高中生物竞赛：分子生物学第一节 核酸的结构与功能课件.pptx

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1、,分子生物学,Molecular Biology,广义：在分子水平理解生命现象的学科。1. 生物化学：从化学角度解释生物分子（糖类、脂类、蛋白质、核酸及其他生物学分子）化学结构及其代谢途径的一门学科。从化学角度揭示生命现象的古老学科。2.分子生物学：是在生物化学和经典遗传学基础上发展起来的一门新兴学科。以核酸（DNA和RNA）为研究对象，揭示基因的结构（染色体结构）、维持（ DNA复制、修复）和信息传递（转录和翻译）。,核酸的结构与功能,第一节,孟德尔 摩尔根 艾弗里,Watson and Crick 多利羊 HGP,图1 肺炎双球菌的变体。 (a)大而亮的菌落光滑(S)且具毒性； (b)小而

2、有斑点的菌落粗糙(R)且无毒性。,(b),(a),图2 Griffith的转化实验。(a)有毒性的肺炎双球菌株S杀死了宿主(b)无毒性的菌株R不能成功感染宿主,所以小鼠存活(c)加热杀死的S菌株不能感染宿主(d)R菌株和加热杀死的S菌株的混合物杀死了小鼠。死的毒性菌(S)将无毒菌(R)转化成毒性菌(S)。,图2.3 T2噬菌体感染大肠杆菌细胞的透射电镜伪色照片。左上方噬菌体颗粒好像正准备将其DNA注入宿主细胞内。另一个T2噬菌体已经感染了细胞,并且子代噬菌体颗粒正在组装,已经可以看出子代噬菌体的头部在宿主细胞内呈黑色多角形,图2.2 Hershey-Chase实验。在第一部分(a) 中，他们用

3、硫35S(红色)标记噬菌体的蛋白质，DNA不标记(黑色)。在第二部分(b)中，他们用32P (红色) 标记噬菌体DNA，蛋白质不标记(黑色)。由于噬菌体基因必须进人细胞，实验者们通过对感染细胞中的标记类型进行推断进而揭示基因的特性。大部分标记的蛋白质留在外面，通过搅拌使得噬菌体的蛋白质脱离细胞(a)， 而大部分标记的DNA进入了感染的细胞中(b)。 结论是这种噬菌体的基因是DNA。,DNA是主要的遗传物质,表1 每摩尔磷酸中DNA的摩尔碱基组成,Chargaff对不同来源的DNA碱基组成研究发现，嘌呤的含量总是大体与嘧啶相等。,图5 Franklin的DNA X射线衍射图。图像的规则性图案表明

4、DNA是一个螺旋。在X射线图形顶端和底部的每条带纹间的距离给出了每个螺旋元件(碱基对)间的间距为3.32A。图像中相邻条带间的间隔给出了螺旋一个完整重复单元的距离(一个螺距的长度)为33.2A。,衍射图非常简单，它表明DNA结构本身也一定非常简单。DNA分子非常大，只有具备规则、重复的结构，它才可能有简单的X射线衍射照片，而对一条细长分子所能推测的最简单重复形状就是像瓶塞钻一样的螺旋结构或螺旋,一、核 酸(nucleic acid),是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。,核酸的分类及分布,存在于细胞核和线粒体,分布于细胞核、细胞质、线粒体,(deoxyribonuclei

5、c acid, DNA),(ribonucleic acid, RNA),脱氧核糖核酸,核糖核酸,核酸组成,DNA的组成单位是脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotide）RNA的组成单位是核糖核苷酸（ribonucleotide）。,嘧啶与核糖C-1通过-N-糖苷键相连形成核苷(ribonucleoside)。,核苷,N,N,N,N,9,N,H,2,O,O,H,O,H,H,H,H,C,H,2,O,H,H,1,2,糖苷键,核苷或脱氧核苷与磷酸通过酯键结合构成核苷酸(ribonucleotide)或脱氧核苷酸(deoxyribonucleotide)。,核苷酸(ribonucleoti

