细胞工程基本技术课件.ppt

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1、细胞工程基本技术第1页，此课件共116页哦基本技术u实验室条件 u无菌技术u 显微技术u细胞观察与分析u细胞分离u细胞保存与复苏第2页，此课件共116页哦实验室基本组成u细胞工程实验室它必须满足三个基本的需要，即：实验准备，包括培养基配制，洗涤与灭菌等；无菌操作；控制培养。第3页，此课件共116页哦基本实验室u准备室：准备室的功能就是进行一切与实验有关的准备工作。要求宽敞明亮，通风条件好。u接种室：接种室的功能是进行无菌操作。要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌。房间一般不宜过大，其规模根据实验需要而定。接种室除了出入口和通气口外，应行密闭。u培养室：培养室的功能是对离体材料进行控制培养

2、。其首要要求是要能控制光照和温度，其次为防止微生物感染，培养室应保持干燥和清洁。第4页，此课件共116页哦辅助实验室u细胞学实验室：其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。u摄影室及暗室：其功能是进行培养材料的摄影记录和胶片冲印。在有条件的情况下可建立此实验室。u生化分析室：在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。第5页，此课件共116页哦实验室布局的基本要求u便于隔离、便于操作、便于灭菌、便于观察。第6页，此课件共116页哦实验用品及主要设备u玻璃器皿u常用器械u细胞培

3、养的主要设备第7页，此课件共116页哦玻璃器皿u液体储存瓶u吸管u离心管u培养皿u培养瓶与培养板u其它器皿1第8页，此课件共116页哦常用器械u解剖刀、镊子、剪刀、洗耳球、封口膜、酒精灯等第9页，此课件共116页哦胞培养的主要设备u基本设备：冰箱、天平、酸度计、纯水器、电炉、培养基分装器、搅拌器。u灭菌设备：蒸汽压力灭菌锅、烘箱、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。u无菌操作设备：净化工作台、接种箱。u光温控制设备：时间程序控制器、空调及温度感应器。u细胞培养设备：培养设备根据需要而定，包括培养架、培养箱、摇床、生物反应器等。u细胞学鉴定设备：光学研究显微镜、倒置显微镜等。u u 除上述基本设备

4、外，如果有条件和需要还可配制摄影设备、生化分析设备等。第10页，此课件共116页哦无菌技术u 无菌技术是一个技术体系，涉及多方无菌技术是一个技术体系，涉及多方面因素、多个环节，只有诸因素和环节面因素、多个环节，只有诸因素和环节都处理好，才能达到无菌。都处理好，才能达到无菌。u 培养基培养基u 器皿材料器皿材料u 接种工具接种工具u 操作环境操作环境u 培养室培养室u 工作台面工作台面u 具体的灭菌方法有多种具体的灭菌方法有多种u 污染检测与控制污染检测与控制第11页，此课件共116页哦玻璃器皿清洗u浸泡刷洗浸酸冲洗第12页，此课件共116页哦无菌室无菌室u无菌操作室和无菌培养室无菌操作室和无菌

5、培养室u要求：墙壁光滑、地面平坦无缝，门窗要求：墙壁光滑、地面平坦无缝，门窗密闭，无空气对流密闭，无空气对流第13页，此课件共116页哦灭菌种类u物理灭菌：高温高压灭菌、干热灭菌、物理灭菌：高温高压灭菌、干热灭菌、射线辐照灭菌、过滤灭菌射线辐照灭菌、过滤灭菌u化学灭菌：熏蒸灭菌、消毒液灭菌（酒化学灭菌：熏蒸灭菌、消毒液灭菌（酒精、升汞、漂白粉、新洁尔灭、次氯酸精、升汞、漂白粉、新洁尔灭、次氯酸钠、次氯酸钙、过氧化氢）钠、次氯酸钙、过氧化氢）u抗生素消毒：在动物细胞培养中，常采抗生素消毒：在动物细胞培养中，常采用青霉素、链霉素、卡那霉素、制霉菌用青霉素、链霉素、卡那霉素、制霉菌素等抗生素抑制细菌

