第六章基因的转移与重组体的筛选和鉴定.ppt

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1、第六章基因的转移与重第六章基因的转移与重第六章基因的转移与重第六章基因的转移与重组体的筛选和鉴定组体的筛选和鉴定组体的筛选和鉴定组体的筛选和鉴定现在学习的是第1页，共24页一、粘性末端的连接一、粘性末端的连接DNA连连接接酶酶把把相相互互靠靠近近的的5端端磷磷酸酸与与3-OH连到一起连到一起单酶切、双酶切单酶切、双酶切第一节第一节 DNA的体外重组的体外重组DNA的的体体外外重重组组：将将目目的的基基因因与与载载体体连连接接，这这种种重重新新组组合合的的DNA称为重组称为重组DNA。现在学习的是第2页，共24页（一）（一）直接连接直接连接T4 DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性

2、连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的末端的110%。5 5 5 5 3 3 3 3-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5 3-OH-PP-HO-5 3 二、平末端（二、平末端（blunt end）的连接）的连接现在学习的是第3页，共24页（1）同聚加尾法）同聚加尾法 （二）（二）人工加尾形成人工加尾形成“粘性末端粘性末端”DNA末端转移酶末端转移酶能在没有模板的情况下给能在没有模板的情况下给DNA的的3-OH端端加上脱氧核苷酸。加上脱氧核苷酸。原理：原理：分别给载体和插入片断加上分别给载体和插入片断加上互补的互补的核苷酸。核苷酸。加尾碱基互补加尾碱基互补现在学习的是第4页，共

3、24页缺点：缺点：优点：优点：能把任何片能把任何片段连接起来段连接起来操作繁琐；操作繁琐；外源片段难以回收外源片段难以回收；同聚物尾巴影响外源基同聚物尾巴影响外源基因表达。因表达。非酶切位点现在学习的是第5页，共24页（2）衔接物（）衔接物（linker）连接）连接Linker：用化学合成法合成的一段用化学合成法合成的一段10-12bp的，具有一个或数个限制的，具有一个或数个限制性内切酶识别位点的性内切酶识别位点的平末端双链寡核苷酸平末端双链寡核苷酸GGAATTCC CCTTAAGGEcoR I linker：（二）（二）人工加尾形成人工加尾形成“粘性末端粘性末端”现在学习的是第6页，共24页

4、（1）多核苷酸激酶处理）多核苷酸激酶处理（2）T4连接酶连接连接酶连接（3）限制性内切酶消化）限制性内切酶消化（4）目的片段与载体连接）目的片段与载体连接现在学习的是第7页，共24页（二）（二）人工加尾形成人工加尾形成“粘性末端粘性末端”（3）DNA接头接头（adapter）连接法）连接法 adapter一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）Blunt-ended DNA5p-GATCCCGG-OH3 3HO-GGCC-p5 BamHI adapterP-P5p-GATCCCGG-GGCC-CCGG-GGCCCTAG-P5 现在学习的是第8

5、页，共24页接头与接头以粘末端连接，影响与接头与接头以粘末端连接，影响与DNA片段的连接片段的连接 优点：优点：连上后就能用。连上后就能用。缺点：缺点：先先用用小小牛牛肠肠碱碱性性磷磷酸酸酶酶（CIP）处处理理接接头头，水水解解掉掉其其5端端的磷酸，防止自我连接。的磷酸，防止自我连接。防止自我连接防止自我连接5p-GATCCCGG-GGCC-CCGG GGCCCTAG-p5 现在学习的是第9页，共24页Blunt-ended DNA5p-GATCCCGG-3 GGCC-p5 BamHI adapterP-P 5HO-GATCCCGG-GGCC CCGG-GGCCCTAG-OH5 5HO-GAT

6、CCCGG3 GGCC-OH5 nick缺口缺口nick缺口缺口HO-OHCIP处理处理T4 ligase虽然有缺口，但仍然能与虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接片断连接T4多核苷酸激酶处理使多核苷酸激酶处理使5磷酸化磷酸化现在学习的是第10页，共24页三、三、PCR产物的连接产物的连接1.1.在引物的在引物的55端设计酶切位点端设计酶切位点符合载体的多克隆位点；符合载体的多克隆位点；（1 1）设计原则）设计原则（2 2）带酶切位点的引物的结构）带酶切位点的引物的结构33端端151520bp20bp与模板互补；与模板互补；55端内切酶识别序列端内切酶识别序列保护碱基保护碱基避免与所扩增的避免

7、与所扩增的DNADNA片断内部酶切位点重复。片断内部酶切位点重复。现在学习的是第11页，共24页带酶切位点的带酶切位点的PCR产物产物GCAGAATTC PCR产物产物5-3 CCTAGGCGC PCR产物产物-5 3-CGTCTTAAGGGATCCGCGEcoR I位点位点BamH I位点位点AATTC PCR产物产物5-3 CCTAG PCR产物产物-5 3-GGEcoR IBamH I两头各有一个粘性末端！两头各有一个粘性末端！现在学习的是第12页，共24页AAdNTPTTdTTPTaq DNA聚合酶聚合酶载体载体PCR产物产物TATA三、三、PCR产物的连接产物的连接2.2.与与T T

