基因工程的载体和工具酶课件.ppt

《基因工程的载体和工具酶课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因工程的载体和工具酶课件.ppt（80页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、关于基因工程的载体和工具酶现在学习的是第1页，共80页引引 言言基因克隆的本质基因克隆的本质是使目的基因在特定的条件下得到是使目的基因在特定的条件下得到扩增扩增和表达和表达，而目的基因本身无法进行复制和表达、不易，而目的基因本身无法进行复制和表达、不易进入受体细胞、不能稳定维持，所以就必须借助于进入受体细胞、不能稳定维持，所以就必须借助于“载体载体”及其及其“寄主细胞寄主细胞”来实现。来实现。作为基因克隆的载体必须具备以下特性：作为基因克隆的载体必须具备以下特性：载体必须是复制子。载体必须是复制子。具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选。具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选。具备多克隆位点（具备

2、多克隆位点（MCS），便于外源基因插入。），便于外源基因插入。自身分子量较小，拷贝数高。自身分子量较小，拷贝数高。在宿主细胞内稳定性高。在宿主细胞内稳定性高。现在学习的是第2页，共80页Characteristics of vectors for gene Characteristics of vectors for gene cloningcloningMCSMarkerForeigngene现在学习的是第3页，共80页一、一、质粒载体质粒载体（plasimidvectors）（一）质粒载体的生物学特性一）质粒载体的生物学特性（二）质粒载体的制备二）质粒载体的制备（三）质粒载体的三）质粒载体

3、的改造改造现在学习的是第4页，共80页（一）质粒的生物学特性（一）质粒的生物学特性（1）质粒质粒是是独立于染色体以外的能自主复制的裸露的双链独立于染色体以外的能自主复制的裸露的双链环状环状(少数为线形和少数为线形和RNARNA）DNADNA分子。分子。广泛从在于细菌细胞中，广泛从在于细菌细胞中，比病毒更简单。在霉菌、比病毒更简单。在霉菌、蓝藻、酵母和一些动植物蓝藻、酵母和一些动植物细胞中也发现了质粒，目细胞中也发现了质粒，目前对细菌的质粒研究得比前对细菌的质粒研究得比较深入，特别是大肠杆菌较深入，特别是大肠杆菌的质粒。的质粒。大肠杆菌的质粒大肠杆菌的质粒主要有主要有F质粒（质粒（F因子）、因子

4、）、R质粒（抗药性因子）和质粒（抗药性因子）和Col质粒（大肠杆菌素因子）三种。质粒（大肠杆菌素因子）三种。现在学习的是第5页，共80页（一）质粒的生物学特性（一）质粒的生物学特性（2）质粒的大小质粒的大小差异很大差异很大，最小的只有，最小的只有1kb,1kb,只能只能编码中等大小的编码中等大小的2-32-3种蛋白质分子，最大的达到种蛋白质分子，最大的达到200kb200kb。（3）质质粒粒的的生生存存在在寄寄主主细细胞胞中中“友友好好”地地“借借居居”，离离开开了了寄寄主主它它本本身身无无法法复复制制；同同时时质质粒粒往往往往有有宿宿主主专专一一性性，如如大大肠肠杆杆菌菌的的复复制制起起点点

5、不不一一定定能能在在其它生物细胞中繁殖。其它生物细胞中繁殖。现在学习的是第6页，共80页（一）质粒的生物学特性（一）质粒的生物学特性（4）质质粒粒的的复复制制类类型型一一种种质质粒粒在在宿宿主主细细胞胞中中存存在在的的数数目目称称为为该该质质粒粒的的拷拷贝贝数数。据据拷拷贝贝数数将将质质粒粒分分为为两两种种复复制制型型：“严严紧紧型型”质质粒粒（stigent stigent plasmidplasmid）,拷拷贝贝数数为为1-31-3；“松松弛弛型型”质质粒粒（relaxed relaxed plasmidplasmid）,拷拷贝贝数数为为10-6010-60。不不过过即即使使是是同同一一质

6、质粒粒，其其拷拷贝贝数数在在不不同同的的寄寄主主细细胞胞间间和和不不同同的的生生长环境也可能有很大的变化。长环境也可能有很大的变化。（5）质粒的不亲和性质粒的不亲和性 两种亲缘关系密切的不同质粒不两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存。载体质粒与受体的质粒应是不同能在同一宿主细胞中稳定共存。载体质粒与受体的质粒应是不同的不亲和群。的不亲和群。现在学习的是第7页，共80页（一）质粒的生物学特性（一）质粒的生物学特性 质质粒粒的的转转移移 接合型质粒接合型质粒分子量大分子量大严紧型复制严紧型复制非接合型质粒非接合型质粒分子量小分子量小松弛型复制松弛型复制是否含有接是否含有接合转移基

