菌种选育理论与技术课件.ppt

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1、关于菌种选育理论与技术现在学习的是第1页，共49页菌种选育是一门应用科学技术菌种选育是一门应用科学技术理论基础：微生物学、微生物遗传学、生物化学、理论基础：微生物学、微生物遗传学、生物化学、分子生物学、基因工程等。分子生物学、基因工程等。目的目的现在学习的是第2页，共49页简化生产工艺条件，缩短生产周期简化生产工艺条件，缩短生产周期 菌种选育的目的菌种选育的目的菌种选育的目的菌种选育的目的研究抗生素生物合成调控的机制研究抗生素生物合成调控的机制科研科研科研科研生产生产生产生产分析抗生素生物合成途径分析抗生素生物合成途径获得带遗传标记的菌株获得带遗传标记的菌株了解菌种遗传背景了解菌种遗传背景改变

2、产品组分、改进质量条件改变产品组分、改进质量条件抵抗不良培养条件抵抗不良培养条件适应新的原材料适应新的原材料提高产量提高产量提供分子遗传学研究材料提供分子遗传学研究材料产生新的生物活性物质产生新的生物活性物质现在学习的是第3页，共49页青霉素生产菌种的选育目前工业发酵水平目前工业发酵水平经诱变经诱变85000 UmlWisQ176，900 Uml产黄青霉，产黄青霉，20 Uml点青霉，点青霉，2 Uml1943年，发霉的甜瓜年，发霉的甜瓜1928年，年，Fleming现在学习的是第4页，共49页菌种选育的基本方法菌种选育的基本方法根据菌种根据菌种自然变异自然变异而进行的而进行的自然选育自然选育

3、。用用人工方法人工方法引起菌种变异或形成新的杂种，再按照引起菌种变异或形成新的杂种，再按照工工业要求业要求进行筛选来获得进行筛选来获得新的变种或杂种新的变种或杂种。包括诱变育种，杂交育种，原生质体育种，基因包括诱变育种，杂交育种，原生质体育种，基因工程育种等。工程育种等。现在学习的是第5页，共49页第一节第一节 自然选育自然选育自然选育（自然选育（natural screeningnatural screening）是指利用微生物在一定条件下产生自发突变的原是指利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理，通过分离、筛选排除衰退型菌株，从中选出维持理，通过分离、筛选排除衰退型菌株，从中选出维持或高

4、于原有生产菌株的过程，以达到稳定或提高生产或高于原有生产菌株的过程，以达到稳定或提高生产的目的。的目的。自然选育的目的自然选育的目的 淘汰衰退菌种，保存优良菌株，纯化菌种，防止菌淘汰衰退菌种，保存优良菌株，纯化菌种，防止菌种衰退，稳定生产，提高发酵产量。种衰退，稳定生产，提高发酵产量。现在学习的是第6页，共49页一、菌种衰退的原因一、菌种衰退的原因菌种遗传特性的改变菌种遗传特性的改变经诱变剂处理后的退化变异经诱变剂处理后的退化变异 菌种生理状况的改变菌种生理状况的改变 （培养条件）（培养条件）导致衰退可能的原因：沙土管长期保藏、连续传代、新导致衰退可能的原因：沙土管长期保藏、连续传代、新陈代谢

5、产生的诱变物质、多因素低剂量诱变效应、互变异陈代谢产生的诱变物质、多因素低剂量诱变效应、互变异构现象等。构现象等。现在学习的是第7页，共49页二、自然选育的一般过程现在学习的是第8页，共49页1、单孢子悬浮液的制备、单孢子悬浮液的制备定量稀释后制成定量稀释后制成50200个单细胞个单细胞ml的菌悬液。的菌悬液。2、分离及单菌落培养、分离及单菌落培养 根据计数结果，按丝状真菌、放线菌菌落大小不根据计数结果，按丝状真菌、放线菌菌落大小不同，分离量以同，分离量以520个菌落平皿为宜。个菌落平皿为宜。3、筛选、筛选将分离培养后的各型单菌落，接斜面培养，成熟将分离培养后的各型单菌落，接斜面培养，成熟后接

