分子生物学第五章基因表达调控真核生物讲稿.ppt

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1、分子生物学课件第五章基因表达调控真核生物1第一页，讲稿共五十页哦 多多细细胞胞真真核核生生物物，遗遗传传信信息息从从细细胞胞核核的的基基因因组组DNA传传递递到到基基因因编编码码的的蛋蛋白白质质均均受受到到多层次的调控。多层次的调控。第二节第二节 真核生物基因表达的调控真核生物基因表达的调控 第二页，讲稿共五十页哦一、真核生物基因表达的特点一、真核生物基因表达的特点 1.1.细胞具有全能性细胞具有全能性 全能性：全能性：指同一种生物的指同一种生物的所有细胞都含有相同的基因组所有细胞都含有相同的基因组DNADNA，都有发育成完，都有发育成完整个体的潜能。整个体的潜能。2.2.基基因因表表达达的的

2、时时间间性性和和空空间间性性 时时间间性性：个个体体发发育育的的不不同同阶阶段段，基基因因表表达达的的种种类类和和数数量量是是不不同同的的；空空间间性性：在在不不同同组组织织和和器器官官中中，基基因因表表达达的种类和数量是不同的。的种类和数量是不同的。第三页，讲稿共五十页哦3.3.转转录录和和翻翻译译分分开开进进行行 真真核核生生物物DNADNA在在核核中中转转录录生生成成 mRNAmRNA，穿穿过过核核膜膜至至胞胞质质指指导导蛋蛋白白质质合合成成；转转录录和和翻翻译译不不是是同同步步进进行行的的，受受多多层层次次调调控。控。4.4.初级转录产物要经过转录后加工修饰初级转录产物要经过转录后加工

3、修饰 初级转录产物为核不均一初级转录产物为核不均一RNA RNA （heterogeneous nuclear RNA,hnRNAheterogeneous nuclear RNA,hnRNA）第四页，讲稿共五十页哦5.5.不不存存在在超超基基因因式式操操纵纵子子结结构构 真真核核生生物物基基因因转转录产物为单顺反子。录产物为单顺反子。6.6.部部分分基基因因多多拷拷贝贝 某某些些基基因因以以多多拷拷贝贝形形式式存存在在，如如组组蛋蛋白白和和 tRNAtRNA等等，这这样样既既可可满满足足细细胞胞的的需需要要，也是表达调控的一种有效方式。也是表达调控的一种有效方式。第五页，讲稿共五十页哦单顺反

4、子(monocistron)编码编码一个一个多肽链的多肽链的DNADNA的序列区域，的序列区域，相当于真核细胞的一个基因。相当于真核细胞的一个基因。第六页，讲稿共五十页哦translationtranscriptionmRNADNAProteinPromoterGene35单顺反子单顺反子mRNA (monocistronicmRNA)第七页，讲稿共五十页哦（一）基因组（一）基因组DNA水平的调控水平的调控1.染色质的丢失染色质的丢失不可逆的调控。不可逆的调控。线虫线虫胚胎期：胚胎期：1090个细胞个细胞成成虫：虫：959个细胞个细胞131个细胞在发育过程中发生凋亡个细胞在发育过程中发生凋亡二

5、、二、真核生物基因表达的调控机制真核生物基因表达的调控机制第八页，讲稿共五十页哦2.基因扩增（基因扩增（geneamplification）当当细细胞胞对对某某种种基基因因产产物物需需要要量量剧剧增增，单单纯纯靠靠调调节节其其表表达达活活性性不不足足满满足足需需要要，只只有有增增加加这种基因的拷贝数。这种基因的拷贝数。不不适适当当的的基基因因扩扩增增可可导导致致某某些些疾疾病病的的发发生。生。第九页，讲稿共五十页哦3.基因重排（gene rearrangement）VJCVJCVJC免疫球蛋白免疫球蛋白IgGIgG基因许多片段发生重排，为免疫球蛋白分子基因许多片段发生重排，为免疫球蛋白分子的多

6、样性奠定了基础的多样性奠定了基础指某些基因片段改变原来存在顺序而重新排列组合，指某些基因片段改变原来存在顺序而重新排列组合，成为一个完整的转录单位。调节表达产物多样性。成为一个完整的转录单位。调节表达产物多样性。第十页，讲稿共五十页哦BCR-ABL融合基因形成示意图融合基因形成示意图(140kDa)(160kDa)第十一页，讲稿共五十页哦4.4.基因的甲基化修饰基因的甲基化修饰 DNA上上特特定定的的CpG序序列列处处的的胞胞嘧嘧啶啶发发生生甲甲基基化化修修饰饰（5mC）。甲甲基基化化程程度度与与基基因因的的表表达达一一般般呈呈反反比比关关系系。甲甲基基化化程程度度愈愈高高，基基因因的的表表达

