植物组织培养实验室的构建与操作技术.ppt

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1、关于植物组织培养实验室的构建与操作技术现在学习的是第1页，共83页实验室设计原则实验室设计原则：保证无菌操作，达到工作方便，防止污染。实验室的大小应取决于工作的目的和规模实验室的大小应取决于工作的目的和规模按组织培养流程来设计，避免某些环节倒排，引起日后按组织培养流程来设计，避免某些环节倒排，引起日后工作混乱工作混乱利用利用一一定的设备、器材和特殊的实验室结构设计，达定的设备、器材和特殊的实验室结构设计，达到严格无菌的条件到严格无菌的条件第一节植物组织培养实验室及主要设备第一节植物组织培养实验室及主要设备一、实验室设计与设备一、实验室设计与设备现在学习的是第2页，共83页组培的常见技术路线：组

2、培的常见技术路线：组培的常见技术路线：组培的常见技术路线：外植体外植体愈伤组织愈伤组织不定芽不定芽生根生根再生植株再生植株基本的工艺流程：基本的工艺流程：基本的工艺流程：基本的工艺流程：容器具洗涤，物质准备容器具洗涤，物质准备配置培养基并灭菌配置培养基并灭菌外植体消外植体消毒与无菌操作接种毒与无菌操作接种观察、记录、处理（脱分化、再分观察、记录、处理（脱分化、再分化、继代）化、继代）再生植株再生植株现在学习的是第3页，共83页标准标准的组培实验室的组培实验室洗涤室、准备室、无菌室、培养室、观察室等洗涤室、准备室、无菌室、培养室、观察室等基本基本组培实验室组培实验室准备室（含配药室）、缓冲间、无

3、菌操作室、准备室（含配药室）、缓冲间、无菌操作室、培养室培养室现在学习的是第4页，共83页现在学习的是第5页，共83页现在学习的是第6页，共83页功能：功能：进行一切与实验有关的准备工作进行一切与实验有关的准备工作器皿洗涤、药品的配制器皿洗涤、药品的配制培养基配制与分装培养基配制与分装培养基和培养器皿的灭菌培养基和培养器皿的灭菌培养材料的预处理等培养材料的预处理等要求：要求：明亮、通风明亮、通风便于多人同时工作便于多人同时工作地面应便于清洁，并应进行防滑处理地面应便于清洁，并应进行防滑处理1、准备室（化学实验室）、准备室（化学实验室）现在学习的是第7页，共83页准备室主要仪器设备：准备室主要仪

4、器设备：(1)工作台工作台(2)药品柜药品柜(3)冰箱冰箱 普通冰箱、低温冰箱等。主要用于贮存母液、普通冰箱、低温冰箱等。主要用于贮存母液、各种易变质、易分解的化学药品以及植物材料等。各种易变质、易分解的化学药品以及植物材料等。(4)天平天平 感量感量0.001g的分析天平、感量的分析天平、感量0.0001g的电子天平的电子天平（用于称量微量元素和一些较高精确度的实验用品）（用于称量微量元素和一些较高精确度的实验用品）、感量为、感量为0.1g的的托盘天平（用于称取用量较大的糖和托盘天平（用于称取用量较大的糖和琼脂等）琼脂等）放置在水平、干燥、不受震动的操作台上放置在水平、干燥、不受震动的操作台

5、上现在学习的是第8页，共83页现在学习的是第9页，共83页(5)恒温水浴锅恒温水浴锅(6)蒸馏水发生器蒸馏水发生器 蒸馏水用于配制母液或培养基（普通实蒸馏水用于配制母液或培养基（普通实验可以用自来水代替蒸馏水）验可以用自来水代替蒸馏水）(7)电炉电炉(8)高压灭菌锅高压灭菌锅 进行培养基、水和器械用具的灭菌进行培养基、水和器械用具的灭菌现在学习的是第10页，共83页不锈钢蒸馏水器（单蒸水）不锈钢蒸馏水器（单蒸水）现在学习的是第11页，共83页现在学习的是第12页，共83页(9)酸度计酸度计 测定培养基及酶制剂的测定培养基及酶制剂的pH值（普通实验值（普通实验可使用可使用pH试纸）试纸）(10)

6、烘箱烘箱 干燥洗净的玻璃器皿，也可用于干热灭菌干燥洗净的玻璃器皿，也可用于干热灭菌 和测定和测定干物重干物重(11)摇床摇床 振荡培养振荡培养(12)离心机离心机 分离培养基中的细胞以及解离细胞壁后的原生质体分离培养基中的细胞以及解离细胞壁后的原生质体现在学习的是第13页，共83页PHS-802中文台式酸度计中文台式酸度计通用型或经济型酸度计通用型或经济型酸度计全全温温型型恒恒温温培培养养摇摇床床多多振振幅幅高高速速轨轨道道摇摇床床现在学习的是第14页，共83页、缓冲室（注意门的朝向）、缓冲室（注意门的朝向）工作人员在此换上工作服、拖鞋，戴上口罩工作人员在此换上工作服、拖鞋，戴上口罩功能功能

