分解纤维素的微生物的分离讲稿.ppt
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1、关于分解纤维素的微生物的分离第一页,讲稿共三十五页哦 纤维素纤维素,一种由,一种由葡萄糖葡萄糖首尾相连而首尾相连而成的成的高分子高分子化合物,是地球上含量最丰化合物,是地球上含量最丰富的富的多糖多糖类物质。类物质。植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。其植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。其中中棉花棉花是自然界中纤维素是自然界中纤维素含量最高含量最高的天然产物。的天然产物。植物每年产生的植物每年产生的纤维素纤维素超过超过7070亿吨,其中亿吨,其中40%-60%40%-60%能被土能被土壤中壤中某些微生物分解利用某些微生物分解利用,这是因为它们能够产生,这是因为它们能够产生纤维素酶纤
2、维素酶。对这些微生物的研究与应用,使人类能够对这些微生物的研究与应用,使人类能够利用秸秆等利用秸秆等废弃物生产酒精,用纤维素酶处理服装面料废弃物生产酒精,用纤维素酶处理服装面料等。等。如何分离土壤中分解纤维素的微生物呢?其消化道内,其消化道内,共生共生有有分解纤维素的微生物分解纤维素的微生物,能产生能产生纤维素酶纤维素酶而分解纤而分解纤维素。维素。人没有分解纤维素的能力 植食性动物是怎样消化食物中纤维素的?第二页,讲稿共三十五页哦纤维素与纤维素酶1.1.纤维素纤维素:多糖多糖(高分子化合物高分子化合物)基本单位基本单位:葡萄糖葡萄糖一、基础知识 土壤中某些土壤中某些微生物微生物能够产生能够产生
3、纤维素酶纤维素酶,把把纤维素分解为纤维素分解为葡萄糖葡萄糖,然后再利用。,然后再利用。许多许多商品纤维素商品纤维素都是由都是由天然纤维素天然纤维素制得的,如制得的,如水溶性的水溶性的羟甲基纤维素钠羟甲基纤维素钠(CMC-Na)、不溶于水)、不溶于水的微晶纤维素(的微晶纤维素(AvicelAvicel)等。)等。第三页,讲稿共三十五页哦 纤维素酶纤维素酶是一种是一种复合酶,一般认为它,一般认为它至少包括至少包括三种组分三种组分,即,即C C1 1酶酶(外切酶外切酶)、C CX X酶酶(内切酶内切酶)和葡萄糖和葡萄糖苷酶苷酶,前两种酶使,前两种酶使纤维素纤维素分解成分解成纤维二糖纤维二糖,第三种,
4、第三种酶将酶将纤维二糖纤维二糖分解成分解成葡萄糖葡萄糖。纤维二糖C1酶、Cx酶葡萄糖苷酶葡萄糖纤维素 2.2.纤维素酶纤维素酶(1)1)组成:组成:(2)2)作用:作用:一种复合酶:C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶第四页,讲稿共三十五页哦取二支取二支20mL20mL的试管。的试管。实验:纤维素酶分解纤维素的实验各加入一张各加入一张1cm6cm1cm6cm的的滤纸条。滤纸条。各加入各加入pH4.8pH4.8,物质的量浓度为,物质的量浓度为0.1mol/L0.1mol/L的的醋酸醋酸钠缓冲液醋酸醋酸钠缓冲液11ml11ml和和10ml10ml。甲 乙在在乙试管乙试管中加入中加入1mL1mL纤维素酶。纤维
5、素酶。两支试管固定在锥形瓶中,放在两支试管固定在锥形瓶中,放在140r/min140r/min的的摇床摇床上振荡上振荡1h1h。结果:结果:乙试管乙试管的的滤纸条消失。滤纸条消失。讨论:讨论:自变量?自变量?因变量?因变量?无关变量?乙无关变量?乙试管的滤纸条为什么会消失?试管的滤纸条为什么会消失?甲甲试管的作用是什么?试管的作用是什么?自变量:自变量:纤维素酶的有无纤维素酶的有无自变量的控制自变量的控制:乙试管乙试管-1mL1mL纤维素酶溶液纤维素酶溶液 甲试管甲试管-等量的缓冲液等量的缓冲液(不能加蒸馏水,会影响溶液的不能加蒸馏水,会影响溶液的pH)pH)。第五页,讲稿共三十五页哦刚果红染