7、因合转移基因非转移性质粒，不含非转移性质粒，不含tra基因；可以为转移基因；可以为转移性质粒所带动转移。性质粒所带动转移。转移性质粒，含有转移性质粒，含有tra基因；能通过结合作用从一基因；能通过结合作用从一个细胞转移到另一个细胞。个细胞转移到另一个细胞。在一般情况下，质粒的接合转移能力与分子大小及复制型间有一定的相在一般情况下，质粒的接合转移能力与分子大小及复制型间有一定的相关性。现归纳如下：关性。现归纳如下：现在学习的是第8页，共80页（一）质粒的生物学特性（一）质粒的生物学特性（7）质粒的存在形式质粒的存在形式有超螺旋、开环双螺旋和线有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种，状双螺旋三种，双

8、螺旋共价闭合双螺旋共价闭合环（环（SC构型）构型）开环双螺旋开环双螺旋（OC构型）构型）线状双螺旋线状双螺旋（L构型）构型）现在学习的是第9页，共80页（二）质粒DNA的制备 有多种分离质粒的方法，如碱裂解法、煮沸裂解法、层析柱过滤法等。目前一般使用碱变性法制备质粒DNA。这个方法主要包括培养收集细菌菌体，裂解细胞，将质粒DNA与染色体DNA分开及除去蛋白质和RNA。现在学习的是第10页，共80页碱变性法质粒提取的原理：碱变性法质粒提取的原理：根据共价闭合环状质粒根据共价闭合环状质粒DNADNA与线性染色体与线性染色体DNADNA片断片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来的。之间，在拓扑学上的差

9、异而发展出来的。在在pHpH值值12.012.012.512.5范围内时，线性的范围内时，线性的DNADNA会被变会被变性而共价闭合环状质粒性而共价闭合环状质粒DNADNA却却不会被变性。不会被变性。通过冷却或恢复中性通过冷却或恢复中性pHpH值使之复性，线性染色体值使之复性，线性染色体形成网状结构，而形成网状结构，而cccDNAcccDNA可以准确迅速复性，通过可以准确迅速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有离心去除线性染色体，获得含有cccDNAcccDNA的上清液，的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质粒最后用乙醇沉淀，获得质粒DNADNA。现在学习的是第11页，共80页碱变性法提取质粒的步

10、骤：碱变性法提取质粒的步骤：1 1、取、取1.51.5毫升含质粒的大肠杆菌过夜培养物，加在微量离心毫升含质粒的大肠杆菌过夜培养物，加在微量离心管中，离心收集细胞沉淀；管中，离心收集细胞沉淀；2 2、加入、加入100100微升冰冷的溶微升冰冷的溶液液I I，（，（50mM50mM葡萄糖，葡萄糖，25mM 25mM Tris-HCl PH=8.0,10mM EDTATris-HCl PH=8.0,10mM EDTA）涡旋震荡悬浮菌液。）涡旋震荡悬浮菌液。3 3、加入、加入200200微升新配制的溶液微升新配制的溶液II II，（，（0.2M NaOH0.2M NaOH，1.0%SDS1.0%SDS

11、）缓缓缓缓混匀置室温混匀置室温5 5分钟。分钟。4 4、加入、加入150150毫升冰冷的溶液毫升冰冷的溶液IIIIII，（醋酸钾，（醋酸钾29.429.4克，冰克，冰乙酸乙酸11.511.5毫升，加蒸馏水至毫升，加蒸馏水至100100毫升）颠倒离心管毫升）颠倒离心管1010次后，次后，冰浴冰浴5 5分钟。分钟。5 5、离心的上清液用苯酚抽提数次，用乙醇沉淀收集、离心的上清液用苯酚抽提数次，用乙醇沉淀收集质粒质粒DNADNA。现在学习的是第12页，共80页（三）质粒载体的改造（三）质粒载体的改造去掉不必要的去掉不必要的DNADNA区段。区段。减减少少限限制制酶酶的的识识别别位位点点，一一种种酶酶

12、只只保保留留一一个个。（单一的限制性酶切位点）。（单一的限制性酶切位点）。加入易于捡出的选择性标记基因。加入易于捡出的选择性标记基因。对对质质粒粒进进行行安安全全性性改改造造，要要求求质质粒粒不不能能随随便便 转移。转移。改造或增加基因表达的调控序列。改造或增加基因表达的调控序列。现在学习的是第13页，共80页1 1、质粒、质粒pBR322 pBR3224363结构：结构：（1 1）氨苄青霉素抗性基因（）氨苄青霉素抗性基因（ampampr r或或ApApr r）3 3种限制酶单一识别位点种限制酶单一识别位点。（2 2）四环素抗性基因（）四环素抗性基因（tetr或或Tcr）内部有内部有7 7种，