7、减少人体从外界带入的尘埃等污染物。减少人体从外界带入的尘埃等污染物。要求要求 缓冲间需缓冲间需3-5平方米，应保持清洁无菌；平方米，应保持清洁无菌；有清洁的实验用拖鞋、已灭菌过的工作服；有清洁的实验用拖鞋、已灭菌过的工作服；1-2盏紫外灯定时照射，对衣物及空间进行灭菌。盏紫外灯定时照射，对衣物及空间进行灭菌。现在学习的是第15页，共83页、无菌操作室（接种室）、无菌操作室（接种室）功能功能 外植体消毒、接种、培养物的转移、试管苗的继代、原生质体的外植体消毒、接种、培养物的转移、试管苗的继代、原生质体的制备等制备等要求要求环境干爽，清洁，居于上风位环境干爽，清洁，居于上风位 空间宜小不宜大空间宜

8、小不宜大地面、天花板及四壁密闭光滑，无卫生死角地面、天花板及四壁密闭光滑，无卫生死角室内物品越少越好，尽可能减少空气流动室内物品越少越好，尽可能减少空气流动维护方法维护方法定期消毒（紫外线照射、气雾熏蒸、药品喷洒）定期消毒（紫外线照射、气雾熏蒸、药品喷洒）及时维护（干燥、洁净）及时维护（干燥、洁净）现在学习的是第16页，共83页现在学习的是第17页，共83页接种室主要设备及用具接种室主要设备及用具 接种箱接种箱 主体为玻璃箱罩、入口有袖罩主体为玻璃箱罩、入口有袖罩超净工作台超净工作台 操作台面半开放，方便、操作舒适；通过过滤的空气连续不断吹出，大于操作台面半开放，方便、操作舒适；通过过滤的空气

9、连续不断吹出，大于0.03um0.03um直径的微生物很难在工作台的操作空间停留直径的微生物很难在工作台的操作空间停留解剖镜解剖镜 分离微茎尖、转基因等分离微茎尖、转基因等无菌操作用的器具无菌操作用的器具 酒精灯、镊子、解剖刀，解剖刀片、剪刀、培养瓶，刀剪架等酒精灯、镊子、解剖刀，解剖刀片、剪刀、培养瓶，刀剪架等现在学习的是第18页，共83页现在学习的是第19页，共83页现在学习的是第20页，共83页、培养室、培养室功能功能 接种的材料进行培养生长的场所接种的材料进行培养生长的场所（其设计以充分利（其设计以充分利用空间和节省能源为原则）。用空间和节省能源为原则）。要求：要求：能控制光照和温度能

10、控制光照和温度保持相对的无菌环境保持相对的无菌环境有排风窗和换气扇等培养室的换气装置有排风窗和换气扇等培养室的换气装置有适宜的培养架，日光灯照明。有适宜的培养架，日光灯照明。主要设备主要设备 培养架、培养箱、空调机、除湿机、换气扇、臭培养架、培养箱、空调机、除湿机、换气扇、臭氧发生器等。氧发生器等。现在学习的是第21页，共83页现在学习的是第22页，共83页现在学习的是第23页，共83页小型臭氧发生器小型臭氧发生器现在学习的是第24页，共83页二、培养器皿及用具二、培养器皿及用具1 1、培养器皿、培养器皿（包括（包括玻璃玻璃器皿和器皿和塑料塑料器皿）器皿）各种规格的培养皿、三角瓶、试管、培养瓶

11、。各种规格的培养皿、三角瓶、试管、培养瓶。2 2、微孔过滤器、微孔过滤器（细菌过滤器）（细菌过滤器）0.450.45微米，抽滤灭菌用，如激素微米，抽滤灭菌用，如激素3 3、器械用具、器械用具 镊子、剪刀、解剖刀、接种针（铲）等。镊子、剪刀、解剖刀、接种针（铲）等。现在学习的是第25页，共83页现在学习的是第26页，共83页思考题思考题 1、一个正规的组织培养实验室应具备哪、一个正规的组织培养实验室应具备哪些房间？些房间？2、组织培养常用的设备有哪些？各有何、组织培养常用的设备有哪些？各有何用途？用途？现在学习的是第27页，共83页第二节培养基及其配制第二节培养基及其配制定义：定义：培养基培养基

12、(culture medium)(culture medium)根据植物生长所需营养根据植物生长所需营养成分，配制成的供植物生长的成分，配制成的供植物生长的人工制作人工制作的营养物质。的营养物质。是植是植物组织培养的物组织培养的重要基质重要基质。不同植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位不同植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同的组织对营养的要求也不相同没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官找到一合适的培养基，是培养成功的基础。找到一合适的培养基，是培养成功的基础。现在学习的是第28页，