6、、真菌等污染。素等抗生素抑制细菌、真菌等污染。u根据灭菌对象选择不同的灭菌方法根据灭菌对象选择不同的灭菌方法第14页，此课件共116页哦高温高压灭菌u原理：在原理：在121高温和高温和0.8kg/cm0.8kg/cm2 2-1.1kg/cm1.1kg/cm2 2的压力下，一般持续的压力下，一般持续15-2015-20分钟分钟后，就可杀死一切微生物的营养体及其后，就可杀死一切微生物的营养体及其孢子。孢子。u适用于器皿、工具、衣物和培养基适用于器皿、工具、衣物和培养基灭菌。灭菌。第15页，此课件共116页哦干热灭菌法干热灭菌法u将物品放入烘箱，利用高温使微将物品放入烘箱，利用高温使微生物细胞内的蛋

7、白质凝固而达到灭菌的生物细胞内的蛋白质凝固而达到灭菌的目的。目的。u适用于玻璃器皿。适用于玻璃器皿。第16页，此课件共116页哦射线灭菌u紫外光常用于培养室和接种箱或超紫外光常用于培养室和接种箱或超净台的灭菌。操作前开灯净台的灭菌。操作前开灯2020分钟可达到分钟可达到灭菌效果。灭菌效果。第17页，此课件共116页哦过滤灭菌u原理：将带菌的液体或气体通过孔径小原理：将带菌的液体或气体通过孔径小于于0.45uM0.45uM微孔装置，使杂菌留在滤板上微孔装置，使杂菌留在滤板上而液体或气体进入无菌空瓶中，从而达而液体或气体进入无菌空瓶中，从而达到除菌目的。到除菌目的。u常用于不能以高温高压灭菌的培养

8、液、常用于不能以高温高压灭菌的培养液、有机物质溶液和酶液的除菌。有机物质溶液和酶液的除菌。u组织培养中常用的过滤除菌器是滤膜过组织培养中常用的过滤除菌器是滤膜过滤器，它清洗方便，过滤效果好。滤器，它清洗方便，过滤效果好。第18页，此课件共116页哦蒸灭菌u用能杀死微生物的蒸汽进行灭菌，用能杀死微生物的蒸汽进行灭菌，适用于无菌室的定期灭菌。适用于无菌室的定期灭菌。u常用的方法是将甲醛和高锰酸钾常用的方法是将甲醛和高锰酸钾混合后，产生大量蒸气，以杀死微生物，混合后，产生大量蒸气，以杀死微生物，效果较好。效果较好。第19页，此课件共116页哦消毒液灭菌u 依化学灭菌剂的不同而适用于不同依化学灭菌剂的

9、不同而适用于不同场合的灭菌。场合的灭菌。u70%70%酒精几乎适用于组织培养中如各酒精几乎适用于组织培养中如各种器皿、培养材料、无菌室、接种箱、种器皿、培养材料、无菌室、接种箱、工作台、操作人员的手等；工作台、操作人员的手等；u升汞、漂白粉、新洁尔灭、次氯酸升汞、漂白粉、新洁尔灭、次氯酸钠、次氯酸钙、过氧化氢、抗菌素等适钠、次氯酸钙、过氧化氢、抗菌素等适用于培养材料的灭菌。用于培养材料的灭菌。第20页，此课件共116页哦室内灭菌室内灭菌u2%2%的新洁尔灭擦洗，的新洁尔灭擦洗，u70%70%乙醇喷雾，乙醇喷雾，u紫外灯照射约紫外灯照射约2020分钟分钟u定期用甲醛和高锰酸钾熏蒸定期用甲醛和高锰

10、酸钾熏蒸第21页，此课件共116页哦试剂和器皿的灭菌试剂和器皿的灭菌u包括培养基、特殊药品和所有无菌操作包括培养基、特殊药品和所有无菌操作使用的器皿的灭菌使用的器皿的灭菌u培养基通常使用灭菌锅通过高压蒸汽灭培养基通常使用灭菌锅通过高压蒸汽灭菌进行灭菌菌进行灭菌第22页，此课件共116页哦污染检测与控制污染检测与控制u细菌：可采用抗生素预防u真菌：可采用抗真菌剂防治u支原体：可采用抗生素、加温处理（41）、使用支原体特异性血清u病毒：脱毒u细胞交叉污染：严格操作规程第23页，此课件共116页哦显微技术u显微观察技术：u显微操作技术：借助显微操作仪采用细微玻璃针或用微吸管、微电极、微热电偶等可进行