13、启动区内有种，启动区内有2 2种限制酶种限制酶单一识别位点单一识别位点。（3）DNA复制起点（复制起点（ori）现在学习的是第14页，共80页pBR322质粒的优点：质粒的优点：（1 1）具有较小的分子量。）具有较小的分子量。4363bp4363bp，2.62.610106 6DaDa，（2 2）具有两种抗菌素抗性基因）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。可供作转化子的选择记号。（3 3）具较高的拷贝数，而且经）具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后过氯霉素扩增之后,每个细胞中每个细胞中可累积可累积1000100030003000个拷贝。个拷贝。（4 4）对多种常见的限制性内）对多种

14、常见的限制性内切核酸酶只含有一个能切割切核酸酶只含有一个能切割的位点。的位点。pBR3224363现在学习的是第15页，共80页外源外源DNApBR3224363PstI酶切酶切PstI酶切酶切黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端连接酶连接酶重组子重组子(ampstetr)空载体空载体(amprtetr)插入子插入子(ampstets)野生型的野生型的E.coli(ampstets)导导入入涂布在含涂布在含Tc的平板上的平板上重组子转化子重组子转化子(ampstetr)空载体空载体转化子转化子(amprtetr)影印在含影印在含Ap的平板上的平板上空载体转化子空载体转化子(amprtetr)因插入

15、外源因插入外源DNA而导致基因失活的现象称之为插入失活效应而导致基因失活的现象称之为插入失活效应对比两个平板上的菌落，凡在对比两个平板上的菌落，凡在Tc平板上生长而在平板上生长而在Ap平板上不能生长的菌落则是重组质粒转平板上不能生长的菌落则是重组质粒转化子克隆，挑选阳性克隆，分离出重组质粒。化子克隆，挑选阳性克隆，分离出重组质粒。现在学习的是第16页，共80页现在学习的是第17页，共80页2、pUC质粒载体质粒载体1987年，年，J.Messing和和J.Vieria采用采用MCS技术在技术在pBR322基础上构建的基础上构建的结构：结构：（1）来自于）来自于pBR322的的Ori（2）氨苄青

16、霉素的抗性基因）氨苄青霉素的抗性基因(ampr)。但核苷酸序列发生了变化但核苷酸序列发生了变化（3）LacZ基因基因编码编码半乳糖酶的半乳糖酶的肽链即氨基末端。肽链即氨基末端。（4）MCS区段区段是一段用于插入外源是一段用于插入外源DNA片段的特定区域，由一系列的紧密相连的限制片段的特定区域，由一系列的紧密相连的限制性内切酶位点组成，而且每个限制性内切酶位点在整个载体中是唯一的。性内切酶位点组成，而且每个限制性内切酶位点在整个载体中是唯一的。现在学习的是第18页，共80页2、pUC质粒载体质粒载体与与pBR322相比，相比，pUC质粒载体优点：质粒载体优点：（1）具有更小的分子量和更高的拷贝数

17、）具有更小的分子量和更高的拷贝数如如pUC8为为2750bp，pUCl8为为2686bp，控制质粒复制控制质粒复制rop基因基因的缺失，平均每个细胞即可达的缺失，平均每个细胞即可达500700个拷贝个拷贝（2）适用于组织化学法检测重组体）适用于组织化学法检测重组体通过通过-互补互补作用，利用菌落颜色筛选重组子作用，利用菌落颜色筛选重组子。（3）具有多克隆位点区段（）具有多克隆位点区段（MCS）可以定向克隆防止载体自我连接。可以定向克隆防止载体自我连接。现在学习的是第19页，共80页-互补互补(alpha-complementation)大大肠肠杆杆菌菌-半半乳乳糖糖苷苷酶酶可可以以和和其其底底

18、物物X-Gal相相互互作作用用并并且且释释放放出出一一种种蓝蓝色色物物质质，当当该该酶酶的的-片片段段和和-片片段段分分开开时时就就失失去去了了这这种种显显色色的的功功能能。通通常常将将编编码码该该酶酶-片片段段的的LacZ基基因因插插入入到到载载体体的的多多克克隆隆位位点点的的侧侧翼翼序序列列中中，而而在在一一些些人人工工构构建建的的大大肠肠杆杆菌菌株株系系中中却却只只能能编编码码产产生生该该酶酶的的 片片段段。这这样样一一来来，含含有有功功能能性性完完整整的的LacZ 基基因因的的载载体体导导入入到到这这类类寄寄主主细细胞胞中中时时，载载体体编编码码的的-片片段段就就能能和和寄寄主主编编码