6、色法(二)纤维素分解菌的筛选2、原理:1、方法:即:可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。刚果红刚果红能与能与纤维素纤维素形成形成红色复合物红色复合物,而与,而与水解后的水解后的纤维二糖纤维二糖和和葡萄糖葡萄糖不发生不发生这种反这种反应。应。红色复合物红色消失,出现透明圈纤维素纤维素刚果红刚果红(染料)(染料)纤维素分解菌纤维素分解菌纤维素酶纤维素酶四种四种纤维素分解菌在刚果红纤维素分解菌在刚果红培养基上形成的培养基上形成的透明圈透明圈(选择培养基中通过颜色反应直接对微生物进行筛选)第六页,讲稿共三十五页哦不同菌落的不同菌落的透明圈大小透明圈大小不同,不同,可以说明微生物可以说明微生物产生纤
7、维产生纤维素酶能力的大小素酶能力的大小。不同菌落的不同菌落的透明圈大小透明圈大小不同可以不同可以说明什么问题?说明什么问题?(二)纤维素分解菌的筛选四种纤维素分解菌在刚果红培四种纤维素分解菌在刚果红培养基上形成的透明圈养基上形成的透明圈透明圈的应用:筛选具有某种特定功能(如分泌某种酶)的微生物(目的菌).第七页,讲稿共三十五页哦 在在长出菌落长出菌落的的培养基培养基上,覆盖质上,覆盖质量浓度为量浓度为1mg/mL1mg/mL的的刚果红刚果红(简称(简称CRCR)溶液,)溶液,101015min15min后,倒去后,倒去CRCR溶溶液液,加入物质的量浓度为,加入物质的量浓度为1mol/L1mol
8、/L的的NaClNaCl溶液溶液,15min15min后倒掉后倒掉NaClNaCl溶液,溶液,此时,产生此时,产生纤维素酶的菌落纤维素酶的菌落周围将出周围将出现现透明圈透明圈。先先培养微生物培养微生物,再再加入加入刚果红刚果红进行颜色反应。进行颜色反应。方法方法1 1:3、操作:NaCl溶液作用:漂洗作用漂洗作用洗去洗去与纤维素结合不牢的与纤维素结合不牢的刚果红刚果红,以免出现的透明圈不够清晰。以免出现的透明圈不够清晰。第八页,讲稿共三十五页哦先先培养微生物培养微生物,再再加入加入刚果红刚果红进行颜色反应。进行颜色反应。方法方法1 1:3、操作:在在倒平板倒平板时就加入时就加入刚果红刚果红。方
9、法方法2 2:配制质量浓度为配制质量浓度为10mg/mL10mg/mL的的刚果刚果红红(CRCR)溶液,)溶液,灭菌灭菌后,按照每后,按照每200200mLmL培养基加入培养基加入1m1mL L的比例加入的比例加入CRCR溶液溶液,混匀后,混匀后倒平板倒平板。等培养。等培养基上基上长出菌落长出菌落后,产生后,产生纤维素酶纤维素酶的菌落的菌落周围将会出现明显的周围将会出现明显的透明透明圈。圈。NaCl溶液作用:漂洗作用漂洗作用洗去洗去与纤维素结合不牢的与纤维素结合不牢的刚果刚果红红,以免出现的透明圈不够清晰。以免出现的透明圈不够清晰。第九页,讲稿共三十五页哦在在倒平板倒平板时就加入时就加入刚果红
10、刚果红。先先培养微生物培养微生物,再再加入加入刚果红刚果红进行颜色反应。进行颜色反应。方法方法1 1:方法方法2 2:3、操作:染色法染色法优点优点缺点缺点方法1(后置染色法)方法2(前置染色法)颜色反应基本上颜色反应基本上是纤维素分解菌是纤维素分解菌的作用的作用操作繁琐。操作繁琐。刚果红会使菌落之间发生混杂。刚果红会使菌落之间发生混杂。操作简便,操作简便,不存在菌落混不存在菌落混杂问题杂问题1.1.产生淀粉酶的微生物也产生产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈。模糊透明圈。2.2.有些微生物能降解色素,形有些微生物能降解色素,形成明显的透明圈。成明显的透明圈。这两种方法各有哪些优点与不足?NaC
