基因工程工具酶 (3)课件.ppt

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1、关于基因工程工具酶(3)现在学习的是第1页，共63页基因工程的操作，是在分子水平上的操作，基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，如限制性核酸内切酶，连接酶，DN聚合酶等聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为和扩增等操作。所以把这些酶称之为“工具酶工具酶”。工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。改造、优化、而产生的生物工程产品。基因工程工具酶基因工程工具酶现在学习的是第2页，共63页自然界的许多微

2、生物体内存在着一些具有特异功自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸能的酶类。这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微复制和修复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微生物区别自己和非己的生物区别自己和非己的DNA进而降解非己进而降解非己DNA的的防御工具。在研究掌握了利用这些酶类对基因防御工具。在研究掌握了利用这些酶类对基因切割、拼接操作方法后，人类获得了最好的基切割、拼接操作方法后，人类获得了最好的基因工程工具。因工程工具。基因工程工具酶基因工程工具酶现在学习的是第3页，共63页基因工程工具酶及其应用基因

3、工程工具酶及其应用l限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶主要用于DNA分子的特异切割lDNADNA连接酶连接酶用于DNA和RNA的连接lDNADNA聚聚合酶合酶用于DNA和RNA的合成l核酸末端修饰酶核酸末端修饰酶用于DNA和RNA的末端修饰l核酸酶核酸酶用于DNA和RNA的非特异性切割lDNA甲基化酶甲基化酶用于DNA分子的甲基化 l其它酶类其它酶类-用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。现在学习的是第4页，共63页限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restrictionenzyme)限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restrictionenzyme)l限制性内切酶的发现l限制性内切酶的

4、分类l限制性内切酶的命名l限制性内切酶的活性单位l限制性内切酶的切割特点l限制性内切酶的反应条件l限制性内切酶的应用现在学习的是第5页，共63页一一.限制性内切酶的概念限制性内切酶的概念l核酸酶可分为两类：l核酸外切酶（exonuclease）是从核酸的一端开始，一个接一个把核苷酸水解下来；l核酸内切酶(endonuclease)则从核酸链中间水解3，5磷酸二酯键，将核酸链切断。现在学习的是第6页，共63页限制性核酸内切酶的发现限制性核酸内切酶的发现细菌的限制细菌的限制修饰作用修饰作用1952年，Luria和Human，1953年，Bertani和Weigle发现细菌的限制（restricti

5、on）现象：Phage（k）E.colikE.coliB【E.coliB限制限制（k）】感染不感染现在学习的是第7页，共63页噬菌体侵染细菌现在学习的是第8页，共63页噬菌体侵染细菌噬菌体侵染细菌仍有少量phage(K)可在E.coliB中生存，是因为E.coliBphage对(K)进行了修饰。大肠杆菌B大肠杆菌K修饰的phage(B)修饰的phage(K)10-4（限制作用）10-4（限制作用）1（修饰作用）现在学习的是第9页，共63页R-M系统系统细菌中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，构成了寄细菌中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，构成了寄主控制的限制主控制的限制修饰系统修饰系统

6、(R-MRestriction-modificationsystem)。R-M系统是细菌安内御外的积极措施。细菌系统是细菌安内御外的积极措施。细菌R-M系统的限制酶可系统的限制酶可以降解以降解DNA，为避免自身，为避免自身DNA的降解，细菌可以修饰（甲基化酶）的降解，细菌可以修饰（甲基化酶）自身自身DNA，未被修饰的外来，未被修饰的外来DNA则会被降解。则会被降解。个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰，则可免予被降解。个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰，则可免予被降解。现在学习的是第10页，共63页限制性内切酶的发现限制性内切酶的发现限制性核酸内切酶的发现限制性核酸内切酶的发现l1968Li