6、入发酵瓶，测定发酵单位的过程称为筛选。它分后接入发酵瓶，测定发酵单位的过程称为筛选。它分初筛、复筛两个过程。初筛、复筛两个过程。现在学习的是第9页，共49页优点优点简单易行简单易行缺点缺点效率低，进展慢，难以获得高产突变株效率低，进展慢，难以获得高产突变株以微生物的自然变异为基础的生产选种几率并不是以微生物的自然变异为基础的生产选种几率并不是很高，一个基因的自然突变频率仅很高，一个基因的自然突变频率仅1061010目的目的纯化、复壮菌种纯化、复壮菌种现在学习的是第10页，共49页第二节第二节 诱变育种诱变育种诱变育种（诱变育种（mutation breeding）是利用物理或化学诱变）是利用物

7、理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群体，促进其突变率剂处理均匀分散的微生物细胞群体，促进其突变率大幅提高，然后采用简便、高效的筛选方法，从中大幅提高，然后采用简便、高效的筛选方法，从中选出少数具有优良性状的突变菌株。选出少数具有优良性状的突变菌株。优点：速度快，收效大，方法简便。优点：速度快，收效大，方法简便。缺点：诱发突变缺乏定向性，工作量大。缺点：诱发突变缺乏定向性，工作量大。诱变育种工作主要包括出发菌株的选择、诱变处理诱变育种工作主要包括出发菌株的选择、诱变处理和筛选突变株三个部分。和筛选突变株三个部分。现在学习的是第11页，共49页出发菌株（沙土管或冷冻管）诱诱变变育育种种的的一一

8、般般步步骤骤现在学习的是第12页，共49页一、诱变剂的种类一、诱变剂的种类物理诱变剂：主要包括物理辐射中的各种射线物理诱变剂：主要包括物理辐射中的各种射线 化学诱变剂：与化学诱变剂：与DNA发生作用、改变其结构，并引起发生作用、改变其结构，并引起遗传变异的化学物质。遗传变异的化学物质。生物诱变剂：一些能引起生物诱变剂：一些能引起DNADNA结构改变，从而造成突变结构改变，从而造成突变效应的生物体或生物分子。效应的生物体或生物分子。现在学习的是第13页，共49页 超净工作台超净工作台小型小型X X射线衍射仪射线衍射仪CoCo6060射线机射线机现在学习的是第14页，共49页二、诱变育种的过程二、

9、诱变育种的过程前突变：诱变剂所造成的前突变：诱变剂所造成的DNA分子的某一位置的结分子的某一位置的结构改变。构改变。突变：由于染色体或基因本身的变化而产生的遗传性状突变：由于染色体或基因本身的变化而产生的遗传性状的变异。的变异。表型延迟：表型改变落后于基因型改变的现象表型延迟：表型改变落后于基因型改变的现象。现在学习的是第15页，共49页（一）诱变剂接触（一）诱变剂接触DNADNA分子前分子前1 1、细胞对诱变剂的透性将影响诱变效果。、细胞对诱变剂的透性将影响诱变效果。2 2、细胞质的某些组分和某些酶可和诱变剂相互作用而影响、细胞质的某些组分和某些酶可和诱变剂相互作用而影响诱变效果。诱变效果。

10、3 3、与基因所处的状态有关，而基因的状态又和培养、与基因所处的状态有关，而基因的状态又和培养条件有关。条件有关。现在学习的是第16页，共49页（二）（二）DNA损伤修复损伤修复光修复作用（光复活作用）光修复作用（光复活作用）切补修复切补修复 四种酶的作用：核酸内切酶四种酶的作用：核酸内切酶、核酸外、核酸外 切酶切酶、DNA多聚酶多聚酶、DNA连接酶连接酶重组修复重组修复SOS修复系统修复系统DNA聚合酶的矫正作用聚合酶的矫正作用现在学习的是第17页，共49页现在学习的是第18页，共49页（三）前突变到突变的过程（三）前突变到突变的过程校正差错：光复活作用、切补修复和校正差错：光复活作用、切补