13、共83页一培养基成分一培养基成分主要为：主要为：水水无机盐无机盐有机化合物有机化合物生长调节物质生长调节物质培养体的支持材料培养体的支持材料现在学习的是第29页，共83页水水水是植物体的重要组成成分，是一切代谢过程的水是植物体的重要组成成分，是一切代谢过程的介质和溶媒介质和溶媒，是生命活动过程中不可缺少的物质。，是生命活动过程中不可缺少的物质。培养基大部分是水（培养基大部分是水（固体培养基固体培养基 约约757580%80%）天然水或自来水天然水或自来水不能不能直接用于直接用于培养基配制培养基配制原生质体培养、细胞培养及分生组织培养一般应原生质体培养、细胞培养及分生组织培养一般应用用双蒸水或超

14、纯水双蒸水或超纯水。大批量快速繁殖培养，可用单蒸水或纯净水。大批量快速繁殖培养，可用单蒸水或纯净水。保持母液及培养基成分的保持母液及培养基成分的精确性精确性防止贮藏过程发霉变质防止贮藏过程发霉变质现在学习的是第30页，共83页无机盐类无机盐类(inorganic element(inorganic element）离体组织生长发育的基本成分，根据离体组织生长发育的基本成分，根据植物对必需元素需要的量，可以分为：植物对必需元素需要的量，可以分为：大量元素大量元素微量元素微量元素现在学习的是第31页，共83页大量元素大量元素指植物所需元素的浓度指植物所需元素的浓度大于大于0.5mmolL的元素，的

15、元素，有有C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S。除除C、H、O外，其它矿质元素通常以一定浓度的外，其它矿质元素通常以一定浓度的无机化合物无机化合物形式，按一定比例配制而成，溶于水中形式，按一定比例配制而成，溶于水中以离子态被吸收以离子态被吸收N有有硝态氮硝态氮KNO3和和铵态氮铵态氮(NH4)2SO4两种形式（两种形式（一一般般NH4N对植物生长较为有利对植物生长较为有利）。）。现在学习的是第32页，共83页微量元素微量元素浓度小于浓度小于0.5mmol0.5mmolL L的元素，有的元素，有 FeFe、CuCu、ZnZn等。等。铁盐在合成叶绿素中起重要作用，缺铁影响铁盐在合成叶绿素中起重要

16、作用，缺铁影响到胚的发育，阻碍子叶变绿。到胚的发育，阻碍子叶变绿。现在学习的是第33页，共83页3.有机化合物有机化合物(organiccompound)基本基本培养基（培养基（只含有大量和微量元素）只含有大量和微量元素）为使培养物的生长更好，还需添加各种有机成分：为使培养物的生长更好，还需添加各种有机成分：糖类、糖类、维生素、醇类、嘌呤、氨基酸维生素、醇类、嘌呤、氨基酸等等（）糖类（碳水化合物（）糖类（碳水化合物）碳源，维持培养基的渗透压在碳源，维持培养基的渗透压在1.5-4.1MPa。多使用。多使用蔗蔗糖糖。不同浓度会影响细胞的增殖分化，试管苗生长与繁殖浓度不同浓度会影响细胞的增殖分化，试

17、管苗生长与繁殖浓度2-3%，幼胚培养，幼胚培养4-6%，某些特殊培养中用，某些特殊培养中用8-10%。细胞和原生质体培养还用麦芽糖、葡萄糖、果糖细胞和原生质体培养还用麦芽糖、葡萄糖、果糖现在学习的是第34页，共83页（）维生素（）维生素明显的明显的促进促进离体培养物的离体培养物的生长生长。盐盐酸酸硫硫胺胺素素-VB1VB1、盐盐酸酸吡吡哆哆醇醇-VB6VB6、烟烟酸酸、生生物物素素、抗抗坏坏血血酸酸-VcVc等。等。一般用量为一般用量为0.10.11.0mg1.0mgL L。（）肌醇（）肌醇（环己六醇）（环己六醇）促进促进胚状体和芽的形成胚状体和芽的形成。用量一般。用量一般50-100mg/L

18、50-100mg/L。（）氨基酸（）氨基酸常用甘氨酸和多种氨基酸混合物（水解酪蛋白、水解乳蛋白）常用甘氨酸和多种氨基酸混合物（水解酪蛋白、水解乳蛋白）用量在用量在10-1000mg10-1000mgL L之间。之间。（营养丰富，极易引起污染营养丰富，极易引起污染，如在培养中无特别需要，以不用为宜。），如在培养中无特别需要，以不用为宜。）现在学习的是第35页，共83页（）（）天然复合物（包括部分蛋白质水解物）天然复合物（包括部分蛋白质水解物）其其成分比较复杂成分比较复杂，大多含氨基酸、激素、酶等一，大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。些复杂化合物。对细胞和组织的对细胞和组织的增殖与分化增殖与