19、码的的 片片段段发发生生互互补补并并具具有有了了对对底底物物X-gal的的作作用用功功能能（发发生生显显色色反反应应），这种现象被成为是这种现象被成为是alpha-complementation.X-Gal：5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-半乳糖苷半乳糖苷 现在学习的是第20页，共80页释释放放出出的的蓝蓝色色物物质质可可以以将将整整个个菌菌落落染染成成蓝蓝色色，非非常常容容易易辨辨别别，如如果果LacZ插插入入外外源源基基因因被被破破坏坏，菌菌落落则则是无色的是无色的。组织化学法检测重组体组织化学法检测重组体X-Gal-半乳糖苷酶半乳糖苷酶IPTG诱导物诱导物异丙基异丙基-D-硫代半乳

20、糖苷硫代半乳糖苷 半乳糖半乳糖5-溴溴-4-氯氯-靛蓝靛蓝现在学习的是第21页，共80页二、二、噬菌体载体噬菌体载体（phagevectors）（一）一）噬菌体载体噬菌体载体（二）二）M13噬菌体载体噬菌体载体（三）柯斯质粒载体（三）柯斯质粒载体现在学习的是第22页，共80页1.噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性溶菌周期溶菌周期指噬菌体将指噬菌体将DNADNA注入寄主细胞后很快环化，然后进注入寄主细胞后很快环化，然后进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装，最后行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装，最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌

21、体。溶源周期溶源周期中，注入寄主细胞的噬菌体中，注入寄主细胞的噬菌体DNADNA是整合到寄主细胞染是整合到寄主细胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。整合了一套完整的噬菌体基因组的细菌被称为整合了一套完整的噬菌体基因组的细菌被称为溶源性细菌溶源性细菌。在溶源性细菌内存在的整合或非整合的噬菌体在溶源性细菌内存在的整合或非整合的噬菌体DNADNA被称为被称为原噬原噬菌体菌体。噬菌体噬菌体温和噬菌体，具有溶源生长周期和溶菌生长周期温和噬菌体，具有溶源生长周期和溶菌生长周期烈性噬菌体烈性噬菌体,只具有溶菌生长周期只具有溶菌生长周期现在学习的是第23页，

22、共80页1.噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性现在学习的是第24页，共80页2.噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性现在学习的是第25页，共80页2.噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性组成：组成：蛋白质外壳和蛋白质外壳和线状双链线状双链DNADNA分子组成。分子组成。DNA长长度度为为48502bp48502bp，在在分分子子两两端端各各有有1212个个碱碱基基的的单单链链互互补补粘粘性性末末端端。当当其其注注入入到到寄寄主主细细胞胞中中后后，可可以以迅迅速速通通过过这这两两个个粘粘性性末末端端的的互互补补作作用用形形成成双双链链的的环环形形DNADNA分分子子。上上述述通通过过粘粘性性末

23、末端端互互补补形形成成的的双双链链区区被被称称为为coscos位位点点（cohesive cohesive end siteend site）.GGGCGGCGACCT现在学习的是第26页，共80页2.噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性是一个温和噬菌体是一个温和噬菌体一般以溶源生长进行增殖，胁迫条件下也会进入溶菌生长周期。一般以溶源生长进行增殖，胁迫条件下也会进入溶菌生长周期。复制复制溶源周期随溶源细菌染色体一起复制溶源周期随溶源细菌染色体一起复制溶菌周期的早期是溶菌周期的早期是“”复制，晚期进行滚环复制复制，晚期进行滚环复制基因组成基因组成 DNADNA至少包括至少包括6161个基因，大多

24、基因按功能相似性成簇排列，其中一部分为噬个基因，大多基因按功能相似性成簇排列，其中一部分为噬菌体生命活动的必须基因，另一部分约菌体生命活动的必须基因，另一部分约1 13 3为非必须区段。为非必须区段。现在学习的是第27页，共80页噬菌体载噬菌体载体类型体类型置换型置换型（Replacementvectors）这种载体具有两个对应的酶切克隆位点，在两这种载体具有两个对应的酶切克隆位点，在两个位点之间的个位点之间的DNA区段是区段是噬菌体的非必需噬菌体的非必需序列，可以被外源插入的序列，可以被外源插入的DNA取代。取代。如如Charon4 载体克隆能力大，克隆能力大，2025kb插入型插入型（In