7、nn和Arber从E.coliB中发现限制酶l1970Smith（美）在流感嗜血杆菌发现限制酶l1978W.Arber，H.O.Smith，Nathans因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖金l限制性核酸内切酶（限制酶）：在细胞内能够识别双链限制性核酸内切酶（限制酶）：在细胞内能够识别双链DNA分分子中的特定核苷酸序列，并对子中的特定核苷酸序列，并对DNA分子进行切割的一种酶。分子进行切割的一种酶。l功能：降解不同源DNA，而不降解同源DNA。现在学习的是第11页，共63页EcoRIEscherichia属名属名Coli种名种名Ry13株系株系编号编号 若若种种名名头头2 2

8、个个字字母母相相同同则则其其中中一一个个可可用用种种名名的的第第一一和和第第三个字母。三个字母。限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的命名现在学习的是第12页，共63页限制性核酸内切酶的活性单位限制性核酸内切酶的活性单位 50L Buffer 50L Buffer 中，含中，含1g 1g 底物底物 DNADNA，于最，于最适反应适反应条件和温度下，保温条件和温度下，保温 1 1 小时，能使小时，能使 1g 1g DNA DNA 完全完全降解所需的酶蛋白量即为一个酶单位，降解所需的酶蛋白量即为一个酶单位，用用 U U 表示。表示。buffer buffer（pH=8.0pH=8.0）：50 m

9、mol/L Tris-HCl 10 mmol/L MgCl50 mmol/L Tris-HCl 10 mmol/L MgCl2 2 1 mmol/L DTT1 mmol/L DTT或巯基乙醇或巯基乙醇 100g BSA/ml 100g BSA/ml（DDTDDT：二硫苏糖醇：二硫苏糖醇 BSABSA：牛血清蛋白：牛血清蛋白)现在学习的是第13页，共63页限制性核酸内切酶的切割特点限制性核酸内切酶的切割特点l在在DNA分子双链的特异性识别序列部位，切分子双链的特异性识别序列部位，切割割DNA分子，产生链的断裂。分子，产生链的断裂。l2个单链断裂部位在个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通分子上的

10、分布，通常不是彼此直接相对。断裂结果形成的常不是彼此直接相对。断裂结果形成的DNA片片段，具有互补的单链延伸末端。段，具有互补的单链延伸末端。现在学习的是第14页，共63页识别序列识别序列绝大多数的绝大多数的型限制性核酸内切酶都能够识别由型限制性核酸内切酶都能够识别由4-84-8个个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。限制性核酸内切酶就是从其核苷酸组成的特定的核苷酸序列。限制性核酸内切酶就是从其识别序列内切割识别序列内切割DNADNA分子的，因此这些识别序列又叫核酸内切分子的，因此这些识别序列又叫核酸内切酶的切割位点或靶序列。酶的切割位点或靶序列。识别序列有连续的（如识别序列有连续的（如GATC）和

11、间断的）和间断的(如如GANTC)两两种，它们都呈回文结构。种，它们都呈回文结构。ABCCBAABCCBAABNBAABNBAABBAABBA或或现在学习的是第15页，共63页EcoR5GAATTC33CTTAAG5不同核酸内切酶的特异识别位点Pst5CTGCAG33GACGTC.5现在学习的是第16页，共63页AAGCTTTTCGAAAAGCTTTTCGAAABCDDNADNAHindHind切割位点核酸内切酶核酸内切酶Hind对双链对双链DNADNA分子的切割作用分子的切割作用现在学习的是第17页，共63页三、种酶切末端三、种酶切末端平齐末端（如平齐末端（如Sma、Alu、Hae）5-GG

12、CC-33-CCGG-55-GG-CC-33-CC-GG-55粘性末端（如粘性末端（如EcoR）5-GAATTC-33-CTTAAG-55-G-AATTC-33-CTTAA-G-53粘性末端（如粘性末端（如 Pst）现在学习的是第18页，共63页同裂酶和同尾酶同裂酶和同尾酶同裂酶：来源不同的限制酶识别相同的核苷酸靶序列。同裂酶：来源不同的限制酶识别相同的核苷酸靶序列。产生同样的切割，形成同样的末端。产生同样的切割，形成同样的末端。如：如：Hpa和和 Msp均可切割均可切割 CCGG。当胞嘧啶甲基化后，当胞嘧啶甲基化后，Msp不能再切割。不能再切割。同尾酶：来源不同，识别的核苷酸靶序列也不相同，

