基因工程质粒介导细胞转基因系列实验.pptx

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1、现在学习的是第1页，共23页GFP（green fluorescent protein）little protein:238 amino acids,26.9 kDa structure:“-can“-helix-11 strand-barrel internal fluorophore:Ser-Tyr-Gly:green fluorescence,use in fusion protein(cell marker)现在学习的是第2页，共23页pIRES-EGFP contains the internal ribosome entry site(IRES)of the encephalomy

2、ocarditis virus(ECMV)between the MCS and the EGFP(enhanced green fluorescent protein)coding region.This permits both the gene of interest(cloned into the MCS)and the EGFP gene to be translated from a single bicistronic mRNA.现在学习的是第3页，共23页Culture medium:DMEM+10%FBS+100U/ml Penicillin+0.1mg/ml Strepto

3、mycinAtmosphere:air,95%;carbon dioxide(CO2),5%Temperature:37C 现在学习的是第4页，共23页Proliferation of pIRES-GFP1.Transformation of E.Coli.(DH5)with pIRES-GFP(Heat Shock)2.Proliferation of pIRES-GFP in fernmented E.Coli.Transfection of 293 cells with pIRES-GFP1.Transfection of 293 with pIRES-GFP(PEI)2.Detecti

4、on of transfected 293 cells(fluorescence microscope)现在学习的是第5页，共23页热激法将热激法将pIRES-GFP转化到细菌（转化到细菌（DH5）中）中转化转化:将外源将外源 DNA 分子导入到受体细胞分子导入到受体细胞(宿主细宿主细胞胞)，使之，使之获得新的遗传特性获得新的遗传特性的过程的过程宿主细胞：宿主细胞：大肠杆菌大肠杆菌(E.coli)DH5a a菌株菌株 感受态：感受态：细胞处于容易吸收外源细胞处于容易吸收外源DNA的状态的状态现在学习的是第6页，共23页质粒：质粒：是存在于细菌染色体以外的是存在于细菌染色体以外的小型环状双链小型

5、环状双链DNA，能，能自主复制自主复制和表达其携带的遗传信息和表达其携带的遗传信息现在学习的是第7页，共23页实验原理 将对数生长期的细菌置于0、CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，细胞膜通透性改变(感受态细胞)；外源DNA分子在此条件下与Ca2+结合形成抗DNA酶的羟基钙磷酸复合物粘附在细菌表面；经42短暂热激处理，使细胞膜通透性增大，促进细胞吸收DNA复合物。现在学习的是第8页，共23页 单菌落单菌落(克隆克隆)工程菌的筛选含含Amp的选择的选择性培养基性培养基 已转化已转化的细菌的细菌(工程菌工程菌)能在含能在含Amp的的选择选择性培养基性培养基上生长并形成上生长并形成菌落菌落(克隆

6、克隆)，而未转化，而未转化的细菌则不能生长的细菌则不能生长培养皿培养皿现在学习的是第9页，共23页实验流程实验流程20ul感受态细胞感受态细胞+5ul重组质粒重组质粒轻轻旋转混合轻轻旋转混合 37,120r/min振振摇摇30min冰上放置冰上放置30min 取取50ul涂布于含涂布于含Amp培养基培养基 42,热激热激90s 室温放置使液体吸收室温放置使液体吸收 冰浴冰浴2min 37 倒置培养倒置培养1216h100ul LB培养基培养基现在学习的是第10页，共23页注意事项注意事项 1.感受态感受态DH5细菌很脆弱，加入细菌很脆弱，加入Bcl-2重组质重组质 粒粒5l后，要轻轻旋转混合，

7、后，要轻轻旋转混合，禁止剧烈振摇禁止剧烈振摇 或吹打或吹打。2.42 水浴水浴90秒，时间和温度要准确，秒，时间和温度要准确，中途中途 不能摇动离心管不能摇动离心管。现在学习的是第11页，共23页注意事项注意事项 3.无菌操作要严格，防止外界细菌污染。无菌操作要严格，防止外界细菌污染。4.细菌铺板密度不能过高，倒置培养时间不细菌铺板密度不能过高，倒置培养时间不 能过长（能过长（1216h内内）。现在学习的是第12页，共23页思考题思考题 1.简述简述CaCl2在转化中的作用。在转化中的作用。2.42热激活后为何转化菌一开始加入无抗生素热激活后为何转化菌一开始加入无抗生素 的的LB培养基进行温和

8、振荡培养，而不是直接加培养基进行温和振荡培养，而不是直接加 含抗生素含抗生素LB培养基进行培养？培养基进行培养？现在学习的是第13页，共23页思考题思考题 3.转化实验中在含转化实验中在含Amp的选择性培养基上的选择性培养基上实验实验 组出现菌落组出现菌落，但，但阴性对照也有菌落出现阴性对照也有菌落出现，这，这 说明了什么？请分析其原因。说明了什么？请分析其原因。现在学习的是第14页，共23页转化细菌克隆的扩增转化细菌克隆的扩增现在学习的是第15页，共23页DH5培养条件培养条件LB培养基的配方液体培养基：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L酵母提取物(Yeast extract)5g/L氯

9、化钠(NaCl)10g/LPH 7.0-7.4固体培养基：液体培养基+10-15g/L的琼脂粉在15psi高压下蒸汽灭菌21min 温度和转速37 ，250-300 r/min，振振摇摇 12-16 hr12-16 hr现在学习的是第16页，共23页质粒抽提质粒抽提质粒小量抽提试剂盒细菌转移到2 ml离心管里，13000 rpm离心2 min。倒上清液，留下沉淀的细菌。加入250 l Buffer P1，使用移液器充分混匀沉淀细菌。加入250 l Buffer P2，上下颠倒4-6次温和混匀，液体变清稠。加入350 l Buffer N3，上下颠倒4-6次温和混匀，出现白色絮状，13000 r