6、de),多磷酸核苷酸,环化核苷酸：cAMP、cGMP，是细胞信号转导中的第二信使。,cAMP,核苷酸衍生物,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，nicotinamide adenine dinucleotide, NAD+）,氧化体系的重要成分，在传递质子或电子的过程中具有重要的作用,构成DNA的碱基、核苷、核苷酸,构成RNA的碱基、核苷以及核苷酸,二、3,5-磷酸二酯键连接形成DNA或RNA,一个脱氧核苷酸3的羟基与另一个核苷酸5的-磷酸基团缩合形成磷酸二酯键(phosphodiester bond)。 多个脱氧核苷酸通过磷酸二酯键构成了具有方向性的线性分子，称为多聚脱氧核苷酸(polydeoxynucl

7、eotide)，即DNA链。,磷酸二酯键,RNA也是多个核苷酸分子通过3,5-磷酸二酯键连接形成的线性大分子，也具有53方向性; RNA的戊糖是核糖； RNA的嘧啶是胞嘧啶和尿嘧啶。构成RNA的四种基本核苷酸是AMP、GMP、CMP和UMP。,定义核酸中核苷酸的排列顺序。由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，所以也称为碱基序列。,三、核酸的一级结构是核苷酸的排列顺序,核酸的一级结构,5 pApCpTpGpCpT-OH 3,5 A C T G C T 3,A C T G C T,单链DNA和RNA分子的大小常用核苷酸数目（nucleotide，nt）表示；双链核酸分子的大小常用碱基(base或kil

8、obase)数目来表示。小的核酸片段(50bp)常被称为寡核苷酸(oligonucleotide)。自然界中的DNA和RNA的长度可以高达几十万个碱基。,四、DNA的二级结构是双螺旋结构,不同生物种属的DNA的碱基组成不同同一个体的不同器官或组织的DNA碱基组成相同 对于一特定组织的DNA，其碱基组分不随年龄、营养状态和环境而变化A = T，G = C,Chargaff 规则,（一）DNA双螺旋结构的实验基础,获得了高质量的DNA分子的X射线衍射照片。,提出了DNA分子双螺旋结构(double helix)模型。,两条多聚核苷酸链在空间的走向呈反向平行(anti-parallel)。两条链中一

9、条链的53方向是自上而下，而另一条链的53方向是自下而上。两条链围绕着同一个螺旋轴形成右手螺旋(right-handed)的结构。双螺旋结构的直径为2nm，螺距为3.32nm。,（二） DNA双螺旋结构模型要点,1.DNA由两条多聚脱氧核苷酸链组成,（二） DNA双螺旋结构模型要点,脱氧核糖和磷酸基团组成的亲水性骨架位于双螺旋结构的外侧，疏水的碱基位于内侧。双螺旋结构的表面形成了一个大沟(major groove)和一个小沟(minor groove)。,2. 核糖与磷酸位于外侧,碱基对之间的距离_,3.32 ,(0.332 nm),螺距（完整的螺旋重复单位）_，螺旋一周有_个碱基对。,33.

10、2 ,(3.32 nm),10,溶液中，DNA的结构与此类似，螺旋一周约含_个碱基对,10.4,碱基对之间的距离_,3.32 ,(0.332 nm),螺距（完整的螺旋重复单位）_，螺旋一周有_个碱基对。,33.2 ,(3.32 nm),10,溶液中，DNA的结构与此类似，螺旋一周约含_个碱基对,10.4,DNA双螺旋结构的俯视图,碱基对之间的距离_,3.32 ,(0.332 nm),螺距（完整的螺旋重复单位）_，螺旋一周有_个碱基对。,33.2 ,(3.32 nm),10,溶液中，DNA的结构与此类似，螺旋一周约含_个碱基对,10.4,3. DNA双链之间形成了互补碱基对,碱基配对关系称为互补

11、碱基对(complementary base pair)。DNA的两条链则互为互补链(complementary strand)。碱基对平面与螺旋轴垂直。,（二） DNA双螺旋结构模型要点,碱基互补配对: 鸟嘌呤/胞嘧啶,碱基互补配对: 腺嘌呤/胸腺嘧啶,大沟与小沟,相邻两个碱基对会有重叠，产生了疏水性的碱基堆积力(base stacking interaction)。碱基堆积力和互补碱基对的氢键共同维系着DNA结构的稳定。,4. 碱基对的疏水作用力和氢键共同维持着DNA双螺旋结构的稳定,（二） DNA双螺旋结构模型要点,（三）DNA双螺旋结构的多样性,B型DNA,沃森、克里克,湿度：92%,

