基因工程的基本操作步骤 课件.ppt

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1、关于基因工程的基本操作步骤 现在学习的是第1页，共29页思考思考:利用大肠杆菌产生人胰岛素的大致利用大肠杆菌产生人胰岛素的大致培育过程培育过程?基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序一、目的基因的获取一、目的基因的获取二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定现在学习的是第2页，共29页一、目的基因的获取一、目的基因的获取 主要是编码蛋白质的结构基因，也可以是一些具有调控作用的因子。现代获取方法：现代获取方法：1、从基因文库中获取目的基因、从基因文库中获取目的基因2、利用、利用PCR技术

2、扩增目的基因技术扩增目的基因3、化学方法人工合成、化学方法人工合成初始目的基因的来源初始目的基因的来源从生物中直接获取人工合成现在学习的是第3页，共29页1 1、从基因文库中获取目的基因、从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNADNA片断，导片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为生物的不同基因，称为基因文库基因文库。现在学习的是第4页，共29页提取某种生物的全部提取某种生物的全部DNADNA用适当的限制酶切用适当的限制酶切一定大小的一定大小的DNADNA片段片段将将DNAD

3、NA片段与载体连接片段与载体连接导入受体菌中储存导入受体菌中储存基因组文库基因组文库例：基因文库的构建方法之一例：基因文库的构建方法之一现在学习的是第5页，共29页某种生物的单链某种生物的单链mRNAmRNA单链互补单链互补DNADNA双链双链cDNAcDNA片段片段导入受体菌中储存导入受体菌中储存与载体连接与载体连接cDNAcDNA文库文库反（逆）转录酶反（逆）转录酶DNADNA聚合酶聚合酶反转录法：反转录法：cDNAcDNA的合成流程图解的合成流程图解例：基因文库的构建方法之一例：基因文库的构建方法之一现在学习的是第6页，共29页基因组文库和基因组文库和cDNA文库的主要区别文库的主要区别

4、 文库类型文库类型文库类型文库类型 cDNA cDNA文库文库文库文库 基因组文库基因组文库基因组文库基因组文库 文库大小文库大小文库大小文库大小基因中启动子（具有启基因中启动子（具有启基因中启动子（具有启基因中启动子（具有启动作用的动作用的动作用的动作用的DNADNA片段）片段）片段）片段）基因中内含子基因中内含子基因中内含子基因中内含子(位于编位于编位于编位于编码蛋白质序列的非编码码蛋白质序列的非编码码蛋白质序列的非编码码蛋白质序列的非编码DNADNA片段）片段）片段）片段）基因多少基因多少基因多少基因多少 物种间的基因交流物种间的基因交流物种间的基因交流物种间的基因交流小小大大无无有有无

5、无有有某种生物的某种生物的部分基因部分基因某种生物的某种生物的全部基因全部基因可以可以部分基因可以部分基因可以现在学习的是第7页，共29页怎样从基因文库中得到我们所需要怎样从基因文库中得到我们所需要的目的基因呢？的目的基因呢？现在学习的是第8页，共29页2、利用利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 多聚酶链式反应，在生物体外复制特定多聚酶链式反应，在生物体外复制特定DNADNA片段片段的核酸合成技术。可以在短时间内获得大量目的的核酸合成技术。可以在短时间内获得大量目的基因。基因。现在学习的是第9页，共29页循环循环变性变性退火退火延伸延伸现在学习的是第10页，共29页(二二)利用利用PC

6、RPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因现在学习的是第11页，共29页PCR技术扩增与技术扩增与DNA复制的比较复制的比较PCR技术技术DNA复制复制相相同同点点原理原理原料原料条件条件不不同同点点解旋解旋方式方式场所场所酶酶结果结果碱基互补配对碱基互补配对四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸模板、能量、酶模板、能量、酶DNA在高温下变性解旋在高温下变性解旋解旋酶催化解旋酶催化体外复制体外复制细胞核内细胞核内热稳定的热稳定的DNA聚合酶聚合酶细胞内的细胞内的DNA聚合酶聚合酶大量的大量的DNA片段片段形成整个形成整个DNA分子分子现在学习的是第12页，共29页二二.基因表达载体的构建基因表达载体的构建

7、-核心核心复制原点复制原点+启动子启动子+目的基因目的基因+终止子终止子+标志基因标志基因它们各自的它们各自的作用是什么作用是什么?现在学习的是第13页，共29页启动子：启动子：位于基因的首端的位于基因的首端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片断，它是片断，它是RNARNA聚合酶识别和结合的部位，聚合酶识别和结合的部位，有了它才能有了它才能驱动基因转录出驱动基因转录出mRNAmRNA，最终获得蛋白质，最终获得蛋白质终止子：终止子：位于基因的尾端的位于基因的尾端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片断，片断，能终止能终止mRNAmRNA的转录的转录标记基因标记基因的作用是的作用是为了为了鉴别鉴别受

8、受体细胞中是否含有目的基因，体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选从而将有目的基因的细胞筛选出来出来现在学习的是第14页，共29页基因表达载体的构建过程基因表达载体的构建过程质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端现在学习的是第15页，共29页载体载体与与表达载体表达载体的区别：二者都有标记基因和的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分复制原点两部分DNADNA片段。表达载体在载体基础上片段。表达载体在载体

