银花平感颗粒抗耐药金黄色葡萄球菌活性的研究.doc

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1、引 言金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种常见食源性致病微生物，该菌引起的感染占临床感染的第二位，常引起局部甚至全身化脓性感染，如复杂的局部皮肤和软组织感染（Complicated skin and soft tissue infection，CSST I）、感染性心内膜炎、骨关节感染、假肢装置感染（Prosthetic device infection，PDI）和胸膜肺感染，还会引发全身感染的败血症、脓毒症等 1,2。早期临床治愈率高，治疗方式简单快速，青霉素在早期对金黄色葡萄球菌的控制有一定的效果，如今对-内酰胺类、氨基苷类、大环内酯类、利福平等药物均有耐药现

2、象。产生耐药现象的主要原因是-内酰胺酶的产生,因为抗生素的滥用，部分菌株适应了抗生素的作用，能够破坏-内酰胺环，产生耐药性，临床治疗困难。早期临床试验证明，细菌细胞壁粘肽合成离不开青霉素结合蛋白的合成，而-内酰胺类抗生素能有效的抑制蛋白的合成，破坏细胞壁结构，菌体膨胀裂解，有效抑菌，但目前存在耐药现象。研究表明,青霉素结合蛋白(Penicillin binding proteins，PBPs)的改变是主要耐药机制，通过影响临床抗菌药作用的主要靶位，干扰抑菌作用。PBP2a是由mecA基因编码的蛋白质3，能降低细菌与-内酰胺类抗生素的结合能力，在PBPs失去活性后代替其功能保证细菌细胞壁的合成，

3、维持金黄色葡萄球菌的生长和存活4。MRSA就是通过作用靶位的变化，参与耐药基因的表达。PBP4可以通过PBP4启动子突变导致PBP4过度产生，进而促进增强细菌细胞壁的交联，在对-内酰胺类药物耐药中发挥重要作用5。除此之外，PBP4的错译突变也和耐药性有关5，外排系统和生物被膜的存在也与耐药蛋白有关，减少了抗生素在菌体内的积聚6。万古霉素和替考拉宁是临床治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的常用药物，属于糖肽类抗生素。万古霉素治疗时，部分人作用后会出现不良反应，近年来出现中介和耐药的细菌。替考拉宁对多药耐药菌如MRSA敏感7，比万古霉素更安全，但是万古霉素过敏的患者可能出现交叉过敏反应。利奈唑胺和替

4、加环素通过干扰细菌蛋白质合成达到抑菌作用，且不易发生交叉耐药，但是也存在不同程度的不良反应8。泰巴坦属于-内酰胺酶抑制剂,常与哌拉西林联用，头孢呋辛钠、头孢他啶分别为第二、三代头孢菌素，查阅相关文献得知这两种药物抗菌活性强，对-内酰胺酶较稳定。中药在我国有悠久的历史，具有不良反应少、可以同时缓解关联症状等特点，且治疗费用低，对预防和控制细菌性感染疾病方面有优势9。我国较多的历史实践和现代实验研究证明，中药的抗菌疗效显著，中药制剂联合抗生素针对常见致病菌感染的治疗的研究逐渐受到重视。近年来中药治疗金黄色葡萄球菌感染的效果显著，逐渐得到国内外学者的一致认可与宠爱，尤其针对多重耐药的菌株,中药的研究

5、和应用前景非常广阔。有研究表明，中药有一定的对抗细菌耐药的作用，人体不易产生依赖性10。中药的抑菌效果和通过提高人体抵抗力来间接发挥抗菌作用，这两个方面是中药抗菌抗炎的主要优势所在。目前已有研究表明，中药对金黄色葡萄球菌的抑菌作用主要表现在对金黄色葡萄球菌生物膜、青霉素结合蛋白、细菌外排系统等方面。生物膜的形成是金黄色葡萄球菌逃避抗生素作用并产生耐药性的重要环节，给金黄色葡萄球菌提供了有利的生存环境，使其对传统的治疗方式产生了反应差。金黄色葡萄球菌通过改善自身生物膜的形成和通透性，来抵抗抗生素的杀菌作用，从而阻碍抗生素的杀害，而中药治疗可以明显改善细胞膜的通透性，这也是中药抗金黄色葡萄球菌的重

