列位置相反。第五十五页，讲稿共六十五页哦M13噬菌体载体基因工程中常对单链DNA测序、制备探针或实施定点突变，应用此载体就可以获得单链DNA。第五十六页，讲稿共六十五页哦第五十七页，讲稿共六十五页哦黏粒载体(cosmidvector)基本特征：1是质粒的衍生物，是带有cos位点的质粒。2其组成有质粒的复制起点(ColE1)、抗性基因、

24、cos位点、MCS。3大小为57kb4能克隆的外源DNA片段最大达40kb。第五十八页，讲稿共六十五页哦黏粒载体的特点：（1）具有噬菌体的特性（但因不含噬菌体的全部必需基因，因此不能通过溶菌周期，无法形成子代噬菌体颗粒）；（2）具有质粒的特性（有质粒复制子及抗菌素基因）；（3）具有高容量的克隆能力（本身仅5-7kb,克隆极限可达40kb左右）；（4）具有与同源序列质粒进行重组的能力。广泛应用于基因组DNA文库的构建。第五十九页，讲稿共六十五页哦第六十页，讲稿共六十五页哦部分柯斯质粒的基本特性部分柯斯质粒的基本特性第六十一页，讲稿共六十五页哦人工染色体载体(artificialchromosom

25、evector)人工染色体载体：利用染色体的复制功能来驱动外源DNA片段复制的载体。1酵母人工染色体载体(YAC)2细菌人工染色体载体(BAC)第六十二页，讲稿共六十五页哦利用酿酒酵母染色体的复制元件构建的载体。利用酿酒酵母染色体的复制元件构建的载体。复制的必须元件：复制的必须元件：1自主复制序列自主复制序列(autonomouslyreplicationsequences,ARS)是一段特殊的序列，含有酵母菌中是一段特殊的序列，含有酵母菌中DNA进行双向复制所必须的信号。进行双向复制所必须的信号。2着丝粒着丝粒（centromere,CEN）有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点，使染色体在分裂过程

26、中能正确分配有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点，使染色体在分裂过程中能正确分配到子细胞中。到子细胞中。3端粒重复序列端粒重复序列（telomericrepeat,TEL）用于保护线状用于保护线状DNA不被细胞内的核酸酶降降，以形成稳定的结构。不被细胞内的核酸酶降降，以形成稳定的结构。酵母人工染色体载体酵母人工染色体载体(YAC)第六十三页，讲稿共六十五页哦YAC载体的选择标记：载体的选择标记：营养缺陷型基因 如色氨酸、亮氨酸合成缺陷型基因trp 1、leu 2 和his3 尿嘧啶合成缺陷基因ura3 赭石突变抑制基因sup4第六十四页，讲稿共六十五页哦赭石突变抑制基因sup4外源DNA片段的装载导致抑制基因sup4插入失活，从而使重组菌形成红色菌落。而载体自身连接转入到酵母细胞后形成的菌落为白色。第六十五页，讲稿共六十五页哦