11、细胞解剖、物质的抽取及注入、移植等操作。第24页，此课件共116页哦细胞观察与分析u细胞计数与活力分析u细胞固定与染色观察u凋亡细胞观察u染色体分析第25页，此课件共116页哦细胞计数与活力分析u采用血细胞计数法计数u活力分析：台盼蓝染色法：死细胞着色 MTT：活细胞使其还原为兰色，用酶标仪测定490nm 处的光密度，计算细胞相对活力 第26页，此课件共116页哦血球计数板第27页，此课件共116页哦计数法第28页，此课件共116页哦细胞固定与染色观察u细胞固定甲醇-醋酸FAACarnoyu细胞染色苏木精-伊红（H.E)染色法Giemsa染色法Feulgen染色法考马斯蓝染色法免疫荧光法免疫过

12、氧化物酶染色法第29页，此课件共116页哦凋亡细胞观察u形态观察:u生化分析:锚定蛋白:检测凋亡早期PI:检测晚期或死细胞u分子技术:梯形电泳图谱第30页，此课件共116页哦PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面 第31页，此课件共116页哦FITC-AnnexinV染色第32页，此课件共116页哦FITC-AnnexinV和PI染色第33页，此课件共116页哦梯形电泳图谱第34页，此课件共116页哦染色体分析u样品处理:秋水仙素u低渗处理u固定化u染色观察第35页，此课件共116页哦细胞分离u细胞初步分离差速离心分离法u 单个细胞的获得 软琼脂培养法 和 有限稀释法 显微操作分离法 流式细胞

13、仪分离 激光捕获显微切割 免疫磁珠分离 第36页，此课件共116页哦细胞保存与复苏u目前广泛应用的细胞保存方法是低温冷冻保存法预保留细胞经消化分散后，加入冷冻保护液，同时将细胞悬液稀释按1ml/安瓿分装细胞悬液，在火焰下将安瓿封口。将封口的安瓿放入慢冻机内，按1/min的速度缓慢冷冻，使温度降至-25冻结好的安瓿放入CO2低温冰柜或液氮罐中，温度达-150-190 如果需要复苏，可将安瓿取出后立即放入37 水浴中，使其快速融化第37页，此课件共116页哦思考题u植物组织培养的基本实验室有哪些？实验室布局的基本要求是什么？u消毒灭菌种类有哪几类？u使用高压锅的基本步骤是什么？u用血球计数板进行计

14、数时，细胞数/L=N*25/5*10*106*稀释倍数，N指什么？u对细胞进行染色体分析中，样品处理时加秋水仙素起什么作用？u简述细胞低温冷冻保存的方法第38页，此课件共116页哦第三章、细胞工程基本技术第39页，此课件共116页哦基本技术u实验室条件 u无菌技术u 显微技术u细胞观察与分析u细胞分离u细胞保存与复苏第40页，此课件共116页哦实验室条件 u实验室基本组成u实验用品及主要设备第41页，此课件共116页哦实验室基本组成u细胞工程实验室它必须满足三个基本的需要，即：实验准备，包括培养基配制，洗涤与灭菌等；无菌操作；控制培养。第42页，此课件共116页哦基本实验室u准备室：准备室的功

15、能就是进行一切与实验有关的准备工作。要求宽敞明亮，通风条件好。u接种室：接种室的功能是进行无菌操作。要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌。房间一般不宜过大，其规模根据实验需要而定。接种室除了出入口和通气口外，应行密闭。u培养室：培养室的功能是对离体材料进行控制培养。其首要要求是要能控制光照和温度，其次为防止微生物感染，培养室应保持干燥和清洁。第43页，此课件共116页哦辅助实验室u细胞学实验室：其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。u摄影室及暗室：其功能是进行培养材料的摄影记录和胶片冲印。在有条件的情况下可建立此实验室。u生化分析