13、同尾酶：来源不同，识别的核苷酸靶序列也不相同，但切割后但切割后DNA分子产生的粘性末端相同的限制分子产生的粘性末端相同的限制性核酸内切酶。性核酸内切酶。现在学习的是第19页，共63页5-GGATCC-33-CCTAGG-5BamH5-TGATCA-33-ACTAGT-5Bcl5-AGATCT-33-TCTAGA-5BglBamHBclBgl三种酶可产生三种酶可产生相同的相同的5GATC粘性末端，由这种同粘性末端，由这种同尾酶产生的尾酶产生的DNA片段可因粘性末端片段可因粘性末端的互补而彼此再连接起来。的互补而彼此再连接起来。现在学习的是第20页，共63页限制性核酸内切酶的反应条件限制性核酸内切

14、酶的反应条件1.底物底物DNA（1）DNA纯度:RNA与E结合影响有效酶浓度；（2）DNA浓度:DNA过大，抑制酶活，影响酶分子扩散如：4gDNA/1UHPa50l3715h1gDNA/1UHPa50l371h现在学习的是第21页，共63页（3）识别位点及邻近位点特异性序列如：pBR322DNA有4个Nar切点(GGCGCC)其中2个切点用1U酶水解1h完全切开,2个切点用50U酶水解16h水解不完全。Xma切点（CGGCCG）在GGCGGCCGCC时不切割。（4）DNA二级/三级结构如：超螺旋如：超螺旋DNA(病毒或质粒病毒或质粒)比线状比线状DNA需酶多需酶多（5）提取时混入杂质可改变识别

15、特异性如：高浓度Hg2+、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等。现在学习的是第22页，共63页2.反应系统因素反应系统因素（1）缓冲液（无菌、无污染）（2）金属离子如：如：型酶需型酶需Mg2+，若以，若以Mn2+代替代替Mg2+（如（如Hind，EcoRI）则特异性改变。）则特异性改变。离子浓度不合适会抑制酶活。离子浓度不合适会抑制酶活。（3）牛血清蛋白(BSA)BSA是酶稳定剂，可避免热、表面张力、化学品导致的酶变是酶稳定剂，可避免热、表面张力、化学品导致的酶变性。过量性。过量BSA会引起电泳拖尾会引起电泳拖尾。限制性核酸内切酶的反应条件限制性核酸内切酶的反应条件现在学习的是第23页

16、，共63页3.星活性星活性限制性内切酶识别特异性放宽。限制性内切酶识别特异性放宽。EcoR在正常情况下识别在正常情况下识别GAATTC序列发生切割，但如果缓冲序列发生切割，但如果缓冲液中甘油浓度超过液中甘油浓度超过5%，其识别位点发生松动，可在，其识别位点发生松动，可在AATT处发生切处发生切割，割，EcoR这种特殊的识别能力叫做星活性，用这种特殊的识别能力叫做星活性，用EcoR*表示。星活表示。星活性可造成位点切割机率不等，降解不完全。性可造成位点切割机率不等，降解不完全。影响因素影响因素：甘油浓度：甘油浓度12-20%，酶与，酶与DNA比例，离子强度，比例，离子强度，45%聚乙二醇聚乙二醇