11、修复和DNA多聚酶校正作用多聚酶校正作用 引起差错：重组修复和引起差错：重组修复和SOS修复系统修复系统 一切影响这些修复系统中的酶活性的因素都能影响由前突一切影响这些修复系统中的酶活性的因素都能影响由前突变向突变转变这一过程变向突变转变这一过程。诱变前后的处理可影响诱变的效果诱变前后的处理可影响诱变的效果：1、通过影响与、通过影响与DNA修复作用有关的酶的活性而影响诱变的修复作用有关的酶的活性而影响诱变的效果；效果；2、通过使诱变的目的基因处于活化状态、通过使诱变的目的基因处于活化状态(复制或转录状复制或转录状态态)，使之更容易被诱变剂所作用，从而影响目的基因的突，使之更容易被诱变剂所作用，

12、从而影响目的基因的突变率。变率。现在学习的是第19页，共49页(四四)从突变到突变型从突变到突变型1 1、分离性迟延、分离性迟延是经诱变处理后，细胞中的基因处于不纯的状态是经诱变处理后，细胞中的基因处于不纯的状态(野生野生型基因和突变型基因并存于同一细胞中型基因和突变型基因并存于同一细胞中)，突变型基因由于属于，突变型基因由于属于隐性基因而暂时得不到表达，需经过复制、分离，在细胞中处隐性基因而暂时得不到表达，需经过复制、分离，在细胞中处于纯的状态于纯的状态(一细胞中只有突变型基因，没有野生型基因一细胞中只有突变型基因，没有野生型基因)时，其性状才得以表达。时，其性状才得以表达。2 2、生理性迟

13、延、生理性迟延突变基因由杂合状态变为纯合状态时，还不一定出现突突变基因由杂合状态变为纯合状态时，还不一定出现突变表型，新的表型必须等到原有基因的产物稀释到某一程度后变表型，新的表型必须等到原有基因的产物稀释到某一程度后才能表现出来。才能表现出来。现在学习的是第20页，共49页三、诱变育种的步骤三、诱变育种的步骤q出发菌株的选择出发菌株的选择q处理菌悬液的制备处理菌悬液的制备q诱变处理诱变处理q中间培养中间培养q突变株的分离和筛选突变株的分离和筛选现在学习的是第21页，共49页现在学习的是第22页，共49页四、突变株的筛选四、突变株的筛选(一一)随机筛选随机筛选(二二)理性化筛选（定向筛选）理性

14、化筛选（定向筛选）运用遗传学、生物化学的原理，根据产物已知运用遗传学、生物化学的原理，根据产物已知的或可能的生物合成途径、代谢调控机制和产物分的或可能的生物合成途径、代谢调控机制和产物分子结构来进行设计和采用一些筛选方法，以打破微子结构来进行设计和采用一些筛选方法，以打破微生物原有的代谢调控机制，获得能大量形成产物的生物原有的代谢调控机制，获得能大量形成产物的高产突变株。高产突变株。现在学习的是第23页，共49页现在学习的是第24页，共49页1、初级代谢产物高产菌株的筛选初级代谢产物高产菌株的筛选普遍存在着反馈抑制和反馈阻遏，要打破反馈调节系统，普遍存在着反馈抑制和反馈阻遏，要打破反馈调节系统

15、，可从两个方面着手：可从两个方面着手：(1)(1)筛选细胞膜透性改变的突变株筛选细胞膜透性改变的突变株例如，谷氨酸发酵选育的高产菌株为谷氨酸棒杆菌的例如，谷氨酸发酵选育的高产菌株为谷氨酸棒杆菌的生物素营养缺陷型。生物素营养缺陷型。现在学习的是第25页，共49页1.1.（2 2）筛选）筛选营养缺陷型营养缺陷型突变株突变株 营养缺陷型营养缺陷型:诱变产生的缺乏合成某些营养物质的能诱变产生的缺乏合成某些营养物质的能力，须在基本培养基中加入相应的营养成分才能力，须在基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的变异株。正常生长的变异株。野生型野生型:与营养缺陷型对应的是野生型。与营养缺陷型对应的是野生型