7、达则则降降低低。去去甲甲基基化化，基基因的表达增加。因的表达增加。GCGCGCGCGene第十二页，讲稿共五十页哦 DNA DNA 甲基化甲基化研究研究分析分析方法方法原理：原理：甲基化通过影响染色质的结构而调控基因的转甲基化通过影响染色质的结构而调控基因的转录。通过研究启动子部位的甲基化状态来研究基因转录录。通过研究启动子部位的甲基化状态来研究基因转录活性。活性。方法：方法：选用识别序列相同但酶切位点不同的对甲基化敏感选用识别序列相同但酶切位点不同的对甲基化敏感性内切酶对待测序列进行酶切。性内切酶对待测序列进行酶切。应用：应用：分析抑瘤基因表达下调的机制；分析抑瘤基因表达下调的机制；分析组织

8、分析组织/发育阶段特异性基因的表达机制。发育阶段特异性基因的表达机制。第十三页，讲稿共五十页哦 5.染色质结构对基因表达的调控作用 组组蛋蛋白白与与DNA结结合合与与解解离离是是真真核核基基因因表表达达调调控控的的重重要要机制之一。机制之一。非组蛋白主要作为反式作用因子调节基因表达。非组蛋白主要作为反式作用因子调节基因表达。常常染染色色质质中中疏疏松松状状态态的的活活性性染染色色质质是是基基因因转转录录前前在在染色质水平上独特的调控机制。染色质水平上独特的调控机制。第十四页，讲稿共五十页哦1.转录转录起始复合物的形成起始复合物的形成2.顺顺式作用元件式作用元件(cis-actingelemen

9、t)3.反式作用因子反式作用因子(trans-actingfactor)4.转录转录水平的水平的调调控机制控机制（二）真核生物基因转录调控（二）真核生物基因转录调控以以RNA聚合酶聚合酶为例为例第十五页，讲稿共五十页哦1.1.转录起始复合物的形成转录起始复合物的形成 转录起始前复合物转录起始前复合物(pre-initiationcomplex,PIC)和和转录起始复合物转录起始复合物(transcriptioninitiationcomplex,TIC)的形的形成。成。真核生物真核生物RNApol不与不与DNA直接结合，而需直接结合，而需要依靠众多的转录因子。要依靠众多的转录因子。第十六页，讲

10、稿共五十页哦2.顺式作用元件顺式作用元件(cis-actingelement)指某些能影响基因表达但不编码新的蛋指某些能影响基因表达但不编码新的蛋白质和白质和RNA的的DNA序列序列，按照功能分为启动，按照功能分为启动子、增强子、负调控元件（沉默子等）。子、增强子、负调控元件（沉默子等）。第十七页，讲稿共五十页哦（1）启动子）启动子(promoter)在基因转录起始位点在基因转录起始位点(+1)及其及其5上游近端上游近端大约大约100200bp以内的一组具有独立功能的以内的一组具有独立功能的DNA序列。每个元件长度约为序列。每个元件长度约为720bp，是决，是决定定RNA聚合酶聚合酶转录起始点

11、和转录频率的关键元转录起始点和转录频率的关键元件。件。第十八页，讲稿共五十页哦 真核类基因的顺式作用元件图 核核心心启启动动子子(corepromoter)包包括括“转转录录起起始始位位点点”及及其其上上游游-25-30bp处处富富含含TA的的典典型型元元件件“TATA”盒盒。核核心心序序列列为为TATAAAA，功能：确定转录起始位点并产生基础水平的转录。，功能：确定转录起始位点并产生基础水平的转录。上上游游启启动动子子元元件件(upstreampromoterelement,UPE)包包括括通通常常位位于于-70bp附附近近的的CAAT盒盒(CCAAT)和和GC盒盒(GGGCGG），功功能能

12、：调节转录起始的频率，提高转录效率。调节转录起始的频率，提高转录效率。第十九页，讲稿共五十页哦（2）增强子增强子(enhancer)位位于于启启动动子子上上游游或或下下游游并并通通过过启启动动子子增增强强邻邻近近基基因因转转录录效效率率的的DNA顺顺序序，增强子本身不具备启动子活性。增强子本身不具备启动子活性。第二十页，讲稿共五十页哦(3)其他元件其他元件包括负调控元件和终止子等。包括负调控元件和终止子等。负调控元件负调控元件:沉默子（沉默子（silencer）或衰减子或衰减子（dehancer）真核基因内能抑制基因转录的真核基因内能抑制基因转录的DNA序列，序列，与反式作用因子相互结合而起作

