大肠杆菌感受态细胞讲稿.ppt

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1、关于大肠杆菌感受态细胞第一页，讲稿共二十三页哦1.实验目的和要求实验目的和要求通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆菌通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和外源质粒感受态细胞和外源质粒DNA转入受体菌转入受体菌细胞的技术以及筛选转化体的技术。了解细胞的技术以及筛选转化体的技术。了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。的意义。第二页，讲稿共二十三页哦2.相关知识及原理相关知识及原理感受态细胞感受态细胞(Competent cells):受受体体细细胞胞经经过过一一些些特特殊殊方方法法（如如：CaCl，RuCl等等化化学学试试剂剂法法）的的处处理理后后

2、，细细胞胞膜膜的的通通透透性性发发生生变变化化，成成为为能能容容许许多多有有外外源源DNA的的载载体体分分子子通过的感受态细胞通过的感受态细胞(competent cell)。第三页，讲稿共二十三页哦转化（转化（transformation）：是是将将异异源源DNA分分子子引引入入一一细细胞胞株株系系，使使受受体体细细胞胞获获得得新新的的遗遗传传性性状状的的一一种种手手段段，是是基基因因工工程程等等研研究究领领域的基本实验技术。域的基本实验技术。进入细胞的进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化信息的转移，使受体细

3、胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。第四页，讲稿共二十三页哦转化的方法：转化的方法：1.化学的方法化学的方法(热击法热击法)；使用化学试剂（如；使用化学试剂（如CaCl）制备的感受态细胞，通过热击处理将）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体载体DNA分子导入受体细胞；分子导入受体细胞；2.电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体D

4、NA分子导入受体细胞。分子导入受体细胞。第五页，讲稿共二十三页哦克隆的筛选：克隆的筛选：主要用不同抗生素基因筛选。常用的抗主要用不同抗生素基因筛选。常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等；素、四环素、链霉素等；第六页，讲稿共二十三页哦将经过转化后的细胞在选择性抗生素培养基中培将经过转化后的细胞在选择性抗生素培养基中培养，才能较容易地筛选出转化体，即带有异源养，才能较容易地筛选出转化体，即带有异源DNA分子的受体细胞。否则，如果将转化后的菌分子的受体细胞。否则，如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养基平板上，会出现液涂在无选择性抗生素

5、的培养基平板上，会出现成千上万的细菌菌落，将难以确认哪一个克隆含成千上万的细菌菌落，将难以确认哪一个克隆含有转化的质粒。虽然只有那些含有被转化质粒的有转化的质粒。虽然只有那些含有被转化质粒的细菌才能在含有抗生素的平板上生长和繁殖，但细菌才能在含有抗生素的平板上生长和繁殖，但对于连接混合物而言，此时并不能确定哪个克隆对于连接混合物而言，此时并不能确定哪个克隆含有插入片段。含有插入片段。第七页，讲稿共二十三页哦重组质粒克隆的鉴定重组质粒克隆的鉴定鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有-互补、互补、小规模制备质粒小规模制备质粒DNA进行酶切分析、插入失活、进行酶切分析、

6、插入失活、PCR以及杂交筛选的方法。最常用的方法是小规以及杂交筛选的方法。最常用的方法是小规模制备质粒模制备质粒DNA进行酶切分析，对于带有进行酶切分析，对于带有LacZ基因的载体还可以结合基因的载体还可以结合-互补现象来筛选。互补现象来筛选。第八页，讲稿共二十三页哦-互补现象：互补现象：因为有些载体都带有一个因为有些载体都带有一个LacLacZ Z基因的调控序列和基因的调控序列和头头146146个氨基酸的编码信息，编码个氨基酸的编码信息，编码-互补肽，该肽互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型段能与宿主编码的缺陷型-半乳糖苷酶实现基因半乳糖苷酶实现基因内互补（内互补（-互补互补）。）。当这种载体

7、转入可编码当这种载体转入可编码 半半乳糖苷酶乳糖苷酶C C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基-D-D硫代半乳糖苷（硫代半乳糖苷（IPTGIPTG）的诱导下，）的诱导下，宿主可同时合宿主可同时合成这两种肽段，成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为以称这种现象为-互补现象。互补现象。第九页，讲稿共二十三页哦由互补产生的由互补产生的 半乳糖苷酶半乳糖苷酶(LacLacZ)Z)能够作用于能够作用于生色底物生色底物5 5溴溴4 4氯氯3 3吲