16、。渗漏缺陷型渗漏缺陷型:是遗传性障碍不完全的营养缺陷型，突是遗传性障碍不完全的营养缺陷型，突变使某一种酶的活性下降而不是完全丧失，能少量变使某一种酶的活性下降而不是完全丧失，能少量地合成某一代谢产物。地合成某一代谢产物。现在学习的是第26页，共49页(2)(2)筛选结构类似物抗性突变株筛选结构类似物抗性突变株结结构构类类似似物物：在在化化学学和和空空间间结结构构上上和和代代谢谢的的中中间间物物（终终产产物物）相相似似，因因而而在在代代谢谢调调节节方方面面可可以以代代替替代代谢谢中中间间物物（终终产产物物）的的功功能能，但细胞不能以其作为自身的营养物质但细胞不能以其作为自身的营养物质现在学习的是

17、第27页，共49页2、次级代谢产物、次级代谢产物(主要是抗生素主要是抗生素)高产菌株的筛选高产菌株的筛选利用营养缺陷型筛选利用营养缺陷型筛选 筛选负变株或零变株的回复突变株筛选负变株或零变株的回复突变株 筛选去磷酸盐调节突变株筛选去磷酸盐调节突变株 筛选去碳源分解代谢调节突变株筛选去碳源分解代谢调节突变株筛选氨基酸结构类似物抗性突变株筛选氨基酸结构类似物抗性突变株 筛选二价金属离子抗性突变株筛选二价金属离子抗性突变株 筛选前体或前体结构类似物抗性突变株筛选前体或前体结构类似物抗性突变株筛选自身所产的抗生素抗性突变株筛选自身所产的抗生素抗性突变株现在学习的是第28页，共49页1、抗性筛选、抗性筛

18、选抗性突变株的筛选相对比较容易，只要有抗性突变株的筛选相对比较容易，只要有101066频率的突频率的突变体存在，就容易筛选出来变体存在，就容易筛选出来抗性突变株的筛选常用的有抗性突变株的筛选常用的有一次性筛选法和阶梯性筛选法一次性筛选法和阶梯性筛选法两种手段两种手段（三）理性化筛选的方法（三）理性化筛选的方法现在学习的是第29页，共49页（1 1）一次性筛选法）一次性筛选法一次性筛选法就是指在对出发菌株完全致死的环境中，一一次性筛选法就是指在对出发菌株完全致死的环境中，一次性筛选出少量抗性变异株次性筛选出少量抗性变异株u 抗噬菌体菌株筛选抗噬菌体菌株筛选u耐高温菌株筛选耐高温菌株筛选u耐高酒精

19、度、高渗透压的菌株耐高酒精度、高渗透压的菌株也可分别在高浓度酒精或加蔗糖也可分别在高浓度酒精或加蔗糖等造成的高渗环境下一次性筛选等造成的高渗环境下一次性筛选获得获得现在学习的是第30页，共49页（2 2）阶梯性筛选法）阶梯性筛选法无法知道微生物究竟能耐受多少高浓度的药物无法知道微生物究竟能耐受多少高浓度的药物药物的抗性变异也是逐步发展的，时间上是渐进的药物的抗性变异也是逐步发展的，时间上是渐进的梯度平板法梯度平板法纸片扩散法纸片扩散法现在学习的是第31页，共49页吡哆醇与代谢拮抗物异烟肼的分子结构吡哆醇与代谢拮抗物异烟肼的分子结构 梯度平板法也常用于抗代谢拮抗物突变株的筛选，梯度平板法也常用于

20、抗代谢拮抗物突变株的筛选，以提高相应代谢产物的产量。以提高相应代谢产物的产量。如：吡哆醇高产菌株筛选如：吡哆醇高产菌株筛选现在学习的是第32页，共49页u 梯度平板法梯度平板法(Gradient plate)现在学习的是第33页，共49页 纸片扩散法与梯度平板法纸片扩散法与梯度平板法的原理类似，用打孔器将较的原理类似，用打孔器将较厚的滤纸打成小圆片，并使厚的滤纸打成小圆片，并使纸片吸收一定浓度的药物，纸片吸收一定浓度的药物，经干燥或不经干燥，放入涂经干燥或不经干燥，放入涂布了菌悬液的平板上，一般布了菌悬液的平板上，一般9 9厘米的培养皿中等距放置三厘米的培养皿中等距放置三片为宜。经培养后观察围