19、分化有明显的促进作用，有明显的促进作用，但对器官的分化作用不明显。但对器官的分化作用不明显。成分大多不清楚，一般尽量避免使用。成分大多不清楚，一般尽量避免使用。现在学习的是第36页，共83页椰乳椰乳使用最多、效果最大。用量为使用最多、效果最大。用量为10%20%（愈伤、细胞培养）。（愈伤、细胞培养）。香蕉汁香蕉汁用量为用量为150-200mlL，缓冲，缓冲pH值（兰花组培）。值（兰花组培）。马铃薯马铃薯用量为用量为150200gL，缓冲，缓冲pH值。值。其他其他酵酵母母提提取取液液、麦麦芽芽提提取取液液、苹苹果果和和番番茄茄的的果果汁汁等等。遇遇热热较较稳稳定定，大大多在培养困难时使用，有时有

20、效。多在培养困难时使用，有时有效。现在学习的是第37页，共83页、生长调节物质（植物激素）、生长调节物质（植物激素）植物激素（植物激素（hormonehormone）是植物新陈代谢中）是植物新陈代谢中产生的天然化合物，能以产生的天然化合物，能以极微小的量极微小的量影响到影响到植物的细胞植物的细胞分化、分裂、发育分化、分裂、发育，影响到植物，影响到植物的的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老老和和休眠休眠以及以及萌发萌发等多种生理生化活动，是等多种生理生化活动，是培养基的培养基的关键物质关键物质。主要包括：主要包括：生长素、细胞分裂素、赤霉素生长素、细胞分裂

21、素、赤霉素生长素生长素0.05-5mgL细胞分裂素细胞分裂素0.0510mgL。现在学习的是第38页，共83页（）生长素类（）生长素类(auxin)u生长素主要被用于生长素主要被用于诱导愈伤诱导愈伤组织形成，促进细胞组织形成，促进细胞脱分化脱分化，诱导根诱导根的分化和的分化和促进促进细胞细胞伸长伸长生长。生长。u天然天然的生长素的生长素热稳定性差热稳定性差，高温高压或受光条件易被破坏。在，高温高压或受光条件易被破坏。在植物体内也易受到体内酶的分解。组织培养中常用植物体内也易受到体内酶的分解。组织培养中常用人工合成人工合成的生长素类物质的生长素类物质u常用常用IAAIAA、IBAIBA、NAAN

22、AA、2,4-D2,4-Du配成配成1mg/ml1mg/ml的溶液贮于冰箱中的溶液贮于冰箱中现在学习的是第39页，共83页IAA-IAA-天天然然生生长长素素，亦亦可可人人工工合合成成，其其活活力力较较低低，是是生生长长素素中中活活力力最最弱弱的的激激素素，对对器器官官形形成成的的副副作作用用小小，高高温温高高压压易易被被破破坏坏，受光也易分解受光也易分解NAA-NAA-启启动动能能力力比比IAAIAA高高出出3-43-4倍倍，可可大大批批量量人人工工合合成成，耐耐高高温高压，不易被分解破坏，应用较温高压，不易被分解破坏，应用较普遍普遍IBA-IBA-促进促进发根发根能力较强能力较强 NAAN

23、AA和和IBAIBA广广泛泛用用于于生生根根，并并与与细细胞胞分分裂裂素素互互作作促促进进芽的增殖和生长。芽的增殖和生长。2 2，4 4D D-启启动动能能力力比比IAAIAA高高1010倍倍，特特别别是是促促进进愈愈伤伤组组织织的的形形成成，同同时时强强烈烈抑抑制制芽芽的的形形成成，影影响响器器官官的的发发育育。适适宜宜的的用用量量范围较狭窄，过量常有范围较狭窄，过量常有毒效应毒效应现在学习的是第40页，共83页腺嘌吟的衍生物，包括腺嘌吟的衍生物，包括6-BA6-BA、KtKt、Zt Zt 等。其中等。其中ZtZt活性最强，活性最强，但非常昂贵，常用的是但非常昂贵，常用的是6-BA6-BA。

24、作用：作用：诱导诱导芽芽的分化的分化促进促进侧芽侧芽萌发生长萌发生长促进细胞促进细胞分裂与扩大（茎增粗）分裂与扩大（茎增粗），抑制根的分化，延缓衰，抑制根的分化，延缓衰老老多用于诱导不定芽的分化、芽的增殖。多用于诱导不定芽的分化、芽的增殖。（）细胞分裂素类（）细胞分裂素类(cytokinin(cytokinin，CTK)CTK)现在学习的是第41页，共83页（）（）赤霉素赤霉素（gibberellicacid）n有有2020多种，培养基中添加的是多种，培养基中添加的是GAGA3 3，一般极少使用一般极少使用n作用作用n促进幼苗促进幼苗茎的伸长茎的伸长生长生长n促进促进胚发育胚发育成小植株；成小