6、要机制之一。除此之外，某些金黄色葡萄球菌还存在能够对抗-内酰胺类抗生素的-内酰胺酶，阻断抗生素的杀菌作用，出现了耐药现象。而中药可以抑制-内酰胺酶的活性，从而防止金黄色葡萄球菌耐药性的产生。外排泵作用也是金黄色葡萄球菌耐药机制之一，中药还可以抑制外排泵作用，消除耐药质粒，逆转细菌耐药性，此外中药及其有效成分抑制金黄色葡萄球菌生长以及逆转金黄色葡萄球菌耐药的效果显著，这对金黄色葡萄球菌感染的临床治疗至关重要11。当中药针对金黄色葡萄球菌的抑菌作用的研究逐渐开展和深入，中药制剂联合红霉素等抗菌药物治疗金黄色葡萄球菌感染逐渐成为科研领域的热点。表儿茶素和表儿茶素没食子酸酯是类黄酮的主要代表，研究表明

7、这类成分作用可以使MRSA对-内酰胺类抗生素敏感。Maria Miklasiska12的进一步研究证明，儿茶素（Catechin， CH）显示出对金黄色葡萄球菌的抗菌活性，并且可以显著增加红霉素和克林霉素的抗菌效果，呈协同作用。黄德斌13的研究指出，马桑水提取物（Coriaria sinica extract，CSE）对MRSA 具有显著的抑制作用。该实验组进一步研究表明，CSE 与氨苄西林等抗生素联用能够呈显著抑制MRSA的生长。在氨苄西林对MRSA抑菌作用很弱的情况下，CSE单独作用或与氨苄西林联用均能使PBP2a的表达降低。这些结果的出现可能与细菌的主动外排系统受药物影响有关。杜仲叶14

8、的研究表明，金黄色葡萄球菌生物被膜可被黄岑苷破坏，黄岑苷可协同利奈唑胺进入生物被膜内杀灭其中的金黄色葡萄球菌达到抗菌效果。本次实验中，我们采用了常用-内酰胺类抗生素以及临床常用抗生素(万古霉素等)进行体外抑菌试验，观察抑菌的情况，并和银花平感颗粒联合作用于耐药金黄色葡萄球菌观察抑菌效果。对中药以及中药联合抗生素的抑菌效果进行探讨，并分析中药和中药联合抗生素作用与金黄色葡萄球菌耐药基因表达之间的相关性，为临床用药提供借鉴。1 材料与试剂1.1 菌种来源120株菌株分离自浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院2019年8月至2019年12月住院患者的脑脊液、脓液、尿液等标本，经法国生物梅里埃公司的V

9、ITEK2鉴定系统鉴定为非重复金黄色葡萄球菌株。1.2 试剂及器材试剂：银花平感颗粒（金银花、虎杖、葛根、麻黄、苦杏仁、甘草），抗生素（万古霉素、替考拉宁、替加环素、利奈唑胺、泰巴坦、头孢他啶、头孢呋辛钠），无菌生理盐水等。 器材：移液枪、无菌枪头、锥形瓶、高速离心机（德国Thermo Micro 17R型）、漩涡震荡仪、酶标仪、电泳仪（购于美国伯乐公司，Mini Protean 3 Cell型）、高压灭菌锅、离心管（1.5 mL、15 mL 、50 mL）、50 mL量筒、LB培养基、1300系列二级A2型生物安全柜（赛默飞世尔仪器公司）、CO2培养箱（美国Thermofisher 3111