8、哚吲哚 D D半乳糖半乳糖苷苷(X-gal)(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源个多克隆位点，当插入一个外源DNADNA片段时，会片段时，会造成造成LacLacZ(Z()基因的失活，破坏基因的失活，破坏-互补作用，互补作用，就就不能产生具有活性的酶。所以，有重组质粒的菌落不能产生具有活性的酶。所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。第十页，讲稿共二十三页哦第十一页，讲稿共二十三页哦重组重组DN

9、ADNA转化细菌过程转化细菌过程示意图示意图第十二页，讲稿共二十三页哦3仪器、材料和试剂仪器、材料和试剂无无菌菌超超净净台台，电电热热恒恒温温水水浴浴，分分光光光光度度计计，离离心心机机，移移液器，微型离心管等；液器，微型离心管等；菌株：菌株：E.coliE.coli DH5 DH5质质粒粒：pBluscript KS+DNA 片片段段的的重重组组质质粒粒以以及及pBluscript KS 空质粒；空质粒；LBLB培培养养基基；含含抗抗菌菌素素的的LBLB平平板板培培养养基基（氨氨苄苄青青霉霉素素，浓浓度度50-10050-100g gmLmL，X-gal X-gal 20-4820-48g/

10、ml,g/ml,IPTG IPTG 100 100 g/mlg/ml。一一般般将将抗抗生生素素、X-galX-gal和和IPTGIPTG配配制制成成10001000 储储备液，用时按培养基的量再加入备液，用时按培养基的量再加入）；）；预冷预冷CaClCaCl2 2溶液（溶液（0.1mol0.1molL L）第十三页，讲稿共二十三页哦4操作步骤操作步骤 1）大肠杆菌感受态细胞的制备）大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法法)（1）从从新新活活化化的的E.coli DH5菌菌平平板板上上挑挑取取一一单单菌菌落落，接接种种于于35ml LB液液体体培培养养中中，37振振荡荡培培养养12h左左右右，直

11、直至至对对数数生生长长期期。将将该该菌菌悬悬液液以以1:1001:50转转接接于于100ml LB液液体体培培养养基基中中，37振振荡荡扩扩大大培培养养，当当培培养养液液开开始始出出现现混混浊浊后后，每每隔隔2030min测测一一次次OD600nm，至至OD600nm0.5时时停停止培养；止培养；第十四页，讲稿共二十三页哦（2）每每组组取取培培养养液液3个个2ml转转入入2ml离离心心管管中中，在在冰冰上上冷冷却却20-30min，于于4，4000rmin离离心心10min（从从这这一一步步开开始始，所所有有操操作作均均在在冰冰上上进进行行，速度尽量快而稳）；速度尽量快而稳）；（3）倒倒净净上

12、上清清培培养养液液，用用1ml冰冰冷冷的的0.1mo1L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴；溶液轻轻悬浮细胞，冰浴；（4）04，4000rmin离心离心10min；（5）弃弃去去上上清清液液，加加入入500l冰冰冷冷的的0.1mo1L CaCl2溶溶液液，小小心心悬悬浮浮细细胞胞。04，4000rmin离心离心10min；第十五页，讲稿共二十三页哦（6）弃弃去去上上清清液液，加加入入100l冰冰冷冷的的0.1mo1L CaCl2溶溶液液，小小心心悬悬浮浮细细胞胞，冰冰上上放放置置片片刻刻后后，即制成了感受态细胞悬液；即制成了感受态细胞悬液；（7）制制备备好好的的感感受受态态细细胞胞悬悬液液可可

13、直直接接用用于于转转化化实实验验，也也可可加加入入占占总总体体积积15左左右右高高压压灭灭菌菌过过的的甘甘油油，混混匀匀后后分分装装于于1.5ml离离心心管管中中，置置于于-70条条件件下下，可保存半年至一年。可保存半年至一年。第十六页，讲稿共二十三页哦2）细胞转化）细胞转化(1)分别取分别取3个个100l感受态细胞悬液感受态细胞悬液(如是冷冻如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操作保存液，则需化冻后马上进行下面的操作)，第，第一组，加入一组，加入10 l重组质粒重组质粒DNA(体积不超过体积不超过10l)+100l感受态细胞，此管为转化实验组。感受态细胞，此管为转化实验组。第二组，插入第