25、植株；n离体培养下，还与离体培养下，还与生长素生长素协调作用对协调作用对形成层分化形成层分化有影响有影响n当当生长素生长素赤霉素比值赤霉素比值高高，木质部分化木质部分化，比值低，韧皮部分化。，比值低，韧皮部分化。n打破休眠打破休眠，促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发。，促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发。n在器官形成后，添加赤霉素在器官形成后，添加赤霉素有时有时可促进器官或胚状体的生可促进器官或胚状体的生长长现在学习的是第42页，共83页激素配比模式激素配比模式 生长素生长素/细胞分裂素的比值决定分化发育的方向，是愈伤细胞分裂素的比值决定分化发育的方向，是愈伤组织、长根还是长芽。组织、长根还是长芽。生

26、长素生长素/细胞分裂素细胞分裂素高高 利于根、愈伤组织的形成利于根、愈伤组织的形成适中适中 利于根芽的分化利于根芽的分化低低 有利于芽的形成有利于芽的形成 生长素与细胞分裂素同时使用有生长素与细胞分裂素同时使用有协调协调作用。同时其在培养作用。同时其在培养基中的基中的绝对值绝对值也会影响外植体分化发育的方向。也会影响外植体分化发育的方向。现在学习的是第43页，共83页GrowthmediumisoptimisedforregenerationofplantletsNosucrose(0%)Sucrosereducedto1%Sucroseincreasedto5%Theexplantiscom

27、pletelycoveredwithgreenshoots,androotsaredevelopingonthelowersurfaceVeryfewshootshavedevelopedontheexplant.Norootsandnocallus.Shootsdevelopedonedgesofuppersurface,andsomerootdevelopmenthasoccuredShootshavedevelopedoverthesurfaceoftheexplant,alongwithrootsfromthelowersurface.Theresultiscomparablewith

28、thecontrolmediumtissuecultureintheAfricanViolet现在学习的是第44页，共83页No6-BA6-BAreducedto0.1mg.l-1NoNAAPoorshootdevelopmentandnoroots.ExtensivecallusgenerationPoorshootdevelopmentandnorootsNAAreducedto0.1mg.l-1Morebalanceddevelopmentofrootsandshoots.However,undifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesofthee

29、xplantProfusedevelopmentofrootsandareducednumberofshoots.Undifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplant现在学习的是第45页，共83页NAAincreasedto5.0mg.l-1Profusedevelopmentofrootsovertheexplantupperandlowersurface,andfewshoots.SomecallusNoMSsaltsNosignofregenerationfromexplantatall.MSsaltsreducedto0.47

30、g.l-1SomerootgrowthbutreduceddevelopmentofshootsMSsaltsincreasedto9.52g.l-1Shootsdevelopedonuppersurfaceofexplant.Norootsorcallus.现在学习的是第46页，共83页其它附加成分其它附加成分（）（）琼脂琼脂(agar)是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养。并不提供任何营养。组织培养中最常用作凝固剂，是组织培养中最常用作凝固剂，是最方便、最好的凝固剂和支持物，常用量最方便、最好的凝固剂和支持物，常用量6-10g

31、L，不是培养基必需成分。，不是培养基必需成分。（）活性炭（）活性炭(activecarbon)常用的吸附剂，某些培养类型中，可以吸附培养常用的吸附剂，某些培养类型中，可以吸附培养过程中产生的一些有毒物质，有利于培养物的生长。过程中产生的一些有毒物质，有利于培养物的生长。常用浓度常用浓度0.5%左右，其吸附作用选择性较差，常受温度左右，其吸附作用选择性较差，常受温度影响，低温吸附效果好，高温吸附能力降低甚至解吸附。影响，低温吸附效果好，高温吸附能力降低甚至解吸附。现在学习的是第47页，共83页二、常用培养基的种类、配方及特点二、常用培养基的种类、配方及特点、培养基种类、培养基种类根据作用分：根据

32、作用分：诱导诱导培养基：诱导外植体启动生长。培养基：诱导外植体启动生长。增殖增殖培养基：诱导离体培养苗扩大繁殖。培养基：诱导离体培养苗扩大繁殖。生根生根培养基：诱导离体培养苗生根。培养基：诱导离体培养苗生根。根据营养水平分：根据营养水平分：基本基本培养基：包含无机盐等基本营养成分。培养基：包含无机盐等基本营养成分。完全完全培养基：包含使植物离体生长全面营养。培养基：包含使植物离体生长全面营养。现在学习的是第48页，共83页培养基的种类培养基的种类16811681，出出现现由由无无机机盐盐组组成成的的SacksSacks和和KnopKnop溶溶液液，至至今今仍仍在在作为基本的无机盐培养基作为基本