10、型）、麦氏比浊仪、血琼脂平板、酒精灯、细胞96孔培养板、ABI 7500实时荧光定量PCR仪等。2 实验方法2.1 细菌复苏每次取20株金黄色葡萄球菌株接种到血平板上，37、5% CO2 培养箱24 h。法国生物梅里埃公司的VITEK2鉴定系统鉴定为金黄色葡萄球菌，存放于4冰箱备用。2.2 药敏试剂制备配制肉汤培养基，高压灭菌后4冷藏备用。 含抗生素的培养液：将抗生素加在肉汤中配制成培养液，并倍比稀释成8个浓度于20ml离心管中备用，8种抗生素分别单独配置备用。 中药培养液：将银花平感颗粒熬制成80mg/ml的中药液，按1：20的比例用LB液体培养基配置4mg/ml 的20ml中药培养液备用。

11、按照倍比稀释将4mg/ml的中药液稀释成8个梯度的浓度于20ml离心管中备用。 中西药混合培养液：将不同浓度的银花平感颗粒和抗生素在LB液体培养基中按一定比例混合于20ml离心管中备用。2.3 细菌悬液的制备 取20支标准试管于试管架，编号，分别注入3ml生理盐水。 待最初数值调零后用棉签沾取少量细菌，在试管中轻轻震荡混匀，混匀后测定麦氏比，调整为0.5-0.7麦氏比，保证各试管麦氏比相近，其余试管按相同方法将对应菌株按要求配制成悬液。 细菌悬液按1：10倍比稀释至1000倍，4冷藏备用。2.4 药敏试验2.4.1 银花平感颗粒或抗生素单独作用的药敏结果准备四块96孔板，每两列做一组平行实验进

12、行编号，每组按孔分别加入200L含有不同浓度药物的LB液体培养基和5L对应编号的细菌悬液，轻轻吹打均匀，并需要设置空白组对照，37、5% CO2 培养箱中培养24h。用酶标仪在620nm吸光度下测定OD值，用折线图反映变化趋势，分析药物抑菌效果并记录。2.4.2 银花平感颗粒联合抗生素药敏结果A组先后作用：先将菌液加入到仅含银花平感颗粒的培养液中孵育24小时，再将银花平感颗粒作用过后的菌悬液用移液枪吸取5l加入到含抗生素的培养液中，其余步骤同银花平感颗粒单独作用的药敏试验，并在培养24h后测定OD值并绘制折线图，分析药物抑菌效果并记录。B组同时作用：将之前配制的细菌悬液加入到含银花平感颗粒和抗

13、生素混合的培养液中，每孔5l，相同条件下孵育24小时，并测定OD值，取均值绘制折线图，分析药物抑菌效果并记录。 定量PCR研究耐药分子表达2.4.3 DNA模板的制备取20支无菌1.5mL微量离心管，每管加入0.5mL无菌生理盐水，用无菌枪头在血琼脂平板上依次挑取合格菌株加入相应离心管中，混匀。10000rpm离心2min，弃上清；在每管中加入100L细菌裂解液，振荡10s； 95水浴10min，后12000rpm离心2min；吸取上清液至1.5mL微量离心管中-20保存备用。2.4.4 聚合酶链式反应（PCR） 引物设计与合成参照说明书提取核酸，参照表中引物进行mecA基因的PCR扩增 15

14、，引物交由上海生工生物公司合成。 表 1 引物信息基因引物序列53产物大小/bpmecAF:TGGCTCAGGTACTGCTATCC533R:CACCTTGTCCGTAACCTGAAPCR扩增 准备工作：根据试剂盒说明书，将反应液融化后震荡混匀，6000rpm离心10s备用。取一只无菌1.5ml无核酸酶离心管，并取2019l金黄色葡萄球菌反应液，201l作内部扩增对照，充分混匀后6000rpm离心10s。反应总体系为25l，扩增在ABI 2720 PCR仪器上进行，95 预变性5min；95 变性30s、53 退火30s，在退火阶段进行荧光信号的收集，并观察荧光曲线，Ct值小于35为阳性。2.