10、pm离心10 min。将上清液转移到吸附柱，13000 rpm离心1 min，倒收集管中废液。加入750 l Buffer PW，13000 rpm离心1 min，弃废液，重复离心一次。将吸附柱置新的离心管里，加入50 l Buffer EB，室温静置5 min，13000rpm离心1 min。用分光光度计（Nanodrop）检测提取的质粒浓度。结果：1质粒浓度不同组间相互比较浓度高主观原因：操作规范；客观原因：所挑克隆的细菌里面质粒的拷贝数高。浓度低，原因相反。2 R260/280:DNA与蛋白质浓度比值。R高说明DNA纯度高，R1.8.R1.8说明蛋白质污染DNA，操作不够规范。现在学习的

11、是第17页，共23页pIRES-GFP转染转染293细胞细胞PEI转染法转染法聚乙烯亚胺聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI），是阳离子聚合物，将DNA缩合成带正电荷的微粒，这些微粒可以黏合到带有负电荷的细胞表面残基，并通过胞吞作用进入细胞。一旦进入细胞，胺的质子化导致反离子大量涌入以及渗透势降低。上述变化导致的渗透膨胀使囊泡释放聚合物与DNA形成的复合物（polyplex）进入细胞质。复合物拆解后，DNA就能自由的融合到细胞核中。PEI有细胞毒性，不同细胞对PEI的耐受程度不同，PEI量越多转染效果越好，所以实验前需摸索最佳PEI的量。现在学习的是第18页，共23页实验步骤实

12、验步骤实验前一天，293细胞铺板：6孔板（直径35mm），5105个细胞/孔（50%覆盖率），2 ml细胞培养基/空；实验前准备转染液A:20 l PEI(1mg/ml)+5 l DMEM，轻轻混匀，室温放置五分钟B:1g质粒+DMEM(总体积25 l)A+B，轻轻混匀，室温放置30 min，质粒与PEI组装A+B混合液滴入细胞培养板中，一边滴，一边轻轻摇匀，使转染液在细胞培养液中均匀分布；将细胞放回培养箱内培养24-72小时，用荧光显微镜检查细胞内GFP的表达情况。现在学习的是第19页，共23页电击转染法电击转染法 将受体细胞悬浮于含有待转化DNA的溶液中，在盛有上述悬浮液的电击池两端施加短

13、暂的脉冲电场，使细胞膜产生细小的空洞并增加其通透性，此时外源DNA片段便能直接进入细胞核。电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大。现在学习的是第20页，共23页 电穿孔法转染哺乳动物细胞电穿孔法转染哺乳动物细胞转染前按照实验设计取出欲转染的转染前按照实验设计取出欲转染的 DNA(1 20g用于稳定转染，用于稳定转染，瞬时转架可观用到瞬时转架可观用到10-40g)，用乙醇沉淀法进行浓缩并灭菌，临转染，用乙醇沉淀法进行浓缩并灭菌，临转染前在洁净工作台内将前在洁净工作台内将 DNA溶解在溶解在10l TE中中培养细胞至培养细胞至 5075汇合，汇合，4下

14、下 640g离心离心5 min，收获细胞，收获细胞，若为贴壁细胞，可用胰蛋白酶消化并用血清将胰蛋白酶灭活若为贴壁细胞，可用胰蛋白酶消化并用血清将胰蛋白酶灭活用电转液（用电转液（Solution I+II）冰浴预冷电穿孔缓冲液重悬细胞，）冰浴预冷电穿孔缓冲液重悬细胞，4 640g离心离心 5min，弃上清，弃上清用冰浴预冷电穿孔液重悬细胞用冰浴预冷电穿孔液重悬细胞,1107个细胞个细胞ml，用于稳定转染，用于稳定转染，8107个细胞个细胞ml用于瞬时转染用于瞬时转染现在学习的是第21页，共23页电穿孔杯置于冰上电穿孔杯置于冰上10min用用20倍体积的非选择性完全培养基稀释转染细胞并淋洗电穿孔杯

15、以倍体积的非选择性完全培养基稀释转染细胞并淋洗电穿孔杯以移去所有转染细胞移去所有转染细胞稳定转染实验在非选择性培养基中培养稳定转染实验在非选择性培养基中培养48h（约两代）后更换选（约两代）后更换选择培养基，瞬时转染则在转染择培养基，瞬时转染则在转染 48 72 h后收获细胞，进行表后收获细胞，进行表达水平检测。达水平检测。在每个电穿孔专用细胞小室（在每个电穿孔专用细胞小室（Cuvette）中加人）中加人 0.5ml细胞悬浮细胞悬浮 液液并置于冰上并置于冰上加入欲转染加入欲转染 DNA，手指轻弹混匀，冰上放置，手指轻弹混匀，冰上放置 5 min将电穿孔杯置于电穿孔仪内，在优选的条件下电击一次或多次。电压、将电穿孔杯置于电穿孔仪内，在优选的条件下电击一次或多次。电压、电容及电击次数因细胞不同而异，应进行优选。一般电压为电容及电击次数因细胞不同而异，应进行优选。一般电压为250-750Vcm，电容为，电容为25F，脉冲时间为，脉冲时间为20-100 ms现在学习的是第22页，共23页Multiporator 多功能细胞电穿孔多功能细胞电穿孔/融合仪融合仪现在学习的是第23页，共23页