33、的无机盐培养基4040年代多用年代多用WhiteWhite培养基培养基6060年年代代至至今今大大多多采采用用MSMS等等高高浓浓度度培培养养基基（可可以以保保证证培培养养材材料料对对营营养养的的需需要要，由由于于浓浓度度高高，在在配配制制、消消毒毒过过程程中中某某些些成成分分有有些些出出入入，也也不致影响培养基的离子平衡不致影响培养基的离子平衡）培养基的名称，多以发明人的名字来命名，也有培养基的名称，多以发明人的名字来命名，也有对某些成分进行改良称作对某些成分进行改良称作改良改良培养基。培养基。现在学习的是第49页，共83页MSMS培养基培养基 无机盐和离子浓度较高，硝酸盐含量较其他培养基为

34、高。无机盐和离子浓度较高，硝酸盐含量较其他培养基为高。B B5 5培养基培养基 含有较低的铵，双子叶植物特别是木本植物许多都适于用含有较低的铵，双子叶植物特别是木本植物许多都适于用B B5 5。WhiteWhite培养基培养基 19631963年年又又作作了了改改良良，称称作作WhiteWhite改改良良培培养养基基。无无机机机机盐盐数数量量较较低低，适适于生根培养。于生根培养。N N6 6培养基培养基 成成分分较较简简单单，KNOKNO3 3和和（NHNH4 4）2 2SOSO4 4含含量量高高。广广泛泛应应用用于于小小麦麦、水水稻稻及及其他植物的花药培养和其他组织培养。其他植物的花药培养和

35、其他组织培养。KMKM8P8P培养基培养基 有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合的有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合的培养。培养。现在学习的是第50页，共83页三、培养基的配制三、培养基的配制、母液的配制和保存、母液的配制和保存 母液是欲配制液的母液是欲配制液的浓缩液浓缩液保证各物质保证各物质成分的准确性成分的准确性，减少微量元素用减少微量元素用药称量误差药称量误差配制时能配制时能快速移取，快速移取，减少称药麻烦减少称药麻烦便于低温保藏。便于低温保藏。一般母液配成比所需浓度高一般母液配成比所需浓度高10-100倍。倍。现在学习的是第51页，

36、共83页注意事项注意事项浓度高耐贮存，但准确度低；浓度过低不耐贮浓度高耐贮存，但准确度低；浓度过低不耐贮避免不恰当混合引起沉淀避免不恰当混合引起沉淀母液保存在母液保存在5冰箱中，出现沉淀、霉变的不能使用冰箱中，出现沉淀、霉变的不能使用母液浓缩倍数母液浓缩倍数=（称取药物的量（称取药物的量1000ml）/（每升（每升培养基需药物量培养基需药物量母液体积）母液体积）现在学习的是第52页，共83页（）大量元素（）大量元素可以混在一起配制成可以混在一起配制成10100倍倍液（常用液（常用50倍）倍）高浓度高浓度的的Ca2+和和Mg2+会与磷酸盐混合，产生不溶性会与磷酸盐混合，产生不溶性沉淀，应单独配制

37、沉淀，应单独配制/或者单独配制或者单独配制CaClCaCl2 2 也可也可（）微量元素（）微量元素可配成可配成50-1000倍（常用倍（常用100、200倍）倍）混合母液，混合母液，KI可可单独配。单独配。现在学习的是第53页，共83页（）铁盐（）铁盐硫酸亚铁硫酸亚铁和和EDTA钠盐钠盐易沉淀，需单独易沉淀，需单独配制，配成配制，配成100200倍倍鳌合剂鳌合剂不易沉淀。不易沉淀。（）有机化合物（）有机化合物维生素、肌醇、氨基酸等一起配成维生素、肌醇、氨基酸等一起配成100或或200倍液，也可分别配制。倍液，也可分别配制。现在学习的是第54页，共83页（）激素（）激素 每种单独配成母液储于冰箱

38、，浓度一般为每种单独配成母液储于冰箱，浓度一般为0.51mg/ml。一般一次只配。一般一次只配50ml或或100ml。激素难溶于水，配制母液时用激素难溶于水，配制母液时用95%酒精酒精或或1NHCl，1NNaOH溶解后再定容。溶解后再定容。生长素类用生长素类用NaOH、细胞分裂素用、细胞分裂素用HCl溶解溶解现在学习的是第55页，共83页（6）有机附加物）有机附加物椰乳椰乳液体胚乳（纱布液体胚乳（纱布滤渣滤渣）-80水浴滤液（水浴滤液（20分钟）分钟）-过滤过滤（去蛋白）（去蛋白）-高温高压灭菌高温高压灭菌-冰箱保存冰箱保存酵母提取液酵母提取液酵母粉（加水煮沸酵母粉（加水煮沸30分钟）分钟）-