17、(PEG)，有机溶剂，有机溶剂，8%二甲基亚枫，二价阳离子，二甲基亚枫，二价阳离子，12%乙醇。乙醇。限制性核酸内切酶的反应条件限制性核酸内切酶的反应条件现在学习的是第24页，共63页l重组重组DNADNA前的切割前的切割 l构建新质粒构建新质粒l构建物理图谱构建物理图谱lDNA分子杂交分子杂交l用限制性内切酶消化受体用限制性内切酶消化受体DNAl制备制备DNA探针探针l亚克隆以用作序列分析亚克隆以用作序列分析l基因定位，基因定位，DNA同源性研究同源性研究限制性核酸内切酶的应用限制性核酸内切酶的应用现在学习的是第25页，共63页l重组重组DNADNA前的切割前的切割 l构建新质粒构建新质粒l

18、构建物理图谱构建物理图谱lDNA分子杂交分子杂交l用限制性内切酶消化受体用限制性内切酶消化受体DNAl制备制备DNA探针探针l亚克隆以用作序列分析亚克隆以用作序列分析l基因定位，基因定位，DNA同源性研究同源性研究限制性核酸内切酶的应用限制性核酸内切酶的应用现在学习的是第26页，共63页甲基化酶分两类：甲基化酶分两类：l维持性甲基化酶：用于在新合成的维持性甲基化酶：用于在新合成的DNA链上进行甲基化的酶。甲基链上进行甲基化的酶。甲基化位置与模板链上的相同。化位置与模板链上的相同。l构建性甲基化酶：用于在非甲基化的构建性甲基化酶：用于在非甲基化的DNA链上进行甲基化的酶。链上进行甲基化的酶。用甲

19、基化酶进行甲基化的作用用甲基化酶进行甲基化的作用封闭封闭DNA链中的某些识别位点，保护多余的限制性酶切位点。链中的某些识别位点，保护多余的限制性酶切位点。构建新的酶切位点构建新的酶切位点现在学习的是第27页，共63页DNA连接酶（连接酶（ligase）l能够催化DNA中相邻的3-羟基和5-磷酸基末端之间形成3，5-磷酸二酯键;lT4DNA连接酶可连接带匹配粘性末端的DNA分子，也可使平端的双链DNA分子相互连接。l大肠杆菌DNA连接酶只能连接带匹配粘末端的DNA分子.现在学习的是第28页，共63页ds-DNA结构结构:切口切口,缺口缺口,断口断口缺口缺口(gap)切口切口(nick)断口断口(

20、cut)3HOP53HOP5现在学习的是第29页，共63页AATTCGGCTTAAAATTCGGCTTAA5555(1)(2)AATTCGGCTTAAAATTCGGCTTAA55AATTCGGCTTAA55(a)分子间连接(b)分子内连接(1)(2)ATGCTATAGCTAT4连接酶T4连接酶现在学习的是第30页，共63页一一.DNA的连接方法的连接方法两种不同的两种不同的DNA分子可以经过下述的方法之一进行连接分子可以经过下述的方法之一进行连接,而方法的选而方法的选用则是根据其两者末端的用则是根据其两者末端的DNA结构结构.1.直接连结法直接连结法-该法适用于该法适用于:1)同种限制酶作用不

21、同同种限制酶作用不同DNA片段产生的片段产生的相同粘性末端相同粘性末端重组重组DNA可用同种酶再切开可用同种酶再切开2)不同种限制酶作用不同不同种限制酶作用不同DNA片段产生的片段产生的相容性末端相容性末端i.重组重组DNA分子不能再为这两种酶所作用分子不能再为这两种酶所作用,如如:BamHI/BglIIii.重组重组DNA分子可为其中一种酶所作用分子可为其中一种酶所作用,但为另一种酶作用的可能但为另一种酶作用的可能性较小性较小,如如MboI/BamHI3)PCR产物与特定载体的连接产物与特定载体的连接4)限制酶和其他方式产生的限制酶和其他方式产生的平末端平末端.现在学习的是第31页，共63页