8、载体直接连接载体直接连接现在学习的是第13页，共24页第二节第二节 重组体导入受体细胞重组体导入受体细胞一、重组一、重组DNA导入大肠杆菌导入大肠杆菌（一）转化（一）转化（transformation）大肠杆菌捕获大肠杆菌捕获质粒质粒DNA的过程。的过程。（三）转染（三）转染（transfection）受体菌直接捕获受体菌直接捕获噬菌体噬菌体DNA的过程。的过程。（二）转导（二）转导（transduction）借助借助噬菌体噬菌体把外源把外源DNA导入细菌的过程。导入细菌的过程。现在学习的是第14页，共24页二、重组二、重组DNA导入真核细胞导入真核细胞（一）导入酵母细胞（一）导入酵母细胞1.

9、1.原生质体转化原生质体转化2.2.碱金属离子介导的完整细胞转化碱金属离子介导的完整细胞转化3.3.PEG1000PEG1000转化法转化法4.4.电击法电击法（二）导入植物细胞（二）导入植物细胞（三）导入动物细胞（三）导入动物细胞现在学习的是第15页，共24页1.利用原生质体进行转化利用原生质体进行转化 酵母酵母原生质体原生质体感受态感受态酶去壁酶去壁CaCl2 PEG插入外源基因的载体插入外源基因的载体共转化：共转化：将两个以上的基因同时导入感受态细胞的方法将两个以上的基因同时导入感受态细胞的方法转化转化转化细胞达原生质体总数的转化细胞达原生质体总数的1%2%，转化率受再生率影响，转化率受

10、再生率影响共转化的原生质体占转化子总数的共转化的原生质体占转化子总数的25%33%现在学习的是第16页，共24页 酵母酵母0.1mol/L LiCl处理处理感受态感受态2.碱金属离子介导的完整细胞转化碱金属离子介导的完整细胞转化插入外源基因的载体插入外源基因的载体40%PEG 4000热激热激涂布选择性平板，筛选转化子涂布选择性平板，筛选转化子 吸收线性吸收线性DNA能力明显大于环状能力明显大于环状DNA，两者相差，两者相差80倍倍转化率：转化率：103个个/g DNA；共转化现象极少共转化现象极少现在学习的是第17页，共24页4.4.电击转化电击转化电击转化电击转化（1）适于原生质体和完整细

11、胞）适于原生质体和完整细胞（2）转化率高，）转化率高，105个个/g DNA（3）单链转化率高于双链）单链转化率高于双链单链含有酵母复制子可转化为双链并复制，无复制子可单链含有酵母复制子可转化为双链并复制，无复制子可同源整合到受体菌染色体上同源整合到受体菌染色体上缺点：需要特定仪器，成本较高缺点：需要特定仪器，成本较高3.PEG1000转化转化转化转化PEG处理酵母细胞，可获得类感受态，用于转化处理酵母细胞，可获得类感受态，用于转化现在学习的是第18页，共24页二、重组二、重组DNA导入真核细胞导入真核细胞（一）导入酵母细胞（一）导入酵母细胞1.1.载体介导的转化（农杆菌介导）载体介导的转化（

12、农杆菌介导）2.2.DNADNA直接导入（基因抢法、电击法等）直接导入（基因抢法、电击法等）3.3.种质系统法（花粉管通道法等）种质系统法（花粉管通道法等）（二）导入植物细胞（二）导入植物细胞（三）导入动物细胞（三）导入动物细胞现在学习的是第19页，共24页（二）导入植物细胞（二）导入植物细胞1.农杆菌介导的农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法质粒遗传转化方法将目的基因插入到载体的T-DNA区，形成重组DNA将重组DNA转入含有Vir致病基因的农杆菌通过农杆菌侵染植物外植体将含有外源目的基因的T-DNA整合到植物细胞基因组中，获得转基因植株现在学习的是第20页，共24页在饲养平皿的滤在饲养平皿的滤

13、纸上培养纸上培养2天天叶叶盘盘法法的的具具体体操操作作 现在学习的是第21页，共24页又称生物弹击法、微弹又称生物弹击法、微弹轰击法，借助高速金属微粒将轰击法，借助高速金属微粒将DNA分子引入活细胞的转化技术。分子引入活细胞的转化技术。DNA1.2 m钨弹头钨弹头 吸附吸附金属微粒加速，进入受体细胞金属微粒加速，进入受体细胞基因枪基因枪装入装入2.基因枪法（基因枪法（基因枪法（基因枪法（gene gun）外植体制备外植体制备轰击轰击外植体培养及选择外植体培养及选择现在学习的是第22页，共24页现在学习的是第23页，共24页具具体体操操作作 1.DNA微弹的制备微弹的制备2.外植体的制备外植体的制备3.DNA微弹轰击微弹轰击4.外植体的培养外植体的培养现在学习的是第24页，共24页