25、sertionvectors）这种载体仅仅有一个可供外源这种载体仅仅有一个可供外源DNA插入插入的克隆位点。的克隆位点。如：如：gt10、gt11克隆能力小，不到克隆能力小，不到10kb 噬菌体载体的噬菌体载体的类型类型现在学习的是第28页，共80页Insertionvectors现在学习的是第29页，共80页Replacementvectors置换型载体现在学习的是第30页，共80页（二）（二）M13噬菌体噬菌体 1 1、丝状噬菌体、丝状噬菌体M13噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性是单链闭合环状噬菌体是单链闭合环状噬菌体只只能能感感染染雄雄性性细细菌菌，外外形形成成丝丝状状，基基因因组组

26、DNA长长约约6.4kb，含含9个个编编码码10种种蛋蛋白白质质的的重重叠叠基基因因，基基因因-可可分分为为10个个区区和和基基因因、之之间间有有507bp基基因因间间隔隔区区（IS区区），该该区区可可以以接接受受外外源源DNADNA的的插插入入而而不不会会影影响响到到噬噬菌菌体体的的活活力力。这这是是该该噬噬菌菌体体能用于单链能用于单链DNADNA载体的重要前提。载体的重要前提。复制与增殖（图）复制与增殖（图）现在学习的是第31页，共80页M13噬菌体的复制与增殖噬菌体的复制与增殖“”DNACPCP脱落，脱落，“”DNA复制复制RFDNA“”型复制型复制积累积累200300份份滚环复制滚环复

27、制SSB外溢时被包装外溢时被包装M13噬菌体噬菌体基因基因现在学习的是第32页，共80页2.M13噬菌体载体的构建噬菌体载体的构建这类载体的这类载体的突出优点突出优点在于其既可在于其既可以提供单链以提供单链DNADNA，也可以提供双链，也可以提供双链的的DNADNA。其。其最大的不足在于最大的不足在于插入大插入大的的DNADNA片段片段后表现不稳定，在噬后表现不稳定，在噬菌体增殖过程中容易发生缺失。菌体增殖过程中容易发生缺失。所以所以一般克隆的片段在一般克隆的片段在1kb1kb之内之内，克隆克隆300-400bp300-400bp的片段十分稳定。的片段十分稳定。在在ISIS区内插入区内插入La

28、cLacZ Z基因基因 在标记基因区内组装在标记基因区内组装MCSMCS区段区段所以能通过所以能通过 互补在互补在X-Gal/IPTGX-Gal/IPTG平板上平板上识别重组体。这类载体包括了识别重组体。这类载体包括了 M13mp8M13mp8、9 9 和和 M13mp18 M13mp18、1919等。等。现在学习的是第33页，共80页（三）柯斯质粒载体（三）柯斯质粒载体（cosmidvectors）柯斯质粒载体的特点柯斯质粒载体的特点 柯斯质粒是一类人工构建的含有柯斯质粒是一类人工构建的含有 DNA的的cos序列和序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体，质粒复制子的特殊类型的质粒载体，cosm

29、id是是cossitecarryingplasmid的缩写。的缩写。柯斯质粒的大小为柯斯质粒的大小为4-6kb，由由3部分组成：部分组成：A.多克隆位点区多克隆位点区B.含有含有cos位点的位点的 DNA区区C.复制起始位点和抗性标记区复制起始位点和抗性标记区pHC79OriMarkerMCScos DNA现在学习的是第34页，共80页（三）（三）柯斯质粒载体（柯斯质粒载体（cosmidvectors）柯斯质粒载体的特性柯斯质粒载体的特性1 1、具有、具有 噬菌体的特性噬菌体的特性 柯斯质粒连接上适宜长度的外源柯斯质粒连接上适宜长度的外源DNADNA后可以在体外包装成噬菌体颗粒，并能高效转导寄

30、主细胞。进后可以在体外包装成噬菌体颗粒，并能高效转导寄主细胞。进入寄主细胞的入寄主细胞的DNADNA也能环化和复制，但是不会形成新的噬菌体颗粒，也能环化和复制，但是不会形成新的噬菌体颗粒，也不能发生溶菌现象。也不能发生溶菌现象。2 2、具有质粒载体的特性、具有质粒载体的特性 能象质粒一样在寄主细胞内复制，且能象质粒一样在寄主细胞内复制，且带有抗性选择标记基因，有些还带有插入失活型的多克隆位点，为带有抗性选择标记基因，有些还带有插入失活型的多克隆位点，为重组体的筛选提供了方便。重组体的筛选提供了方便。3 3、高容量的克隆能力、高容量的克隆能力 coscos质粒本身很小，只有复制起点、质粒本身很小