22、2.人工接头连接法人工接头连接法1)人工接头（人工接头（linker）的结构）的结构i.中轴对称互补中轴对称互补,可自行退火形成双链可自行退火形成双链.如如:5-CCGGAATTCCGG-33-GGCCTTAAGGCC-5ii.至少有一特定的限制酶识别位点至少有一特定的限制酶识别位点iii.某种限制酶的一套人工接头可使插入片段与表达载体保持同相某种限制酶的一套人工接头可使插入片段与表达载体保持同相.如如:八聚体八聚体d(GGAATTCC)十聚体十聚体d(CGGAATTCCG)十二聚体十二聚体d(CCGGAATTCCGG)2)用途用途i.平整末端的连接平整末端的连接(各种结构的各种结构的DNA末

23、端均可经过修饰变成平整末末端均可经过修饰变成平整末端端)2X5-CCGGAATTCCGG-3退火退火现在学习的是第32页，共63页ii.产生新的克隆位点产生新的克隆位点iii.合成匹配接头合成匹配接头3)连接方法连接方法人工接头磷酸化人工接头磷酸化退火形成双链退火形成双链与目的与目的DNA相连相连限制限制酶切酶切两两DNA分子相连分子相连4)适用范围适用范围 人工接头连接法适合于那些只有一种人工接头连接法适合于那些只有一种DNADNA片段需加人工接头就可以片段需加人工接头就可以与另一与另一DNADNA分子相连的分子相连的DNADNA分子分子.利用人工接头也可使任意两个平端的利用人工接头也可使任

24、意两个平端的DNADNA分子相连分子相连.这种直接相连的办法简便这种直接相连的办法简便,快速快速,但最后连接起来的但最后连接起来的DNADNA可可能具有不同的结构能具有不同的结构.为避免这些结构的产生为避免这些结构的产生,可先使一种可先使一种DNADNA先加上人工接先加上人工接头后头后,再与另一种再与另一种DNADNA分子相连分子相连.现在学习的是第33页，共63页3.匹配接头连接法匹配接头连接法人工接头虽然可连接两个具不同末端的人工接头虽然可连接两个具不同末端的DNA分子分子,但这些末端在加入人但这些末端在加入人工接头前必须变为平整末端工接头前必须变为平整末端.然而然而,有时实验不容许使用人

25、工接头或使用有时实验不容许使用人工接头或使用人工接头不方便人工接头不方便,此时此时,便可使用匹配接头便可使用匹配接头,它可用于直接连接各种具不同末它可用于直接连接各种具不同末端的端的DNA分子分子:i.平端平端+突起末端突起末端(5-突起突起,3-突起突起)ii.粘性末端粘性末端(5-突起突起+5-突起突起:EcoRI+HindIII5-突起突起+3-突起突起:EcoRI+PstI3-突起突起+3-突起突起:PstI+SacI)1)匹配接头的结构特点匹配接头的结构特点i.由两个低聚核苷酸组成由两个低聚核苷酸组成ii.部分区域可以互补部分区域可以互补iii.退火后的双链低聚核苷酸可以形成两个不同

26、的末端退火后的双链低聚核苷酸可以形成两个不同的末端2)匹配接头的种类匹配接头的种类现在学习的是第34页，共63页i.预制匹配接头预制匹配接头(连接平端和粘性末端连接平端和粘性末端)人工接头人工接头+匹配接头匹配接头预制匹配接头预制匹配接头ii.转换匹配接头转换匹配接头(连接连接5-突起和突起和3-突起末端突起末端)二匹配接头退火二匹配接头退火转换匹配接头转换匹配接头二人工接头二人工接头连接酶连接酶双酶切双酶切转换匹配接头转换匹配接头iii.单链匹配接头单链匹配接头(连接连接5-突起和突起和3-突起末端突起末端)4.同聚物加尾连接法同聚物加尾连接法在两个不同的在两个不同的DNA分子末端各加上一个