16、室：在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。第44页，此课件共116页哦实验室布局的基本要求u便于隔离、便于操作、便于灭菌、便于观察。第45页，此课件共116页哦实验用品及主要设备u玻璃器皿u常用器械u细胞培养的主要设备第46页，此课件共116页哦玻璃器皿u液体储存瓶u吸管u离心管u培养皿u培养瓶与培养板u其它第47页，此课件共116页哦培养器皿1第48页，此课件共116页哦培养器皿2第49页，此课件共116页哦常用器械u解剖刀、镊子、剪刀、洗耳球、封口膜、酒精灯等第50页，此课件共116页哦常用器械第51页，此课件共116页

17、哦细胞培养的主要设备u基本设备：冰箱、天平、酸度计、纯水器、电炉、培养基分装器、搅拌器。u灭菌设备：蒸汽压力灭菌锅、烘箱、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。u无菌操作设备：净化工作台、接种箱。u光温控制设备：时间程序控制器、空调及温度感应器。u细胞培养设备：培养设备根据需要而定，包括培养架、培养箱、摇床、生物反应器等。u细胞学鉴定设备：光学研究显微镜、倒置显微镜等。u u 除上述基本设备外，如果有条件和需要还可配制摄影设备、生化分析设备等。第52页，此课件共116页哦电子天平 第53页，此课件共116页哦酸度计 第54页，此课件共116页哦不锈钢蒸馏水器第55页，此课件共116页哦双重蒸馏水器

18、第56页，此课件共116页哦磁力搅拌器第57页，此课件共116页哦灭菌锅第58页，此课件共116页哦灭菌锅 第59页，此课件共116页哦烘箱第60页，此课件共116页哦过滤灭菌装置第61页，此课件共116页哦紫外灯 第62页，此课件共116页哦超净工作台 第63页，此课件共116页哦培养架 第64页，此课件共116页哦光照培养箱 第65页，此课件共116页哦摇床第66页，此课件共116页哦生物反应器1第67页，此课件共116页哦生物反应器2第68页，此课件共116页哦植物细胞培养反应器第69页，此课件共116页哦显微镜第70页，此课件共116页哦无菌技术u 无菌技术是一个技术体系，涉及多方无菌

19、技术是一个技术体系，涉及多方面因素、多个环节，只有诸因素和环节面因素、多个环节，只有诸因素和环节都处理好，才能达到无菌。都处理好，才能达到无菌。u 培养基培养基u 器皿材料器皿材料u 接种工具接种工具u 操作环境操作环境u 培养室培养室u 工作台面工作台面u 具体的灭菌方法有多种具体的灭菌方法有多种u 污染检测与控制污染检测与控制第71页，此课件共116页哦玻璃器皿清洗u浸泡刷洗浸酸冲洗第72页，此课件共116页哦常用器械第73页，此课件共116页哦无菌室无菌室u无菌操作室和无菌培养室无菌操作室和无菌培养室u要求：墙壁光滑、地面平坦无缝，门窗要求：墙壁光滑、地面平坦无缝，门窗密闭，无空气对流密

20、闭，无空气对流第74页，此课件共116页哦培养室1第75页，此课件共116页哦培养室2第76页，此课件共116页哦工作台面第77页，此课件共116页哦灭菌种类u物理灭菌：高温高压灭菌、干热灭菌、物理灭菌：高温高压灭菌、干热灭菌、射线辐照灭菌、过滤灭菌射线辐照灭菌、过滤灭菌u化学灭菌：熏蒸灭菌、消毒液灭菌（酒化学灭菌：熏蒸灭菌、消毒液灭菌（酒精、升汞、漂白粉、新洁尔灭、次氯酸精、升汞、漂白粉、新洁尔灭、次氯酸钠、次氯酸钙、过氧化氢）钠、次氯酸钙、过氧化氢）u抗生素消毒：在动物细胞培养中，常采抗生素消毒：在动物细胞培养中，常采用青霉素、链霉素、卡那霉素、制霉菌用青霉素、链霉素、卡那霉素、制霉菌素等