31、，只有复制起点、选择标记和选择标记和coscos位点等构成，所以其克隆上限可达位点等构成，所以其克隆上限可达45kb45kb左右。不左右。不过由于包装的限制，其克隆片段至少要达到过由于包装的限制，其克隆片段至少要达到30kb30kb。现在学习的是第35页，共80页（三）（三）柯斯质粒载体（柯斯质粒载体（cosmidvectors）柯斯质粒载体的应用柯斯质粒载体的应用 噬菌体的位点特异切割体系噬菌体的位点特异切割体系末端酶（末端酶（terminase）体系，识别两个相距）体系，识别两个相距38-54kbcos位位点，并进行切割，后被包装。点，并进行切割，后被包装。下面的操作中缺点是：下面的操作中

32、缺点是：cosmid自我重组、外源自我重组、外源DNA片段串联片段串联后重组。后重组。OriMarkerMCScos DNA现在学习的是第36页，共80页质粒质粒噬菌体噬菌体柯斯质粒柯斯质粒单链噬菌体单链噬菌体克隆克隆DNA大片段大片段*+-构建基因组文库构建基因组文库-+-构建构建DNA文库文库+-常规的亚克隆化常规的亚克隆化+-构建新型的构建新型的DNA结构结构+-序列分析序列分析+-+单链探针单链探针+*-+外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在大肠杆菌中的表达+-四种常用载体的比较*外源外源DNADNA如超过如超过10kb10kb，则重组质粒的转化率和，则重组质粒的转化率和DNADNA得

33、率都非常低得率都非常低*已有个别材料可用于此目的已有个别材料可用于此目的现在学习的是第37页，共80页第二节第二节 基因操作的工具酶基因操作的工具酶一、一、限制性核酸内切酶及其应用限制性核酸内切酶及其应用二、二、DNA连接酶及其应用连接酶及其应用三、三、DNA聚合酶及其应用聚合酶及其应用四、四、修饰性工具酶修饰性工具酶现在学习的是第38页，共80页（一）限制性核酸内切酶的发现一）限制性核酸内切酶的发现（二）限制性核酸内切酶的分类二）限制性核酸内切酶的分类（三）限制性核酸内切酶的命名三）限制性核酸内切酶的命名（四）四）II型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性（五）限制性核酸内

34、切酶的消化反应五）限制性核酸内切酶的消化反应一、一、限制性核酸内切酶及其应用限制性核酸内切酶及其应用现在学习的是第39页，共80页由寄主控制的由寄主控制的限制限制和和修饰修饰现象现象-20世纪世纪60年代，年代，Linn和和Arber发现发现(B)(K)大肠杆菌大肠杆菌B大肠杆菌大肠杆菌K114104104E.O.P成斑率成斑率efficiencyofplating外源外源DNA自身自身DNA（一）核酸限制性核酸内切酶的发现（一）核酸限制性核酸内切酶的发现：切酶切酶。现在学习的是第40页，共80页 E.E.colicoliB B含有含有EcoBEcoB核酸酶和核酸酶和EcoBEcoB甲基化酶甲

35、基化酶 当当(k)(k)噬菌体侵染噬菌体侵染E.E.colicoliB B时，由于其时，由于其DNADNA中有中有EcoBEcoB核酸酶特异识别的碱基序列，核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而被降解掉。而E.E.colicoliB B的的DNADNA中虽然也存在这中虽然也存在这种特异序列，但可在种特异序列，但可在EcoBEcoB甲基化酶的作用下，甲基化酶的作用下，催化催化S-S-腺苷甲硫氨酸（腺苷甲硫氨酸（SAMSAM）将甲基转移给）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。EcoBEcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。核酸酶不能识别已甲基化的序

36、列。现在学习的是第41页，共80页限制限制修饰的酶学系统修饰的酶学系统(B)(B)酶切位点酶切位点不被修饰不被修饰噬菌体噬菌体DNA被切割被切割酶切位点酶切位点被修饰被修饰基因组基因组DNA不被切割不被切割现在学习的是第42页，共80页最早分离出的限制内切酶最早分离出的限制内切酶1968年，年，Meselson和和Yuan，大肠杆菌大肠杆菌B和和K菌株，菌株，EcoB和和EcoK，是是I型的，没有实用价值。型的，没有实用价值。首个首个II型限制内切酶型限制内切酶1970年，年，H.O.Smith等从等从Heamophilus influenzae的的Rd菌株中菌株中HindII。使得使得DNA

37、DNA分子的体外精确切割成为可能。分子的体外精确切割成为可能。从此，相关研究展开。如从此，相关研究展开。如NEB公司的提取和克隆。目公司的提取和克隆。目前前已纯化出已纯化出3000种限制性内切酶中种限制性内切酶中，其中有其中有30%是是在在NEB发现的发现的。限制性核酸内切酶（限制性核酸内切酶（restriction endonucleaserestriction endonuclease ）：是一类能够识别双链）：是一类能够识别双链DNADNA分子中的某种特定核苷酸分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割序列，并由此切割DNADNA双链结构的核酸内切酶。切开的双链结构的核酸内切酶。切开的是是3