12、A型DNA,湿度：75%,右手螺旋,右手螺旋,Z型DNA,左手螺旋,在细胞中， DNA可能以常见的B构型存在，其碱基对是水平的。小部分DNA可能呈现伸展的Z DNA的左手螺旋(至少在真核细胞中)。RNA-DNA杂合链在溶液中呈A型结构。,五、DNA的高级结构是超螺旋结构,当DNA双螺旋分子在溶液中以一定构象自由存在时，双螺旋处于能量最低的状态，此为松弛态。如果使这种正常的DNA分子额外地多转几圈或少转几圈，就会使双螺旋中存在张力。当双螺旋分子的末端是开放的，这种张力可以通过链的转动而释放出来，DNA将恢复正常的双螺旋状态。但如果DNA分子两端是固定的，或是环状分子，这种额外的张力就不能释放掉，

13、DNA分子本身就会发生扭曲，用以抵消张力。这种扭曲称为超螺旋，是双螺旋的螺旋。,五、DNA的高级结构是超螺旋结构,超螺旋结构(superhelix 或supercoil)DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。,正超螺旋(positive supercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方同相同。,给予DNA的扭曲张力使DNA缠绕得更紧，（使DNA越拧越紧）,正超螺旋 左旋（顺时针）,五、DNA的高级结构是超螺旋结构,超螺旋结构(superhelix 或supercoil)DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。,正超螺旋(positive supercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方同相同。,负超螺旋

14、(negative supercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方向相反。,给予DNA的扭曲张力有利于DNA解旋，（使DNA越拧越松）,负超螺旋 右旋（逆时针）,（一）环装DNA的超螺旋结构,细菌的染色体DNA，某些病毒的DNA，细菌质粒、真核生物的线粒体和叶绿体的DNA，为双链环状DNA。在生物体内，绝大多数双链环状DNA（dcDNA）可进一步扭曲成超螺旋DNA，这种结构还可被称为共价闭环DNA（cccDNA）。原核生物DNA多为环状的双螺旋分子 ，以负超螺旋的形式存在，平均每200碱基就有一个超螺旋形成。,（1）链环数（linking number） L 指在双螺旋DNA中，一条链以右手螺旋

15、绕另一条链缠绕的次数（2）扭转数（缠绕数：twisting number） T 扭转数是指DNA分子中Watson-Crick的螺旋数，双螺旋的圈数（3）超螺旋数（writhing number） W L=T+W 拓扑异构体:DNA分子具有相同的结构，但L值不同，拓扑异构酶能够催化它们之间的转换。,正超螺旋与负超螺旋,L=T+W,L为连环数，一条链绕另一条链的总数,T为扭转数，双螺旋的圈数,W为缠绕数，超螺旋的圈数,LT时，DNA互相缠绕不足，产生负超螺旋,LT时，DNA互相缠绕过度，产生正超螺旋,拓扑异构酶II可以将DNA的两条链切断，使其中的一段DNA跨越另一段DNA后再连接。在消耗ATP

16、的情况下，每作用一次可引入2个负超螺旋，若将负超螺旋解开，则双螺旋减少2周。在不消耗ATP的情况，该酶可消除负超螺旋。 拓扑异构酶I（TopI）可消除和减少负超螺旋，对正超螺旋不起作用，其作用过程不需要ATP提供能量。,（二）真核生物DNA以核小体为单位形成高度有序致密结构,真核生物DNA以非常有序的形式存在于细胞核内。在细胞周期的大部分时间里，DNA以松散的染色质(chromatin)形式存在，在细胞分裂期，则形成高度致密的染色体(chromosome)。,DNA染色质呈现出的串珠样结构。染色质的基本单位是核小体(nucleosome)。,DNA染色质的电镜图像,核小体串珠样的结构,DNA：

17、约200bp 组蛋白：H1 H2A，H2B H3 H4,核小体串珠样的结构,DNA：约200bp 组蛋白：H1 H2A，H2B H3 H4,双链DNA的折叠和组装,30nm纤丝,（螺线管模型）,DNA经过多次折叠，被压缩了800010000倍，组装在直径只有数微米的细胞核内。,真核生物的染色体,两个功能区：,端粒(telomeres):染色体末端膨大的粒状结构，由染色体末端DNA（端粒DNA）与DNA结合蛋白构成。与染色体结构的稳定性、完整性以及衰老和肿瘤的发生发展相关。着丝粒（centromere）:两个染色单体的连接位点，富含A、T序列。细胞分裂时，着丝粒可分开使染色体均等有序地进入子代细