21、绕片为宜。经培养后观察围绕纸片的抑菌圈，抑菌圈内出纸片的抑菌圈，抑菌圈内出现的可能就是抗性菌。现的可能就是抗性菌。纸片扩散法 现在学习的是第34页，共49页阶梯性筛选法的缺点阶梯性筛选法只有在抑制区域才能挑选抗性菌，而低浓度区域面积较大，优良的抗性突变株若被分散在低浓度区域或远离纸片的区域，则可能没有被检出，因此，漏检的几率较大。现在学习的是第35页，共49页2、营养缺陷型突变株筛选、营养缺陷型突变株筛选与筛选营养缺陷型有关的三类培养基与筛选营养缺陷型有关的三类培养基与筛选营养缺陷型有关的三类培养基与筛选营养缺陷型有关的三类培养基基基本本培培养养基基（MMMM，minimal minimal

22、mediummedium）：能能满满足足某某一一菌菌种种的的野野生型或原养型菌株营养要求的最低成分的合成培养基生型或原养型菌株营养要求的最低成分的合成培养基补充培养基（补充培养基（SMSM，supplemental mediumsupplemental medium）：）：在基本培养基在基本培养基中有针对性地补加某一种或几种营养成分，以满足相应的中有针对性地补加某一种或几种营养成分，以满足相应的营养缺陷型菌株生长需要（其他营养缺陷型仍不能生长）营养缺陷型菌株生长需要（其他营养缺陷型仍不能生长）的培养基的培养基完完全全培培养养基基（CMCM，complete complete mediummed

23、ium）：可可满满足足该该菌菌各各种种营营养养缺陷型菌株营养需要的天然或半合成培养基缺陷型菌株营养需要的天然或半合成培养基现在学习的是第36页，共49页营养缺陷型突变株的筛选方法营养缺陷型突变株的筛选方法1)1)淘汰野生型淘汰野生型p抗生素法：抗生素法：将将诱诱变变处处理理液液在在MMMM中中培培养养短短时时让让野野生生型型处处于于活活化化阶阶段段，而而缺缺陷陷型型处于休眠状态处于休眠状态且且在在培培养养基基中中加加入入一一定定量量的的抗抗生生素素，结结果果活活化化状状态态的的野野生生型型就就被被杀死，保存了缺陷型杀死，保存了缺陷型p菌丝过滤法：菌丝过滤法：对对于于霉霉菌菌，因因孢孢子子生生长

24、长后后会会长长出出菌菌丝丝体体，就就可可用用滤滤纸纸过过滤滤法法将将菌菌丝滤去，而缺陷型孢子却因未发芽而保留在处理液中丝滤去，而缺陷型孢子却因未发芽而保留在处理液中现在学习的是第37页，共49页2)2)检出缺陷型检出缺陷型原原理理：在在固固体体基基本本培培养养基基和和完完全全培培养养基基上上，生生长长情情况况完完全全不不同同，缺缺陷陷型型在在CMCM上上生生长长良良好好，而而在在MMMM上上则则不不生生长长，野野生生型都能生长型都能生长n n具体方法：影印法、点种法、夹层法具体方法：影印法、点种法、夹层法具体方法：影印法、点种法、夹层法具体方法：影印法、点种法、夹层法现在学习的是第38页，共4

25、9页现在学习的是第39页，共49页也称任意法也称任意法用用接接种种针针或或牙牙签签将将CMCM上上长长出出的的菌菌落落在在MMMM和和CMCM两两副副平平板板上上接接种种，依依次次在在相相应应位位置置点点种种，然然后后一一起起培培养养，观观察察其其生生长情况长情况此法结果明确，但工作量大此法结果明确，但工作量大 点种法点种法现在学习的是第40页，共49页先先在在培培养养皿皿上上倒倒一一层层基基本本琼琼脂脂培培养养基基，凝凝固固后后涂涂上上一一层层含含菌菌的的MMMM，凝凝固固后后再再倒倒一一薄薄层层MMMM琼琼脂脂培培养养基基，培培养养24h24h，将将出出现现的的菌菌落落标标记记，然然后后倒