9、基础上增加了增加了目的基因、启动子、终止子目的基因、启动子、终止子三部分结构三部分结构用到的工具酶：用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用既用到限制酶切割载体，又用到到DNADNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键的化学键都是磷酸二酯键启动子、终止子启动子、终止子对于目的基因表达必不可少对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载必需以表达载体的方式携带进去。体的方式携带进去。注意注意现在学习的是第16页，共29页三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞转化转化常用

10、的受体细胞：常用的受体细胞：有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。菌和动植物细胞等。将目的基因导入受体细胞的原理将目的基因导入受体细胞的原理借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。现在学习的是第17页，共29页三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞1.1.将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞转化转化基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法农杆菌转化法农杆菌转化法现在学习的是第18页，共29页三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞1.1.将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞转化

11、转化农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法2.2.将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞显微注射技术显微注射技术提纯基因表达载体提纯基因表达载体体外显微注射入受精卵体外显微注射入受精卵受精卵移植受精卵移植现在学习的是第19页，共29页三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞1.1.将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞转化转化农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法2.2.将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞显微注射技术显微注射技术3.3.将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞用用Ca2+处理细胞处理细

12、胞 感受态细胞感受态细胞 表达载体与表达载体与感受态细胞混合感受态细胞混合 感受态细胞吸收感受态细胞吸收DNA分子分子现在学习的是第20页，共29页1 1、检测转基因生物染色体的、检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入了上是否插入了目的基因目的基因 (关键步骤关键步骤).首先取出转基因生物的基因组首先取出转基因生物的基因组DNA.用含目的基因的用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等片段用放射性同位素等作标记作标记,以此做探针以此做探针.使探针和转基因生物的基因组杂交使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示若显示出杂交带出杂交带,表明染色体已插入染色体表明染色体已插入染色体DNA中中（1）

13、方法方法:DNADNA分子杂交分子杂交（2）过程）过程:四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定现在学习的是第21页，共29页归纳步骤现在学习的是第22页，共29页（二）、鉴定（个体生物学水平）（二）、鉴定（个体生物学水平）2 2、检测目的基因是否转录出了、检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA3 3、检测目的基因是否翻译成蛋白质、检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法:分子杂交技术分子杂交技术方法方法:抗原抗体杂交抗原抗体杂交过程过程:用上述探针和转基因生物的用上述探针和转基因生物的mRNA杂交杂交,若出若出现杂交带现杂交带

14、,表明目的基因转录出了表明目的基因转录出了mRNA现在学习的是第23页，共29页四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定检测检测鉴定鉴定检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等DNADNA分子杂交分子杂交分子杂交分子杂交（注意与上不同之处）（注意与上不同之处）抗原抗原抗体杂交抗体杂交现在学习的是第24页，共29页基基因因工工程程的的基基本本操操作作程

15、程序序目的基因的获取目的基因的获取基因表达载体的构建基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定1、从基因文库中获取目的基因、从基因文库中获取目的基因2、利用、利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因3、化学方法人工合成、化学方法人工合成复制原点复制原点 +目的基因目的基因 +启动子启动子 +终止子终止子 +标记基因标记基因农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射法、感受态细胞法农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射法、感受态细胞法DNADNA分子杂交技术、分子杂交技术、抗原分子杂交技术、分子杂交技术、抗原抗体杂交技术抗

16、体杂交技术分子检测外的个体水平鉴定分子检测外的个体水平鉴定现在学习的是第25页，共29页巩固练习巩固练习:1.人们常选用的细菌质粒分子往往带有一个抗生素抗性基因人们常选用的细菌质粒分子往往带有一个抗生素抗性基因,该抗性基该抗性基因的主要作用是因的主要作用是 ()A.提高受体细胞在自然环境中的耐药性提高受体细胞在自然环境中的耐药性B.有利于对目的基因是否导入进行检测有利于对目的基因是否导入进行检测C.增加质粒分子的分子量增加质粒分子的分子量D.便于与外源基因连接便于与外源基因连接2.在遗传工程技术中在遗传工程技术中,限制性内切酶主要用于限制性内切酶主要用于 ()A.目的基因的提取和导入目的基因的

17、提取和导入B.目的基因的提取和检测目的基因的提取和检测C.目的基因与载体的结合和导入目的基因与载体的结合和导入D.目的基因的提取与载体结合目的基因的提取与载体结合BD现在学习的是第26页，共29页3.1976年年,美国的科学家首次将人的生长抑制美国的科学家首次将人的生长抑制素释放因子的基因转移到大肠杆菌素释放因子的基因转移到大肠杆菌,并获得了并获得了表达表达,此文中的表达是指该基因在大肠杆菌此文中的表达是指该基因在大肠杆菌 ()A.能进行能进行DNA复制复制B.能传递给细菌后代能传递给细菌后代C.能合成生长抑制素释放因子能合成生长抑制素释放因子D.能合成人的生长素能合成人的生长素C现在学习的是第27页，共29页4.基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的,在基因操作的基本步骤中,不进行减基互补配对的步骤是 ()A.人工合成目的基因B.目的基因与载体结合C.将目的基因导入受体细胞D.目的基因的检测和表达C现在学习的是第28页，共29页感谢大家观看现在学习的是第29页，共29页