39、过滤去渣过滤去渣-消毒消毒现在学习的是第56页，共83页、培养基的配制及灭菌、培养基的配制及灭菌培养基配制程序：培养基配制程序：取适量蒸馏水放入容器将母液取出混合取适量蒸馏水放入容器将母液取出混合将琼脂和糖加入容器将琼脂和糖加入容器蒸馏水定容至蒸馏水定容至所需体积所需体积调整调整p分装培养瓶分装培养瓶培养基的灭菌：培养基的灭菌：培养基的灭菌：培养基的灭菌：湿热灭菌法，灭菌湿热灭菌法，灭菌1520min某些遇热不稳定的物质如某些遇热不稳定的物质如IAA、ZT等进行过（抽）滤灭等进行过（抽）滤灭菌菌现在学习的是第57页，共83页第三节外植体的选择与培养第三节外植体的选择与培养 植物细胞组织培养的成

40、败除与培养植物细胞组织培养的成败除与培养基的组分有关外，另一个重要因素就是基的组分有关外，另一个重要因素就是外植体本身，为了使外植体适于在离体外植体本身，为了使外植体适于在离体培养条件下生长，使组织培养工作顺利培养条件下生长，使组织培养工作顺利进行，有必要对外植体进行选择与处理。进行，有必要对外植体进行选择与处理。现在学习的是第58页，共83页一、外植体的选择一、外植体的选择有有代表性代表性的主要植物的主要植物优良优良的种质、的种质、特殊特殊的基因型的基因型在植株生长的最适时期取材（花药培养在在植株生长的最适时期取材（花药培养在单核期单核期取材）取材）大小一般在大小一般在0.5-1.0cm0.

41、5-1.0cm之间（胚胎培养或脱毒在之间（胚胎培养或脱毒在0.5cm0.5cm以下），以下），材料太大易污染，材料太小难于成活。材料太大易污染，材料太小难于成活。从从生长健壮生长健壮的的无病虫害无病虫害的植株上选取的植株上选取发育正常发育正常的器官和组织。的器官和组织。最好采用茎尖最好采用茎尖，后代性状较稳定，携带细菌较少。，后代性状较稳定，携带细菌较少。现在学习的是第59页，共83页二、外植体的灭菌二、外植体的灭菌外植体选取外植体选取 流水冲洗流水冲洗 （转入超净工作台）（转入超净工作台）70%酒精表面消毒酒精表面消毒2060s无菌水冲洗无菌水冲洗 消毒剂消毒剂处理处理 无菌水充分洗净备用无

42、菌水充分洗净备用三、外植体的接种（无菌操作）三、外植体的接种（无菌操作）外植体的接种是把经过表面灭菌后的植物材料切外植体的接种是把经过表面灭菌后的植物材料切碎或分离出器官、组织、细胞、转放到无菌培养基上碎或分离出器官、组织、细胞、转放到无菌培养基上的全部操作过程。的全部操作过程。整个过程均需无菌操作。整个过程均需无菌操作。（1）借助）借助接种用工具接种用工具将材料将材料切割切割分离。分离。现在学习的是第60页，共83页（2）将培养基放入超净工作台内，）将培养基放入超净工作台内，火焰灼烧培养基火焰灼烧培养基瓶口瓶口，然后打开培养瓶口，置培养瓶为，然后打开培养瓶口，置培养瓶为斜角斜角，避免，避免灰

43、尘杂菌落入瓶中。灰尘杂菌落入瓶中。（3）迅速将切割分离下的所需组织、细胞、器官，）迅速将切割分离下的所需组织、细胞、器官，放入培养基上，及时盖上瓶盖。放入培养基上，及时盖上瓶盖。（4）工具用后应及时灭菌，避免）工具用后应及时灭菌，避免交叉污染交叉污染。（5）工作人员操作时禁止不必要的谈话。）工作人员操作时禁止不必要的谈话。现在学习的是第61页，共83页四、外植体的培养四、外植体的培养主要因素：主要因素：光照、温度、湿度、氧气光照、温度、湿度、氧气、光照、光照光光照照强强度度、光光质质以以及及光光照照时时间间，对对细细胞胞的的增增殖殖、器器官官的的分分化化都都有有很很大大影影响响。除除特特殊殊要

44、要求求外外，一一般般都都采采用用日日光光灯灯作作光光源源，光光照照强强度度1000-5000Lx，根根据据不不同同植植物物或或器器官官需需要要，可可以以每每天天连连续续光光照照12-16小小时时，也也可可每每天天光光照照16小时，小时，8小时黑暗。小时黑暗。、温度、温度大大所所数数植植物物最最适适温温度度在在23-32之之间间。培培养养室温度是室温度是252。现在学习的是第62页，共83页、湿度、湿度培养瓶内相对湿度常是培养瓶内相对湿度常是100%，培养室一般要求相对湿度保持在，培养室一般要求相对湿度保持在70-80%，相对湿度，相对湿度过低影响培养物生长和分化，应向室内喷洒水，以提高湿度过低