14、二组，插入DNA片段对照组，即酶切后片段对照组，即酶切后DNA片段片段25ng+100l感受态细胞悬液；第三组，质感受态细胞悬液；第三组，质粒粒DNA对照组，即对照组，即1ng 未酶切未酶切pBluescript 质粒质粒DNA十十100l感受态细胞悬液。感受态细胞悬液。第十七页，讲稿共二十三页哦(2)将将以以上上各各样样品品轻轻轻轻摇摇匀匀，冰冰上上放放置置20-30min，于于42水水浴浴中中保保温温12min，然然后后迅迅速速冰冰上上冷冷却却2min(3)立立即即向向上上述述管管中中分分别别加加入入0.4ml LB液液体体培培养养基基（不不需需在在冰冰上上操操作作），使使总总体体积积到到

15、0.5ml，该该溶溶液液称称为为转转化化反反应应原原液液，摇摇匀匀后后于于37振振荡荡培培养养约约45-60min，使使受受体体菌菌恢恢复复正正常常生生长长状状态态，并使转化体表达抗生素基因产物并使转化体表达抗生素基因产物(Ampr)。第十八页，讲稿共二十三页哦3)平板培养（有时需要稀释）平板培养（有时需要稀释）(1)取取各各样样品品培培养养液液0.1ml，分分别别接接种种于于含含抗抗菌菌素素LB平平板板培培养养基基上上，涂涂匀匀（如如果果用用玻玻璃璃棒棒涂涂抹抹，酒酒精精灯灯烧烧过过后后稍稍微微凉凉一下再用，不要过烫）。一下再用，不要过烫）。第十九页，讲稿共二十三页哦(2)菌液完全被培养基吸

16、收后菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于，倒置培养皿，于37恒温培养箱内培养过夜恒温培养箱内培养过夜(12-16小时小时)，待菌，待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养，对于落生长良好而又未互相重叠时停止培养，对于可以蓝白斑筛选的质粒和菌株来说，此时应该可以蓝白斑筛选的质粒和菌株来说，此时应该能清楚地看到蓝色和白色菌落。能清楚地看到蓝色和白色菌落。用用 CaCl2法制备的感受态细胞，可使每微克超螺法制备的感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒旋质粒 DNA产生产生5 106-2 107个转化菌落。在实个转化菌落。在实际工作中，每微克有际工作中，每微克有105以上的转化菌落足以满以上的转化菌落足以满

17、足一般的克隆实验。足一般的克隆实验。第二十页，讲稿共二十三页哦4)检出转化体和计算转化率检出转化体和计算转化率统计每个培养皿中的菌落数，各实验组培养皿统计每个培养皿中的菌落数，各实验组培养皿内菌落生长状况应如表所示内菌落生长状况应如表所示:第二十一页，讲稿共二十三页哦组组组组含抗菌素的平板含抗菌素的平板含抗菌素的平板含抗菌素的平板结果说明结果说明结果说明结果说明 转化实验组转化实验组转化实验组转化实验组 白色菌落和少量白色菌落和少量白色菌落和少量白色菌落和少量蓝色菌落蓝色菌落蓝色菌落蓝色菌落说明有重组质粒导入细说明有重组质粒导入细说明有重组质粒导入细说明有重组质粒导入细胞中（有时还需要酶切胞中

18、（有时还需要酶切胞中（有时还需要酶切胞中（有时还需要酶切进一步鉴定进一步鉴定进一步鉴定进一步鉴定插入插入插入插入DNADNA片段片段片段片段对照组对照组对照组对照组无菌落或极少量无菌落或极少量无菌落或极少量无菌落或极少量白色菌落白色菌落白色菌落白色菌落说明插入片段比较纯或说明插入片段比较纯或说明插入片段比较纯或说明插入片段比较纯或有少量模板有少量模板有少量模板有少量模板DNADNA存在存在存在存在 质粒对照组质粒对照组质粒对照组质粒对照组 蓝色菌落蓝色菌落蓝色菌落蓝色菌落可以判断感受态细胞的可以判断感受态细胞的可以判断感受态细胞的可以判断感受态细胞的效率效率效率效率各实验组在培养皿内菌落生长状况及结果分析各实验组在培养皿内菌落生长状况及结果分析第二十二页，讲稿共二十三页哦感感谢谢大大家家观观看看第二十三页，讲稿共二十三页哦