13、用。不受距离与反式作用因子相互结合而起作用。不受距离和方向的限制，并可对异源基因的表达起作用。和方向的限制，并可对异源基因的表达起作用。第二十一页，讲稿共五十页哦终止子终止子在模板在模板DNA分子的分子的5端转录终止信号。通端转录终止信号。通常具有常具有po1yA尾的基因终止信号为尾的基因终止信号为GT簇，例簇，例如在如在SV40中的中的AGGTTTTTT序列为终止转录序列为终止转录调控元件。调控元件。第二十二页，讲稿共五十页哦3.3.反式作用因子反式作用因子(trans-acting factor)能直接或间接地识别或结合在各顺式作能直接或间接地识别或结合在各顺式作用元件用元件812bp核心

14、序列上，参与调控靶基核心序列上，参与调控靶基因转录效率的因转录效率的一组蛋白质一组蛋白质。在结构上含有与在结构上含有与DNA结合的结构域。结合的结构域。第二十三页，讲稿共五十页哦（1）反式作用因子根据作用方式分为三类：）反式作用因子根据作用方式分为三类：通通用用转转录录因因子子。普普遍遍存存在在的的转转录录因因子子。如如TATAbox结合因子结合因子TFD、GCbox结合因子结合因子SP1等。等。组组织织特特异异性性转转录录因因子子。与与基基因因表表达达的的组组织织特特异异性性有有很大关系。很大关系。诱诱导导性性反反式式作作用用因因子子。活活性性能能被被特特异异的的诱诱导导因因子子所所诱诱导。

15、导。第二十四页，讲稿共五十页哦（2 2）转录因子）转录因子(transcription factor，TF)RNA合合成成起起始始所所必必需需的的因因子子。TF不不依依赖赖RNA聚聚合合酶酶而而独独立立地地结结合合DNA，在在转转录录过过程程中中促促使使许多许多RNA聚合酶分子与启动子结合。聚合酶分子与启动子结合。第二十五页，讲稿共五十页哦(2)转录因子结构转录因子结构DNA结合域转录活化域TF结合其它蛋白质结构域（如，二聚化结构域）第二十六页，讲稿共五十页哦TFA结构域示意图结构域示意图TFA肽链的指结构肽链的指结构域含有域含有9个指，与相应个指，与相应的的DNA序列结合，指序列结合，指“尖

16、尖”可以进入可以进入DNA双螺双螺旋的大沟或小沟。但旋的大沟或小沟。但羧基端不具有指结构，羧基端不具有指结构，是是RNA聚合酶聚合酶和其和其它的转录因子相互作用它的转录因子相互作用的部位。的部位。第二十七页，讲稿共五十页哦 TATA因因子子与与TATA盒盒结结合合，形形成成稳稳定定的的转转录录复复合合物物，介介导导RNA聚合酶聚合酶分子转录。分子转录。真核基因开放的转录起始复合物的形成图真核基因开放的转录起始复合物的形成图RNA聚聚合合酶酶识识别别并并结结合合以以上上蛋蛋白白质质-DNA复复合合物物。形形成成闭闭合合复复合合物物，DNA双双链链没没有有打打开开，不不能启动转录。能启动转录。转转

17、录录起起始始因因子子与与RNA聚聚合合酶酶结结合合，使使DNA部部分分双双螺螺旋旋解解开开成成为为开开放放的的转转录录起起始始复复合合物物，转转录录开开始合成始合成RNA。第二十八页，讲稿共五十页哦DNADNA识别结合域：识别结合域：锌指（锌指（zincfinger）结构）结构ACys2His2锌指结构；B折叠的Cys2His2锌指结构；CCys2Cys2锌指结构第二十九页，讲稿共五十页哦同源结构域（同源结构域（homeodomain，HD）同源盒基因家族各基因间同源盒基因家族各基因间具有一相同的保守序列。所含具有一相同的保守序列。所含的至少二个的至少二个螺旋中形成螺旋中形成“转转折折”，第三