38、 3，5 5磷酸二酯键。磷酸二酯键。现在学习的是第43页，共80页（二）限制性核酸内切酶的类型及其主要特性（二）限制性核酸内切酶的类型及其主要特性特性特性1.限制修饰活性限制修饰活性2.内切酶的蛋白内切酶的蛋白质结构质结构3.限制辅助因子限制辅助因子4.切割位点切割位点5.特异性切割特异性切割6.基因克隆中基因克隆中I型型双功能的酶双功能的酶3种不同亚基种不同亚基ATP、Mg2+和和S-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸距特异性位点距特异性位点5端至少端至少1000bp不是（随机）不是（随机）无用无用II型型限制酶和修饰酶分开限制酶和修饰酶分开单一成分单一成分Mg2+位于识别位点上位于识别位点上是是非常

39、有用非常有用III型型双功能酶双功能酶2种亚基种亚基ATP、Mg2+和和S-腺腺苷甲硫氨酸苷甲硫氨酸特异性位点特异性位点3端端24-26bp处处是是用处不大用处不大现在学习的是第44页，共80页（三）限制性核酸内切酶的命名（三）限制性核酸内切酶的命名1、寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个斜体个斜体字母的略语表示酶来源的菌种名称，如大肠杆菌字母的略语表示酶来源的菌种名称，如大肠杆菌Escherichia coli表示为表示为Eco,流感嗜血菌流感嗜血菌Haemophilus influenzae表示为表示为Hin；2、用一个正体字母表示菌

40、株的类型，比如用一个正体字母表示菌株的类型，比如EcoR、Hind；3、如果一种特殊的寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系，则如果一种特殊的寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系，则用罗马数字标出，比如用罗马数字标出，比如EcoRI、HindIII。现在学习的是第45页，共80页（四）（四）IIII型限制性核酸内切酶的基本特点型限制性核酸内切酶的基本特点1、识别位点的特异性、识别位点的特异性每种酶都有其特定的每种酶都有其特定的DNA识别识别位点，通常是由位点，通常是由48个核苷酸组成的特定序列（靶序列）。个核苷酸组成的特定序列（靶序列）。2、识别序列的对称性、识别序列的对称性靶序列通常具有双重旋转对

41、称靶序列通常具有双重旋转对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。3、切割位点的规范性、切割位点的规范性交错切或对称切（可形成粘性末端或平末端的交错切或对称切（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。分子）。现在学习的是第46页，共80页几种几种IIII型限制性核酸内切酶的酶切位点型限制性核酸内切酶的酶切位点PstIProvindencia stuartii 164 CTGCAGGACGTCHaemophilus influenzae Rd 现在学习的是第47页，共80页与与II型核酸内切酶有关的几个概念型核酸内切酶有关的几个概念粘性末端粘性末端 cohes

42、iveends是指是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。重新环化起来。平平 末末 端端 Blunt endBlunt end在识别序列对称处同时切开在识别序列对称处同时切开DNADNA分子两条链，产生分子两条链，产生的平齐末端结构。则不易于重新环化。的平齐末端结构。则不易于重新环化。同裂酶同裂酶 isoschizomersisoschizomers 能识别和切割同样的核苷酸靶序列的不同来源能识别和切割同样的核苷酸靶序列的不同来源的

43、内切酶。不同同裂酶对位点的甲基化敏感性有差别。的内切酶。不同同裂酶对位点的甲基化敏感性有差别。同尾酶同尾酶 isocaudamersisocaudamers 识别的靶序列不同，但能产生相同粘性末端的一类识别的靶序列不同，但能产生相同粘性末端的一类限制性核酸内切酶。如限制性核酸内切酶。如BamHI、BclI、BglII和和XhoI 是一组同尾酶。是一组同尾酶。注注 意：意：由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接，但是两种同由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接，但是两种同尾酶消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段将不能被该两种酶的任尾酶消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段将不能被该两种酶的

44、任一种所识别。一种所识别。现在学习的是第48页，共80页平齐末端带带5P端的黏性末端端的黏性末端带带3OH和和5P端的平末端端的平末端例如例如Hpa和和Msp是同裂酶，识别顺序都是是同裂酶，识别顺序都是5C|CGG33GGC|C5如果其中有如果其中有5-甲基胞嘧啶，甲基胞嘧啶，Hpa不能够切割，不能够切割，MspI能切割。能切割。现在学习的是第49页，共80页 经同尾酶消化的经同尾酶消化的DNADNA末端连接示意图末端连接示意图5XXXXGGATCCXXXXXX33XXXXCCTAGGXXXXXX5BamH I5XXXXGGATCCXXXXXX33XXXXCCTAGGXXXXXX55XXXXA