26、倒上上一一层层CMCM琼琼脂脂培培养养基基，再再培培养。这时第二批长出的菌落就可能是缺陷型养。这时第二批长出的菌落就可能是缺陷型此此法法缺缺点点是是，结结果果有有时时不不明明确确，而而且且将将缺缺陷陷型型菌菌落落从从夹夹层中挑出并不很容易层中挑出并不很容易 夹层法夹层法现在学习的是第41页，共49页3)3)营养缺陷型生长谱的确定营养缺陷型生长谱的确定方法二方法二以以不不同同组组合合的的营营养养混混合合物物与与融融化化凉凉至至5050的的MMMM培培养养基基混混合合铺铺成成平平皿皿，然然后后在在这这些些平平皿皿上上划划线线接接种种各各个个缺缺陷陷型型菌菌株株于于各各相相应应位位置，培养后根据在这

27、些组合长出可推知其营养因子置，培养后根据在这些组合长出可推知其营养因子在在5 56 6个平皿上可测个平皿上可测2020株菌以上。株菌以上。现在学习的是第42页，共49页第三节第三节 杂交育种杂交育种杂交育种是指将两个基因型不同的菌株经吻合杂交育种是指将两个基因型不同的菌株经吻合(或接合或接合)使遗传物质重新组合，使遗传物质重新组合，从中分离和筛选具有新性状的菌株。从中分离和筛选具有新性状的菌株。杂交育种的目的在于：杂交育种的目的在于：（1）通过杂交使不同菌株的遗传物质进行交换和重新组合，从而改变原有菌株的）通过杂交使不同菌株的遗传物质进行交换和重新组合，从而改变原有菌株的遗传物质基础，获得杂种

28、菌株遗传物质基础，获得杂种菌株(重组体重组体)；（2）可以通过杂交把不同菌株的优良生产性能集中于重组体中，克服长期用诱变）可以通过杂交把不同菌株的优良生产性能集中于重组体中，克服长期用诱变剂处理造成的菌株生活力下降等缺陷；剂处理造成的菌株生活力下降等缺陷；（3）通过杂交，可以扩大变异范围，改变产品的质量和产量，甚至出现新的品种；）通过杂交，可以扩大变异范围，改变产品的质量和产量，甚至出现新的品种；（4）分析杂交结果，可以总结遗传物质的转移和传递规律，促进遗传学理论的发展。）分析杂交结果，可以总结遗传物质的转移和传递规律，促进遗传学理论的发展。现在学习的是第43页，共49页霉菌的杂交育种霉菌的杂

29、交育种准性生殖准性生殖(Parasexual reproduction)是指真菌中不通是指真菌中不通过有性生殖的基因重组过程。过有性生殖的基因重组过程。选择直接亲本选择直接亲本 异核体的形成异核体的形成 杂合双倍体的形成杂合双倍体的形成 体细胞重组体细胞重组 染色体交换染色体交换、染色体单倍化、染色体单倍化 现在学习的是第44页，共49页第四节第四节 原生质体技术育种原生质体技术育种一、原生质体制备一、原生质体制备1 1菌体的预处理菌体的预处理 （甘氨酸、（甘氨酸、EDTAEDTA、青霉素等）、青霉素等）2 2菌体的培养时间菌体的培养时间 （对数期、对数期到平稳期）（对数期、对数期到平稳期）3

30、 3酶浓度酶浓度 4 4酶解温度和酶解温度和pHpH5 5酶解时间酶解时间(20-40(20-40)6 6渗透压稳定剂渗透压稳定剂现在学习的是第45页，共49页二、原生质体融合二、原生质体融合二、原生质体的融合二、原生质体的融合 （PEGPEG和和CaCa2+2+)三、原生质体的再生三、原生质体的再生四、融合子的选择四、融合子的选择五、原生质体的诱变五、原生质体的诱变现在学习的是第46页，共49页第五节第五节 基因工程技术育种基因工程技术育种目的基因的获取目的基因的获取载体系统的选择载体系统的选择基因与载体的连接基因与载体的连接转化转化重组体的筛选和表达产物的鉴定重组体的筛选和表达产物的鉴定现在学习的是第47页，共49页现在学习的是第48页，共49页2022/9/27感感谢谢大大家家观观看看现在学习的是第49页，共49页