11、l溶液作用:漂洗作用漂洗作用洗去洗去与纤维素结合不牢的与纤维素结合不牢的刚果红刚果红,以免出现的透明圈不够清晰。以免出现的透明圈不够清晰。第十页,讲稿共三十五页哦二、实 验 设 计土壤取样土壤取样选择培养选择培养梯度稀释梯度稀释 将样品涂布在将样品涂布在鉴别鉴别纤纤 维素分解菌的维素分解菌的培养基培养基上上 挑选挑选产生透明圈产生透明圈的菌落(的菌落(筛选)第十一页,讲稿共三十五页哦(1)(1)分布环境分布环境:1 1、土壤取样:、土壤取样:富含纤维素富含纤维素的环境中的环境中生物与环境的互相依存关系生物与环境的互相依存关系,在富含纤维在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提素的环境中纤维
12、素分解菌的含量相对提高,高,因此从这种土壤中获得目的微生物的几因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境。率要高于普通环境。(2)(2)原因原因:二、实 验 设 计取样的取样的环境环境是怎样的,作出这种选择的是怎样的,作出这种选择的理由理由是什么?是什么?纤维素分解菌大多分布在纤维素分解菌大多分布在富含纤维素富含纤维素的环境中。因此,的环境中。因此,选择纤维素丰富的环境,如树林中多年落叶形成的腐殖土,选择纤维素丰富的环境,如树林中多年落叶形成的腐殖土,多年积累的枯枝败叶等等。多年积累的枯枝败叶等等。第十二页,讲稿共三十五页哦如果找不到合适的环境,可以将如果找不到合适的环境,可以将滤纸滤
13、纸埋在土壤埋在土壤中,将滤纸埋在土壤中有中,将滤纸埋在土壤中有什么作用什么作用?你认为?你认为滤纸应该埋在土壤中滤纸应该埋在土壤中多深多深?将将滤纸滤纸埋在土壤中,能使纤维素分解菌相埋在土壤中,能使纤维素分解菌相对集中,实际上是对集中,实际上是人工设置纤维素分解菌生存人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境的适宜环境。一般应将滤纸埋于深约。一般应将滤纸埋于深约10cm10cm左左右右的土壤中。的土壤中。1 1、土壤取样:、土壤取样:2 2、选择培养、选择培养增加纤维素分解菌的浓度增加纤维素分解菌的浓度,以确保能够,以确保能够从样品中分离所需要的微生物。从样品中分离所需要的微生物。(1)(1)目的:目
14、的:思考:用什么方法选择?思考:用什么方法选择?第十三页,讲稿共三十五页哦纤维素分解菌的纤维素分解菌的选择选择培养基培养基组分含量/g提供的主要营养纤维素粉5NaNO31Na2HPO4.7H2O1.2KH2PO40.9MgSO4.7H2O0.5KCl0.5酵母膏0.5水解酪素0.5将上述物质溶解后,用蒸馏水定容到1 000 mL碳源、能源无机盐生长因子、氮源氮源、生长因子 A A、旁栏中的配方是、旁栏中的配方是液体液体培养基培养基还是还是固体培养基固体培养基?为什么?为什么?是是液体培养基液体培养基,原因是配,原因是配方中方中无凝固剂无凝固剂(琼脂)(琼脂)B B、这个培养基对微生物、这个培养
15、基对微生物是否具有是否具有选择作用选择作用?如果具?如果具有,是如何进行选择的?有,是如何进行选择的?有选择有选择作用,以作用,以纤维素粉纤维素粉作作为为主要碳源主要碳源,只有只有能分解纤能分解纤维素的微生物可以大量繁殖。维素的微生物可以大量繁殖。C C、你能否设计一个、你能否设计一个对对照实验照实验,说明选择培养,说明选择培养基的作用。基的作用。自变量自变量为为培养基的种培养基的种类类(即普通培养基和选(即普通培养基和选择培养基)。可用择培养基)。可用牛肉牛肉膏蛋白胨培养基膏蛋白胨培养基与之对与之对照;或者将照;或者将纤维素粉纤维素粉改改为为葡萄糖葡萄糖。(2)制备制备选择培养基选择培养基:
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