27、可互补的同聚物分子末端各加上一个可互补的同聚物,即即AT或或GC.5.连接方法的选择连接方法的选择方法选择的依据方法选择的依据:1)两两DNA分子的末端结构分子的末端结构2)DNA分子的限制酶谱分子的限制酶谱3)是否需要回收是否需要回收DNA片段片段现在学习的是第35页，共63页连接方式的选择连接方式的选择载体末端载体末端外源外源DNA末端末端常规连接常规连接脱磷酸化脱磷酸化同聚物同聚物平端连接平端连接补齐补齐,人工接头人工接头结构结构结构结构载体载体加尾加尾外切酶外切酶5-突起突起相容相容5-突起突起第二选择第二选择第一选择第一选择不能不能不能不能不能不能5-突起突起非相容非相容5-突起突起

28、不能不能结合使用接头结合使用接头不能不能不能不能第一选择第一选择3-突起突起相容相容3-突起突起唯一选择唯一选择不能不能不能不能不能不能不能不能3-突起突起非相容非相容3-突起突起不能不能不能不能第一选择第一选择不能不能第二选择第二选择或平端或平端3-突起突起5-端突起端突起不能不能不能不能第一选择第一选择不能不能第二选择第二选择(补齐后补齐后)平端平端平端平端不能不能可能可能可能可能第一选择第一选择可能可能平端平端3-或或5-突起突起不能不能不能不能第一选择第一选择不能不能第二选择第二选择现在学习的是第36页，共63页二二.DNA的连接反应的连接反应1.连接反应理论连接反应理论当两种当两种D

29、NA分子相连时分子相连时,它们可能产生不同的结果它们可能产生不同的结果,这些结果与以这些结果与以下因素有关下因素有关:1)连接反应系统中的总连接反应系统中的总DNA浓度浓度i2)一个一个DNA分子靠近同一分子另一端的有效浓度分子靠近同一分子另一端的有效浓度j,该值与该值与DNA的长的长度成反比度成反比,即即DNA分子越大分子越大,该分子的两末端越不易相互作用该分子的两末端越不易相互作用(即自即自身环化身环化)3)两种不同两种不同DNA分子的克分子浓度之比值分子的克分子浓度之比值.2.连接反应条件连接反应条件1)评估连接反应结果的方法评估连接反应结果的方法i.琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳ii.大

30、肠杆菌转化大肠杆菌转化2)反应条件反应条件现在学习的是第37页，共63页i.温度温度ii.ATP浓度浓度iii.时间时间iv.连接酶浓度连接酶浓度v.克分子比率克分子比率现在学习的是第38页，共63页DNA聚合酶（聚合酶（DNApolymerase）DNA聚合酶指在DNA(或RNA)模板指导下，以4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）为底物，在引物3OH末端聚合DNA链的一类酶。DNA聚合酶在DNA复制时起关键作用。DNA聚合酶主要有三类：聚合酶（pol），聚合酶(pol)，聚合酶(pol)。其中聚合酶参与 DNA修复，聚合酶参与 DNA复制。聚合酶是基因工程中的常用酶。现在学习的是第39页，共63页

31、DNA聚合酶聚合酶和和 的的比较比较现在学习的是第40页，共63页DNA聚合酶聚合酶的的特点：特点：需模板需模板(DNA或或RNA)；需引物；需引物；具有三种酶活性，即具有三种酶活性，即53聚合酶活性；聚合酶活性；53外切酶活性和外切酶活性和35外切外切酶活性。外切外切酶活性。DNA聚合酶（聚合酶（DNApolymerase）现在学习的是第41页，共63页DNA聚合酶在 DNA复制过程中的作用现在学习的是第42页，共63页1、53聚合酶活性：聚合酶活性：CCGGGCTATCGGE.coli DNApolIMg2+，4dNTPCCGATAGCCGGCTATCGG2、53外切酶活性外切酶活性3、3

32、5外切酶活性外切酶活性GATAGCCAGCTATCGGTCGATAGCCAGCTATCGGE.coli DNApolIMg2+pC，pT5TCGATAGCCAGCTATE.coli DNApolIMg2+TCGATAAGCTAT+pC，pG，pC5DNA聚合酶的三种活性聚合酶的三种活性现在学习的是第43页，共63页DNA DNA 的切口平移（的切口平移（nick translationnick translation）DNA聚合酶聚合酶在分子克隆中的主要用途是通过在分子克隆中的主要用途是通过 DNA缺口平缺口平移，制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的移，制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的 D