18、个，第三个螺旋与螺旋与DNA大大沟相互作用，是同源盒蛋白与沟相互作用，是同源盒蛋白与DNA结合的主要力量结合的主要力量。第三十页，讲稿共五十页哦碱性碱性-亮氨酸拉链亮氨酸拉链亮氨酸之间相互作用形亮氨酸之间相互作用形成二聚体，形成成二聚体，形成“拉链拉链”。肽链氨基端肽链氨基端20203030个富个富含碱性氨基酸结构域与含碱性氨基酸结构域与DNADNA结合。结合。DNA结合部位结构域结合部位结构域疏水性疏水性亲水性亲水性亲水性亲水性第三十一页，讲稿共五十页哦螺旋螺旋-环环-螺旋（螺旋（helix-loop-helix，HLH）含两个双性含两个双性-螺旋，每螺旋，每34个氨基酸含一个疏水个氨基酸含

19、一个疏水性残基，中间为非螺旋环区，内含一个或多个能阻断螺旋性残基，中间为非螺旋环区，内含一个或多个能阻断螺旋的氨基酸残基。的氨基酸残基。第三十二页，讲稿共五十页哦酸性酸性-螺旋（螺旋（acidic-helixdomain）能非特异性地与能非特异性地与起始复合物（如起始复合物（如TATA盒结合因子）相互作用发挥转录活化盒结合因子）相互作用发挥转录活化功能。功能。富含谷氨酰胺的结构域（富含谷氨酰胺的结构域（glutamine-richdomain）最强的转录活化域之一。最强的转录活化域之一。富含脯氨酸结构域（富含脯氨酸结构域（proline-richdomain）2)转录活化结构域转录活化结构域（

20、transcriptionalactivationdomain）第三十三页，讲稿共五十页哦3.3.转录水平的调控机制转录水平的调控机制()反式作用因子的活性调节反式作用因子的活性调节真真核核基基因因转转录录起起始始的的调调节节，首首先先表表现现为为反反式式作作用用因因子子的的功功能能调调节节，即即特特定定的的反反式式作作用因子被激活后，可以启动特定基因的转录。用因子被激活后，可以启动特定基因的转录。第三十四页，讲稿共五十页哦反式作用因子的激活方式反式作用因子的激活方式:表达式调节表达式调节共价修饰共价修饰A.磷酸化去磷酸化。磷酸化去磷酸化。B.糖基化。糖基化。配体结合配体结合：(核受体超家族核

21、受体超家族)蛋白质与蛋白质相互作用蛋白质与蛋白质相互作用第三十五页，讲稿共五十页哦（2）反式作用因子作用方式）反式作用因子作用方式1）成环（）成环（looping）2）扭曲）扭曲(twisting)3）滑动）滑动(sliding)4）Oozing反式作用因子与顺式元件结合如何影响到远距离反式作用因子与顺式元件结合如何影响到远距离RNA聚合酶结合并影响其调控基因？聚合酶结合并影响其调控基因？第三十六页，讲稿共五十页哦（3）反式作用因子的组合式调控基因表达的调控不是由单一的反式作用因子完成而是几种因子组合，发挥特定的作用。第三十七页，讲稿共五十页哦（1 1）报道基因分析法原理：将调控序列克隆到含有

22、报道基因的表达质粒中原理：将调控序列克隆到含有报道基因的表达质粒中,再转染细胞再转染细胞,通过报道基因的活性可检测转录活性。通过报道基因的活性可检测转录活性。应用：启动子活性的检测应用：启动子活性的检测常用的报道基因：常用的报道基因：Luciferase Luciferase（荧光素酶）、（荧光素酶）、GFPGFP（绿色荧光蛋白）（绿色荧光蛋白）、SEAPSEAP（分泌性碱性磷酸酶）（分泌性碱性磷酸酶）4.4.转录水平研究方法转录水平研究方法第三十八页，讲稿共五十页哦（2 2）DNaseDNase超敏感分析法超敏感分析法原理：转录活跃区域对核酸酶作用敏感度增加，经原理：转录活跃区域对核酸酶作用

23、敏感度增加，经DNaseDNase消化消化常出现长短不均一的常出现长短不均一的100100200 bp 200 bp 的的DNADNA片段，说明此片段，说明此 DNA DNA 受受组蛋白掩盖的结构有变化，出现了对组蛋白掩盖的结构有变化，出现了对DNaseDNase高敏感点高敏感点(hypersensitive site)(hypersensitive site)。方法：用方法：用 DNaseDNase处理细胞核处理细胞核DNADNA，再用合适的内切酶进行消化，再用合适的内切酶进行消化，电泳分离，转膜，用靶基因的探针进行电泳分离，转膜，用靶基因的探针进行southern southern 杂交，