45、影响培养物生长和分化，应向室内喷洒水，以提高湿度；过高杂菌滋生，大量污染，应及时地通风除湿；过高杂菌滋生，大量污染，应及时地通风除湿。、氧气、氧气接接种种时时要要有有部部分分组组织织和和空空气气接接触触。振振荡荡培培养养是是解解决决通通气气的的良良好好办办法法。固固体体培培养养中中，如如瓶瓶塞塞不不透透气气，培培养养物物也也不不能能生生长长，要要选选择择通通气气性性好好的的培培养养瓶瓶盖盖，增增加加可可利利用用的的氧氧气气，迅迅速速除除去去释释放放出出来来的的CO2，有有利利于于外外植植体外层细胞开始分裂。体外层细胞开始分裂。、pH值值不同的植物对培养基最适不同的植物对培养基最适pH值的要求也

46、是不同的，值的要求也是不同的，大多在大多在56.5左右，左右，一般培养基皆要求一般培养基皆要求5.8，这基本能适应大多植物培养的需要。这基本能适应大多植物培养的需要。现在学习的是第63页，共83页五、外植体的成苗途径五、外植体的成苗途径外植体的成苗途径有三种：外植体的成苗途径有三种：（一）外植体（一）外植体-愈伤组织愈伤组织-完整植株完整植株同时长芽和根同时长芽和根-植株植株芽芽-根根-植株植株根根-芽芽-植株植株（二）外植体（二）外植体-胚状体胚状体-植株植株a)器官上器官上b)愈伤组织愈伤组织c)游离单细胞游离单细胞d)小孢子小孢子 诱导胚状体比诱导芽诱导胚状体比诱导芽数量多、速度快、结构

47、完整数量多、速度快、结构完整（三）（三）外植体外植体-直接形成根与芽直接形成根与芽-植株植株现在学习的是第64页，共83页六、培养中常见问题六、培养中常见问题（一）一）污染污染 病原菌病原菌：细菌、真菌细菌、真菌细菌细菌污染：菌斑呈污染：菌斑呈黏液状黏液状，接种后，接种后1-2天发现。天发现。污染途径：外植体带菌；培养基及器皿灭菌不彻底污染途径：外植体带菌；培养基及器皿灭菌不彻底操作人员未遵守操作规程操作人员未遵守操作规程 真菌真菌污染：污染部分长有不同颜色的污染：污染部分长有不同颜色的霉菌霉菌，接种后，接种后3-10天天发现。发现。污染途径：周围环境不清洁；超净工作台过滤装置污染途径：周围环

48、境不清洁；超净工作台过滤装置失效；培养瓶的口径过大失效；培养瓶的口径过大在组织培养过程中培养基和在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象养失败的现象现在学习的是第65页，共83页现在学习的是第66页，共83页2、污染的预防措施（、污染的预防措施（6点）点）（）防止材料带菌的措施（）防止材料带菌的措施茎尖作外植体时，进行茎尖作外植体时，进行预培养预培养（无糖）或暗培养，（无糖）或暗培养，以以新抽嫩枝新抽嫩枝作外植体。作外植体。晴天晴天取材，取材，下午下午取材，经日晒可杀死部分细菌或取材，经日晒可杀死部分细菌或真菌真菌接种时除接种时除去外部韧皮去外部韧皮

49、组织，只接内部的分生组织。组织，只接内部的分生组织。（2）外植体的灭菌）外植体的灭菌 多次多次灭菌法：次氯酸钠灭菌法：次氯酸钠-无菌水无菌水-次氯酸钠次氯酸钠多药剂多药剂交替法：肥皂水交替法：肥皂水-酒精酒精-次氯酸钠次氯酸钠-无菌水无菌水现在学习的是第67页，共83页器皿与金属器械的灭菌器皿与金属器械的灭菌玻璃器皿可采用湿热灭菌或玻璃器皿可采用湿热灭菌或干热干热干热干热灭菌灭菌金属器皿一般金属器皿一般火焰火焰灭菌，灭菌，也可干热灭菌也可干热灭菌（135-140135-140摄氏度灭菌摄氏度灭菌3-5h3-5h；160-170160-170摄氏度灭菌摄氏度灭菌2-4h2-4h；180180-2

50、00-200摄氏度灭菌摄氏度灭菌0.5-0.5-1h1h）布质制品的灭菌布质制品的灭菌 湿热灭菌湿热灭菌无菌操作室的灭菌无菌操作室的灭菌 2%新洁尔灭或新洁尔灭或70%酒精擦拭（喷雾），紫外灯照射，定期甲酒精擦拭（喷雾），紫外灯照射，定期甲醛和高锰酸钾熏蒸。醛和高锰酸钾熏蒸。严格按照无菌操作程序进行严格按照无菌操作程序进行在干燥环境（如火焰在干燥环境（如火焰或干热空气）进行灭或干热空气）进行灭菌的技术菌的技术现在学习的是第68页，共83页（二）（二）褐变褐变a.a.基因型基因型b.b.外植体的生理状态外植体的生理状态幼年的材料、分生组织含醌类物质较少幼年的材料、分生组织含醌类物质较少c.c.培