21、抗生素抑制细菌、真菌等污染。素等抗生素抑制细菌、真菌等污染。u根据灭菌对象选择不同的灭菌方法根据灭菌对象选择不同的灭菌方法第78页，此课件共116页哦高温高压灭菌u原理：在原理：在121高温和高温和0.8kg/cm0.8kg/cm2 2-1.1kg/cm1.1kg/cm2 2的压力下，一般持续的压力下，一般持续15-2015-20分钟分钟后，就可杀死一切微生物的营养体及其后，就可杀死一切微生物的营养体及其孢子。孢子。u适用于器皿、工具、衣物和培养基适用于器皿、工具、衣物和培养基灭菌。灭菌。第79页，此课件共116页哦干热灭菌法干热灭菌法u将物品放入烘箱，利用高温使微将物品放入烘箱，利用高温使微

22、生物细胞内的蛋白质凝固而达到灭菌的生物细胞内的蛋白质凝固而达到灭菌的目的。目的。u适用于玻璃器皿。适用于玻璃器皿。第80页，此课件共116页哦烘箱第81页，此课件共116页哦射线灭菌u紫外光常用于培养室和接种箱或超紫外光常用于培养室和接种箱或超净台的灭菌。操作前开灯净台的灭菌。操作前开灯2020分钟可达到分钟可达到灭菌效果。灭菌效果。第82页，此课件共116页哦过滤灭菌u原理：将带菌的液体或气体通过孔径小原理：将带菌的液体或气体通过孔径小于于0.45uM0.45uM微孔装置，使杂菌留在滤板上微孔装置，使杂菌留在滤板上而液体或气体进入无菌空瓶中，从而达而液体或气体进入无菌空瓶中，从而达到除菌目的

23、。到除菌目的。u常用于不能以高温高压灭菌的培养液、常用于不能以高温高压灭菌的培养液、有机物质溶液和酶液的除菌。有机物质溶液和酶液的除菌。u组织培养中常用的过滤除菌器是滤膜过组织培养中常用的过滤除菌器是滤膜过滤器，它清洗方便，过滤效果好。滤器，它清洗方便，过滤效果好。第83页，此课件共116页哦过滤除菌装置第84页，此课件共116页哦熏蒸灭菌u用能杀死微生物的蒸汽进行灭菌，用能杀死微生物的蒸汽进行灭菌，适用于无菌室的定期灭菌。适用于无菌室的定期灭菌。u常用的方法是将甲醛和高锰酸钾常用的方法是将甲醛和高锰酸钾混合后，产生大量蒸气，以杀死微生物，混合后，产生大量蒸气，以杀死微生物，效果较好。效果较好

24、。第85页，此课件共116页哦消毒液灭菌u 依化学灭菌剂的不同而适用于不同依化学灭菌剂的不同而适用于不同场合的灭菌。场合的灭菌。u70%70%酒精几乎适用于组织培养中如各酒精几乎适用于组织培养中如各种器皿、培养材料、无菌室、接种箱、种器皿、培养材料、无菌室、接种箱、工作台、操作人员的手等；工作台、操作人员的手等；u升汞、漂白粉、新洁尔灭、次氯酸升汞、漂白粉、新洁尔灭、次氯酸钠、次氯酸钙、过氧化氢、抗菌素等适钠、次氯酸钙、过氧化氢、抗菌素等适用于培养材料的灭菌。用于培养材料的灭菌。第86页，此课件共116页哦室内灭菌室内灭菌u2%2%的新洁尔灭擦洗，的新洁尔灭擦洗，u70%70%乙醇喷雾，乙醇喷

25、雾，u紫外灯照射约紫外灯照射约2020分钟分钟u定期用甲醛和高锰酸钾熏蒸定期用甲醛和高锰酸钾熏蒸第87页，此课件共116页哦试剂和器皿的灭菌试剂和器皿的灭菌u包括培养基、特殊药品和所有无菌操作包括培养基、特殊药品和所有无菌操作使用的器皿的灭菌使用的器皿的灭菌u培养基通常使用灭菌锅通过高压蒸汽灭培养基通常使用灭菌锅通过高压蒸汽灭菌进行灭菌菌进行灭菌第88页，此课件共116页哦灭菌锅种类灭菌锅种类u u立式、卧式和手提式立式、卧式和手提式u操作步骤：加水操作步骤：加水 装料装料 密封密封 排气排气 升压升压 灭菌灭菌 降压降压取物品取物品 放水放水第89页，此课件共116页哦污染检测与控制污染检测