45、GATCTXXXXXX33XXXXTCTAGAXXXXXX5Bgl II5XXXXAGATCTXXXXXX33XXXXTCTAGAXXXXXX55XXXXAGATCCXXXXXX33XXXXTCTAGGXXXXXX55XXXXAGATCCXXXXXX33XXXXTCTAGGXXXXXX5BamH IBgl II现在学习的是第50页，共80页一个限制酶单位一个限制酶单位（U）指：指：在理想的反应条件（适宜的在理想的反应条件（适宜的缓冲液和反应温度，通常为缓冲液和反应温度，通常为37）下，）下，1h内内中完全降解中完全降解1 g DNA所需要的酶量。所需要的酶量。影响酶活性的因素很多，最重要的有：

46、影响酶活性的因素很多，最重要的有：DNA的纯度的纯度DNA的甲基化程度的甲基化程度酶切反应的温度（通常为酶切反应的温度（通常为37）DNADNA的分子结构的分子结构 核酸内切限制酶的缓冲液核酸内切限制酶的缓冲液 在在“非最适的非最适的”反应条件下反应条件下,有些核酸内切限制酶识别序列的特异性有些核酸内切限制酶识别序列的特异性便会发生便会发生“松动松动”，从其，从其“正确正确”识别序列以外的其它位点切割识别序列以外的其它位点切割DNADNA分子，这种现象分子，这种现象叫星号活性叫星号活性。用。用*表示。表示。（五）限制性核酸内切酶的消化反应（五）限制性核酸内切酶的消化反应现在学习的是第51页，共

47、80页酶酶切切反反应应的的基基本本步步骤骤电泳紫外分析37 1h加反应液CKMBuffer(10X)2.0 LddH2O 约约16.5 LDNA 0.21.0 gEnzyme 12UVolume 20.0 L 1.0kb1.0kb0.4kb0.5kb0.6kbCKMTT现在学习的是第52页，共80页（一）一）DNA连接酶的发现连接酶的发现（二）二）DNA连接酶作用特点连接酶作用特点（三）三）DNA连接酶的反应条件连接酶的反应条件（四）四）DNA连接的策略连接的策略二、二、DNA连接酶及其应用连接酶及其应用现在学习的是第53页，共80页（一）（一）DNA连接酶的发现连接酶的发现环形环形DNADN

48、A分子的发现使科学家相信一定有一种能连接这种分子的发现使科学家相信一定有一种能连接这种 切口的酶存在。切口的酶存在。首个首个DNADNA连接酶连接酶(ligase)(ligase)19671967年，年，大肠杆菌大肠杆菌DNA连接酶连接酶，是大肠杆菌基因编码是大肠杆菌基因编码。1970年，发现了年，发现了T4DNA连接酶连接酶，由大肠杆菌由大肠杆菌T4噬菌体基因编噬菌体基因编码的。码的。现在学习的是第54页，共80页（二）（二）DNA连接酶作用的特点连接酶作用的特点A.A.连接的连接的两条链两条链必须分别具有自由必须分别具有自由33OHOH和和55P P，而且这两个基团彼此，而且这两个基团彼此

49、相邻相邻；B.B.在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程。在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程。E.coliDNA连接酶连接酶连接具互补碱基黏性末端连接具互补碱基黏性末端(最初研究表明），现在最初研究表明），现在研究可连接平末端；需研究可连接平末端；需NAD+辅助因子，活性低，不常用。辅助因子，活性低，不常用。T4DNA连接酶连接酶连接具互补碱基黏性末端和平末端，连接具互补碱基黏性末端和平末端，需需ATP辅助因子，活性高，常用。辅助因子，活性高，常用。现在学习的是第55页，共80页 是两条链是两条链因此不能将两条单链连接起来或使单链环化起因此不能将两条单链连接起来或使单链环化

50、起来。来。OHP是相邻的是相邻的因此不能封闭因此不能封闭gap，只能封闭，只能封闭nick.gapNONickOK现在学习的是第56页，共80页DNA连接酶连接的作用机制连接酶连接的作用机制 E(E(酶酶)ATPEATPEAMPAMPppippi E(E(酶酶)NADENADEAMPAMPNMNNMN E EAMPAMP DNADNADNADNAAMPAMPE EDNADNA上上的的33OHOH对对被被活活化化的的磷磷原原子子进进行行亲亲核核攻攻击击，形形成成磷磷酸酸二酯键，同时释放出二酯键，同时释放出AMPAMP。现在学习的是第57页，共80页（三）（三）T4DNA连接酶连接反应的条件连接酶