33、NA探针。此时，探针。此时，DNA聚合酶聚合酶的的 5-3核酸外切酶活性和核酸外切酶活性和 5-3聚合酶活性同时发聚合酶活性同时发生。生。5353355353355-3外切酶活性5-3聚合酶活性535335535335未经标记的核苷酸经标记的核苷酸现在学习的是第44页，共63页DNA 杂交探针的制备杂交探针的制备53355335533553355335*(a)(b)(c)(d)(e)(a)双链的DNA分子(b)带有3-OH末端的单链缺口(c)pol从5-P移去一个核苷酸(d)pol将32P标记的核苷酸参入取代被移去的核苷酸(e)重复(c)(d)的步骤，缺口沿5-3方向移动，形成32P标记的核苷

34、酸合成的DNA链现在学习的是第45页，共63页探针（probe）l探针：用来探知被测物存在的小DNA或RNA叫做探针。l标记物：探针上结合有易被检测的化合物称为标记物。l分子杂交：探针DNA或RNA与被测物的互补结合叫做分子杂交（molecularhybridization）现在学习的是第46页，共63页DNA聚合酶来源E.coli，由染色体DNA基因编码。商品上用的此酶来源于PhageNM964整合的溶源性E.coli。结构一条多肽链，MW=109，000D。l活性53聚合，35和53外切。现在学习的是第47页，共63页Klenowl来源：E.coliDNAPolymerase经蛋白酶水解的

35、大片段(Klenow和Henningseon.1970DNApol枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶C端端(76kd)+N端（端（36kd）Klenow53聚合35外切53外切现在学习的是第48页，共63页Klenow用途l填补限制酶的5-粘性末端为平齐末端5CC3GGAATT5CCTTAA33GGAATT5Klenow3-末端标记Klenow在无底物时只进行35外切；有底物存在时则聚合。这种标记也称作交换标记，但Klenow作用不如T4DNA聚合酶。现在学习的是第49页，共63页T4DNA 聚合酶来源：T4Phage感染的E.coli 结构：MW=114,000d活性：53聚合活性；35外切活性，对单

36、链活性大于双链DNA，外切酶活性比Klenow大200倍用途l填补或标记限制酶切后产生的5-粘性末端的3-凹缺末端。（同Klenow）3-粘性末端的标记制备DNA探针,同Klenow末端标记。现在学习的是第50页，共63页T7DNA聚合酶（测序酶）来源：T7Phage感染的E.coli 结构：由2个蛋白亚基组成：T7phagegene5蛋白+宿主硫氧蛋白活性：53聚合，持续反应时间最长，所以合成的DNA链长。故在DNA测序中很优越。35外切，是DNA聚合酶的1000倍。现在学习的是第51页，共63页l用途用途l复制较长的模板，在测序中可读出较长的序列l用填补或交换反应快速进行末端标记。l与TD

37、NApol一样，平齐粘性末端。l定点突变中互补链的合成。553 3 3355现在学习的是第52页，共63页修饰的 T7DNA 聚合酶(测序酶)来源：天然TDNA聚合酶经修饰处理结构：同T聚合酶。用还原剂、分子氧、低浓度Fe+与酶保温几天，可使PhageT7gene5蛋白N-端35外切酶活性中心失活(O-修饰)。即：53聚合酶作用提高，持续性长。35外切作用下降99%以上。现在学习的是第53页，共63页Taq DNA 聚合酶(Thermusaqraticus)来源：从耐热细胞中纯化，已有基因工程酶多种结构：单亚基MW=94,000d。活性：聚合最适温度为75-80，不具35外切酶活性，具53外切