26、与控制u细菌：可采用抗生素预防u真菌：可采用抗真菌剂防治u支原体：可采用抗生素、加温处理（41）、使用支原体特异性血清u病毒：脱毒u细胞交叉污染：严格操作规程第90页，此课件共116页哦显微技术u显微观察技术：u显微操作技术：借助显微操作仪采用细微玻璃针或用微吸管、微电极、微热电偶等可进行细胞解剖、物质的抽取及注入、移植等操作。第91页，此课件共116页哦显微操作仪1第92页，此课件共116页哦显微操作仪2第93页，此课件共116页哦细胞观察与分析u细胞计数与活力分析u细胞固定与染色观察u凋亡细胞观察u染色体分析第94页，此课件共116页哦细胞计数与活力分析u采用血细胞计数法计数u活力分析：台

27、盼蓝染色法：死细胞着色 MTT：活细胞使其还原为兰色，用酶标仪测定490nm 处的光密度，计算细胞相对活力 第95页，此课件共116页哦血球计数板第96页，此课件共116页哦计数法第97页，此课件共116页哦细胞固定与染色观察u细胞固定甲醇-醋酸FAACarnoyu细胞染色苏木精-伊红（H.E)染色法Giemsa染色法Feulgen染色法考马斯蓝染色法免疫荧光法免疫过氧化物酶染色法第98页，此课件共116页哦凋亡细胞观察u形态观察:u生化分析:锚定蛋白:检测凋亡早期PI:检测晚期或死细胞u分子技术:梯形电泳图谱第99页，此课件共116页哦形态观察第100页，此课件共116页哦PS可从细胞膜的内

28、侧翻转到细胞膜的表面 第101页，此课件共116页哦FITC-AnnexinV染色第102页，此课件共116页哦FITC-AnnexinV和PI染色第103页，此课件共116页哦梯形电泳图谱第104页，此课件共116页哦染色体分析u样品处理:秋水仙素u低渗处理u固定化u染色观察第105页，此课件共116页哦细胞分离u细胞初步分离差速离心分离法u 单个细胞的获得 软琼脂培养法 和 有限稀释法 显微操作分离法 流式细胞仪分离 激光捕获显微切割 免疫磁珠分离 第106页，此课件共116页哦琼脂平板培养第107页，此课件共116页哦琼脂平板琼脂平板（培养培养淋球菌）第108页，此课件共116页哦多孔板

29、培养第109页，此课件共116页哦流式细胞仪原理第110页，此课件共116页哦第111页，此课件共116页哦激光捕获显微切割第112页，此课件共116页哦第113页，此课件共116页哦免疫磁珠分离第114页，此课件共116页哦细胞保存与复苏u目前广泛应用的细胞保存方法是低温冷冻保存法预保留细胞经消化分散后，加入冷冻保护液，同时将细胞悬液稀释按1ml/安瓿分装细胞悬液，在火焰下将安瓿封口。将封口的安瓿放入慢冻机内，按1/min的速度缓慢冷冻，使温度降至-25冻结好的安瓿放入CO2低温冰柜或液氮罐中，温度达-150-190 如果需要复苏，可将安瓿取出后立即放入37 水浴中，使其快速融化第115页，此课件共116页哦思考题u植物组织培养的基本实验室有哪些？实验室布局的基本要求是什么？u消毒灭菌种类有哪几类？u使用高压锅的基本步骤是什么？u用血球计数板进行计数时，细胞数/L=N*25/5*10*106*稀释倍数，N指什么？u对细胞进行染色体分析中，样品处理时加秋水仙素起什么作用？u简述细胞低温冷冻保存的方法第116页，此课件共116页哦