细胞生物学常用技术讲稿.ppt

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1、关于细胞生物学常用技术第一页，讲稿共二十九页哦第二页，讲稿共二十九页哦 2.应用 (1)条件 可检测、可摄入 (2)方法 放射自显影（autoradiography）蛋白质 -aa DNA-TDNA-T RNA-URNA-U 脉冲标记脉冲标记第三页，讲稿共二十九页哦A 放射性物质脉冲掺入活细胞B 不同时间取样切片C 暗处曝光D 显影、定影 第四页，讲稿共二十九页哦胰岛素合成分泌过程第五页，讲稿共二十九页哦第六页，讲稿共二十九页哦(二)抗体示踪技术 1.抗体+荧光染料 光学显微镜光学显微镜 GFP GFP GFP融合剪切体蛋白第七页，讲稿共二十九页哦2.2.抗体+电子致密物 电子显微镜电子显微镜

2、 胶体金抗体标记胰岛素第八页，讲稿共二十九页哦六、细胞分子生物学技术1.聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）特异性体外DNA扩增技术 利用针对目的基因所设计的一对 特异寡核苷酸引物，以目的基因 为模板，以dNTP为原料，在DNA聚 合酶作用下进行的DNA体外合成技 术。第九页，讲稿共二十九页哦 （1）反应体系：模板链 DNA DNA 聚合酶 dNTPdNTP 引物（primer）（与模板相应序列互补）（2）反应步骤：变性 94 退火 55 延伸 72 第十页，讲稿共二十九页哦2.Real time PCR 实时定量PCR(荧光定量PCR)通过对PCR 扩

3、增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。荧光信号指数扩增阶段荧光信号指数扩增阶段PCR产物量的对产物量的对数值与起始模板数值与起始模板量呈线性关系量呈线性关系荧光背景信号阶段荧光背景信号阶段平台期平台期以反应管中荧光强度达到阈值时所需的PCR反应循环个数（Cp值），表示模板中目的片段的初始含量。第十一页，讲稿共二十九页哦3.核酸分子杂交 (1)Southern blotting DNA 将凝胶分离的DNA转移到固相支持膜上,然后与存 在于液相中的标记探针进行杂交,以检测特定DNA序 列的技术.(2)Northern blotting RNARNADNA DN

4、A RNADNA RNA RNA 特异性探针特异性探针第十二页，讲稿共二十九页哦A 基因组DNA的消化B 琼脂糖凝胶电泳分离C 转膜 D 杂交E 放射自显影第十三页，讲稿共二十九页哦(3)原位杂交技术（in situ hybridization）用核酸探针与细菌、细胞或组织切片中的核酸进 行杂交，以检测特定核酸分子在细胞内原有位置 的方法。FISH第十四页，讲稿共二十九页哦4.基因转移技术 应用物理、化学或生物学等技术和方法将外源基因转移到受体菌或细胞内，并使其在细胞内实现转入基因的扩增或表达。外源基因 细菌 转化 真核细胞 转染基因扩增蛋白质表达载体第十五页，讲稿共二十九页哦(1)(1)限制

5、性核酸内切酶限制性核酸内切酶 限制性内切酶限制性内切酶：识别DNA分子内由48个碱基构成的特定序列的酶，这些酶的识别位点大多是“回文”序列。粘性末端平滑末端 第十六页，讲稿共二十九页哦第十七页，讲稿共二十九页哦第十八页，讲稿共二十九页哦(2)质粒载体克隆第十九页，讲稿共二十九页哦第二十页，讲稿共二十九页哦(3)克隆基因的表达在细菌中的表达第二十一页，讲稿共二十九页哦在动物细胞中的表达第二十二页，讲稿共二十九页哦5.抑制基因表达技术 研究基因功能及调控 疾病的防治 RNA干扰技术 将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA导入细胞，使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。

6、第二十三页，讲稿共二十九页哦起始阶段：双链RNA导入细胞 siRNA(21-23)（short interfering RNAs）效应阶段：RNA诱导沉默复合物 RISC 解链 结合mRNA （RNA induced silencing complex）（降解）DicerATP基本原理第二十四页，讲稿共二十九页哦6.免疫沉淀技术(immuno-precipitation,IP)是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌的Protein A或G特异性地结合到免疫球蛋白的Fc片段的现象而发展的可以研究蛋白质相互作用的方法。研究蛋白质相互作用 基本过程 制备细胞裂解液 抗体-凝胶颗粒或磁珠孵育细胞裂解液

7、沉淀目的蛋白及相互作用蛋白 分析 SDS-PAGE Western blot 质谱第二十五页，讲稿共二十九页哦免疫沉淀过程免疫沉淀过程第二十六页，讲稿共二十九页哦7.染色质免疫沉淀技术 (chromotin immunoprecipitation,ChIP)研究蛋白质与DNA相互作用的一种方法，即确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质基本过程 甲醛处理细胞 超声破碎染色质 加入目的蛋白的抗体，形成抗体-靶蛋 白-DNA复合物 沉淀复合物 分析DNA片段-PCR 第二十七页，讲稿共二十九页哦染色质交联DNA超声处理DNA/蛋白共沉淀交联解除目的基因检测第二十八页，讲稿共二十九页哦感感谢谢大大家家观观看看第二十九页，讲稿共二十九页哦