24、根据片杂交，根据片段大小推测基因调控区的位置。段大小推测基因调控区的位置。应用：确定基因启动子内调控区的位置。应用：确定基因启动子内调控区的位置。第三十九页，讲稿共五十页哦（3 3）足纹法（）足纹法（foot printing)foot printing)原理：蛋白质结合到DNA序列上，可阻止核酸酶对其的降解。方法：DNA序列与靶蛋白进行孵育，再用DNase进行切割，电泳，分析图谱。应用：确定DNA结合蛋白的识别序列。第四十页，讲稿共五十页哦（4 4）凝胶迁移率凝胶迁移率（gelshiftassay)或或电泳迁移率实验电泳迁移率实验（EMSA）原理：蛋白质与特定的DNA序列结合后，迁移率会发生

25、改变，DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。方法：纯化的蛋白或细胞粗提液和同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，聚丙烯凝胶电泳，放射自显影。应用：研究DNA结合蛋白；RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。第四十一页，讲稿共五十页哦(三三)转录后水平的调控转录后水平的调控1.5端加帽和端加帽和3端多聚腺苷酸化及意义端多聚腺苷酸化及意义5端端加加帽帽:真真核核生生物物转转录录生生成成的的mRNA在在转转录录后后，在在5端加上端加上7甲基鸟苷甲基鸟苷(m7GPPPmNp-)。意意义义:保保护护转转录录体体mRNA不不受受5外外切切酶酶降降解解，增增强强mRNA稳稳定定性性，有

26、有利利于于mRNA从从细细胞胞核核向向胞胞质质转转运运，促促进进mRNA与与核核糖糖体体结结合合（通通过过帽帽结结合合蛋蛋白白介介导导完完成）。成）。第四十二页，讲稿共五十页哦3端端加加尾尾:转转录录后后在在mRNA在在3末末端端加加上上50150个腺苷酸，即个腺苷酸，即poly(A)尾尾。意义意义:保证保证mRNA在转录过程中不被降解。在转录过程中不被降解。第四十三页，讲稿共五十页哦2.mRNA前体的选择性剪接前体的选择性剪接(alternativesplicing)对基因表达的调控作用对基因表达的调控作用（1）mRNA前体的剪接前体的剪接真核细胞基因表达真核细胞基因表达所转录出的所转录出的

27、mRNA前体在剪接酶作用下，有序前体在剪接酶作用下，有序删除每一个内含子并将外显子拼接起来，形成删除每一个内含子并将外显子拼接起来，形成成熟的成熟的mRNA，这一过程即为剪接。，这一过程即为剪接。第四十四页，讲稿共五十页哦高等真核细胞中，某个内含子高等真核细胞中，某个内含子5的供点在特的供点在特定条件下可与另一个内含子定条件下可与另一个内含子3受点进行剪接，同受点进行剪接，同时删除这两个内含子及其中间的全部外显子或内含时删除这两个内含子及其中间的全部外显子或内含子，即一个外显子或内含子是否出现在成熟的子，即一个外显子或内含子是否出现在成熟的mRNA中是可以选择的。中是可以选择的。（2 2）mR

28、NAmRNA的选择性剪接的选择性剪接第四十五页，讲稿共五十页哦 外显子选择：保留或部分保留外显子内含子选择：删除或部分删除内含子第四十六页，讲稿共五十页哦互斥外显子：两个外显子不能同时存 在于同一成熟mRNA中内部剪接位点：内含子部分切除或外 显子部分保留第四十七页，讲稿共五十页哦意义意义:在高等生物细胞的高度异质性中在高等生物细胞的高度异质性中起重要作用。由于剪接的多样化，一个基因起重要作用。由于剪接的多样化，一个基因在转录后通过在转录后通过mRNA前体的剪接加工而产生前体的剪接加工而产生两个或更多的蛋白质。两个或更多的蛋白质。mRNAmRNA的选择性剪接的选择性剪接第四十八页，讲稿共五十页

29、哦CBACy5-标记标记cDNACy3-标记标记cDNACBACBACBACBACBACBA样品样品1样品样品2Cy5/Cy3荧光标记荧光标记RNA提取提取竞争性杂交显示竞争性杂交显示基因表达量差异基因表达量差异二种样品竞争性杂交示意图二种样品竞争性杂交示意图基因表达谱芯片的原理基因表达谱芯片的原理第四十九页，讲稿共五十页哦（四）翻译水平的调控（四）翻译水平的调控1.1.翻译起始的调控翻译起始的调控(1)翻译起始因子调节蛋白质合成速度翻译起始因子调节蛋白质合成速度(2)阻遏蛋白的控制阻遏蛋白的控制(3)5AUG调节翻译的效率调节翻译的效率(4)5端非编码区长度影响翻译起端非编码区长度影响翻译起始效始效率及准确性率及准确性第五十页，讲稿共五十页哦