38、活性。用途：PCR反应。测序，高温下进行DNA合成可减少模板二级结构。现在学习的是第54页，共63页末端转移酶末端转移酶(不依赖模板的不依赖模板的 DNA 聚合酶聚合酶)来源来源：只在前淋巴细胞和淋巴细胞分化早期阶段中存：只在前淋巴细胞和淋巴细胞分化早期阶段中存在的罕见的在的罕见的DNA聚合酶聚合酶(Chang和和Bollum,1986)。结构结构：MW=60,000d.活性活性：催化催化dNTP掺入掺入DNA3-OH末端，形成同聚物末端，形成同聚物末端；反应不需模板末端；反应不需模板DNA，需，需Co2+用途用途：克隆克隆DNA片段时加上互补片段时加上互补同聚物末端同聚物末端，便于与载体连接

39、。，便于与载体连接。末端标记末端标记现在学习的是第55页，共63页反转录酶反转录酶(reverse transcriptase)(reverse transcriptase)l来源：商品反转录酶有两种来源：商品反转录酶有两种l来自禽类成髓细胞瘤病毒来自禽类成髓细胞瘤病毒(AMV)。l来自能表达来自能表达Moloney鼠白血病毒鼠白血病毒(M-MLV)反转录酶基因反转录酶基因的的E.coli。l结构和活性：结构和活性：+84，000M-MLV+62，00094，000AMVRNAseH5-3聚合活性肽链酶类别现在学习的是第56页，共63页用途：对RNA:DNA杂交体中的RNA特异性地降解，免除了

40、在反转录完成后再用NaOH降解RNA模板的步骤。现在学习的是第57页，共63页l来源来源lT7、T3RNA聚合酶在聚合酶在E.coli（或细菌）中的克隆表达。（或细菌）中的克隆表达。lE.coli RNA聚合酶。聚合酶。l活活性性：在在DNA指指导导下下合合成成RNA，结结合合于于启启动动子子部部位位，转转录录无无意意义义链链(一一)产产生生与与有有意意义义链链相相似似(以以U代代替替模模板板中中T)的链。的链。转录链为无意义链，负链转录链为无意义链，负链(-)。不转录链为有意义链，正链不转录链为有意义链，正链(+)。RNA聚合酶（聚合酶（RNApolymerase）现在学习的是第58页，共6

41、3页磷酸激酶催化5-OH加P（标记）和磷酸酶去除5-P（防止自身环化）PNKasePMase 5HO A T T A G C C C G 5HO A T T A G C C C G T A A T C G G G C OH 5 T A A T C G G G C OH 5多核苷酸激酶多核苷酸激酶磷酸甲酯酶磷酸甲酯酶Phosphomonoesterase 5p A T T A G C C C G 5p A T T A G C C C G T A A T C G G G C p 5 T A A T C G G G C p 5磷酸激酶和磷酸酶磷酸激酶和磷酸酶现在学习的是第59页，共63页核酸酶（核酸

42、酶（nuclease）Bal13核酸酶l从DNA末端同时降解两条链。l用于基因表达调控序列的研究。lS1核酸酶l降解单链核酸。l用于把具粘性末端的DNA变为平齐末端的DNA。在DNA部分变性条件下，能在富含AT区切断DNA。现在学习的是第60页，共63页核酶（核酶（ribozyme）l具有酶活性的具有酶活性的RNA片段。片段。l是真核生物转录产物地内含子本身含有的前是真核生物转录产物地内含子本身含有的前导序列，能在离体条件下特异地催化内含子剪导序列，能在离体条件下特异地催化内含子剪切。切。l1981Cech和和Altman首次发现，并因此获得首次发现，并因此获得1989年的诺贝尔奖。年的诺贝尔奖。l核酶可以作为核酶可以作为RNA的限制性内切酶用于的限制性内切酶用于基因操作。基因操作。现在学习的是第61页，共63页现在学习的是第62页，共63页感谢大家观看现在学习的是第63页，共63页