15、6 数据统计分析记录OD值绘制曲线，分析药物作用的效果，并用荧光定量PCR曲线对照，分析药物作用效果与基因表达的相关性。3 结果 因为疫情，无法提供数据，仅根据文献表述预期实验结果。中药药敏研究实验按实验步骤操作，将耐药金黄色葡萄球菌接种到含不同浓度银花平感颗粒的96孔板的对应孔内孵育24小时后取出，培养液部分变浑浊，提示仍有细菌产生。经酶标仪测量OD值后，取每组结果的均值进行比较，分析银花平感颗粒对该组实验菌株的抑菌效果（表2）。表2 中药药敏试验后各孔OD均值细菌编号银花平感颗粒浓度（mg/ml）4210.50.250.1250.06250.037512345678910111213141

16、5161718（对照）*注：17和18号所用菌株相同，具体数据未获得后续实验未顺利进行，参考文献得知银花平感颗粒按不同给药途径作用有一定的抗病毒效果，因此推测银花平感颗粒对金黄色葡萄球菌的生长抑制有作用，但还需继续进行后续实验证实。 西药药敏研究结果根据文献对临床用药情况的表述，实验中所有抗生素对实验菌株均存在不同程度的抑菌作用，但仍有部分菌株不受抗生素影响，表现出耐药性。故需要进一步联合银花平感颗粒试验比较药敏试验结果。 中药联合抗生素的药敏研究结果联系以上试验的预期结果，结合文献中对中药的药理作用的表述，推断将银花平感颗粒联合以上抗生素作用于耐药金黄色葡萄球菌，或将抗生素作用于经银花平感颗

17、粒抑菌后的金黄色葡萄球菌，均表现出一定的抑菌效果，说明银花平感颗粒联合抗生素抗耐药金黄色葡萄球菌能在一定程度上逆转耐药性（表3）。表3 抗生素/中药联合抗生素的药敏试验的MIC值抗生素MIC值单独作用与中药同时作用在中药之后作用万古霉素替考拉宁达托霉素替加环素利奈唑胺泰巴坦头孢他啶头孢呋辛钠* 荧光定量PCR耐药分子表达根据文献中对金黄色葡萄球菌mecA基因或其他耐药基因的研究，分析药敏试验前的耐药菌株和药敏试验后的敏感菌株之间mecA基因表达的差异。推测敏感菌株的mecA基因的表达量明显降低，且联合用药组抑制效果最明显，表示银花平感颗粒联合常用抗生素治疗金黄色葡萄球菌的感染有较好的抑菌效果，

18、能够协同影响mecA基因的表达。4 讨论因为疫情影响，本次实验未得到实验结果，通过查阅文献7, 8,16得知，万古霉素、替考拉宁、替加环素、利奈唑胺、泰巴坦、头孢呋辛钠和头孢他啶均有用作金黄色葡萄球菌感染的治疗，但均存在不良反应。众所周知中药因具有抗感染抗炎的特点，在临床的使用逐渐得到重视。本次实验中使用的银花平感颗粒能够解表清热，宣肺疏邪，有文献研究指出17，不同浓度的银花平感颗粒通过不同方式给药均有抗感染作用，故本试验推断银花平感颗粒对抑制金黄色葡萄球菌的生长也有一定效果，但单独作用不大。中药对金黄色葡萄球菌的抑菌作用主要表现在对金黄色葡萄球菌生物膜、青霉素结合蛋白和-内酰胺酶以及外排系统

19、等方面。 因此本研究认为，将银花平感颗粒分别和以上抗生素同时或先后作用于金黄色葡萄球菌，抑菌效果比单独使用银花平感颗粒或抗生素更明显。-内酰胺类抗生素和PBP2a的亲和力降低以及作用靶位的改变是MRSA最主要的耐药机制。本实验通过对耐药基因mecA进行荧光定量PCR的检测，预计药物作用能影响耐药基因mecA的表达，药物联合作用后的有抑菌效果的耐药菌比作用前表达的mecA基因更少，表明银花平感颗粒和抗生素联合作用有较好的抑菌效果，并且能够逆转抗生素耐药。综上所述，银花平感颗粒和-内酰胺类抗生素单独作用于耐药金黄色葡萄球菌时的抑菌效果比较轻微，而银花平感颗粒联合抗生素作用有较好的抑菌效果，能够有效的抑制金黄色葡萄球菌耐药基因mecA的表达，为临床治疗提供指导。