18、胞。,六、RNA的结构与功能,核酸的理化性质,核酸在波长 260nm 处有强烈的吸收，是由碱基的共轭双键所决定的。这一特性常用作核酸的定性和定量分析。,一、核酸分子具有强烈的紫外吸收,碱基的紫外吸收光谱,增色效应(hyperchromic effect)：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。,DNA解链时的紫外吸收变化,解链或熔解的量可通过DNA溶液260 nm处的光吸收来检测。由于碱基的电子结构使核酸能吸收这个波长的光，当两条DNA链结合时，碱基的紧密堆积会淬灭一些吸收度。而当DNA链分离时，这种淬灭作用消失，吸光率升高30%40%，这种现象称为增色效应。曲线的急剧上升表明，温度达到Tm

19、之前两条链结合很紧，到达Tm之后则迅速分离。,DNA或RNA的定量A260 = 1.0 相当于 50g/ml 双链DNA(dsDNA)40g/ml 单链DNA (ssDNA or RNA)20g/ml 寡核苷酸确定样品中核酸的纯度 纯 DNA: A260/A280 = 1.8纯 RNA: A260/A280 = 2.0,紫外吸收的应用,二、DNA变性是双链解离为单链的过程,某些理化因素导致DNA双链互补碱基对之间的氢键发生断裂，DNA双链解离为单链的过程。,定义,部分变性DNA的电镜图像,溶解温度,使DNA链的一半完成变性时的温度，或叫Tm。,DNA的解链曲线,连续加热DNA的过程中以温度相对

20、于A260值作图，所得的曲线称为解链曲线。,解链过程中，紫外吸光度的变化达到最大变化值的一半时所对应的温度。,解链温度(melting temperature，Tm),G+C 含量越高，解链温度就越高。,三、变性的核酸可以复性或形成杂交双链,当变性条件缓慢地除去后，两条解离的互补链可重新配对，恢复原来的双螺旋结构，这一现象称为DNA复性(renaturation) 。,热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing) 。,不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件可以在不同的分子间形成杂化双链(h

21、eteroduplex)。这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。,研究DNA分子中某一种基因的位置。监定两种核酸分子间的序列相似性。检测靶基因在待检样品中存在与否。,核酸分子杂交的应用,四、核酸酶 Nuclease,依据底物不同分类DNA酶(deoxyribonuclease, DNase)：专一降解DNA。RNA酶 (ribonuclease, RNase)：专一降解RNA。依据对底物作用方式不同核酸内切酶：在DNA或RNA分子内部切断磷酸二酯键 。核酸外切酶：水解核酸分子链末端的磷酸二酯键。 有5

22、3或35核酸外切酶。,核酸酶是指所有可以水解核酸的酶。,5,5,3,3,外切位点,外切位点,内切位点,内切位点,核酸的代谢(Catabolism & anabolism of Nucleic Acids),主要内容: 核酸代谢 DNA 、RNA的生物合成 合成调控,NA除了其遗传功能外，还能降解为其组成单位-Nt，Nt能参加细胞内几乎所有的代谢过程。 1、ATP（GTP） 能量通用货币 2、UDPG 和CDP-二酯酰甘油 糖元合成和磷酸甘油酯合成的中间物 3、CDP胆胺和CDP胆碱 脑磷脂和卵磷脂合成的中间体,4、ATP是NAD，FMN，CoA等辅底物(Cosubstrate)的重要组份 5、

23、 cAMP, cGMP 代谢调节物 (第二信使) 6、 NTP是NA（DNA和RNA)的合成原料 7、能量负荷调节，由AMP, ATP, GTP参与,NA 、Nt 的降解 一、NA Nt NsPi 1、DNA 酶自身正常DNA不降解，仅降解外源DNA，修复及细胞自溶。 2、RNA降解速度mRNAtRNArRNA，原核mRNA几分钟即降解。,NA-E,二酯酶,单酯酶,Nt-E,3、体外常用核酸酶（Nucleases） 蛇毒磷酸二酯酶 35外切，3OH专一，5断裂 牛脾磷酸二酯酶 53外切，5OH专一，3断裂 4、限制性内切酶（Restriction enzyme） 指细菌或霉菌中能识别并水解双链

24、DNA的核酸内切 酶，将大分子核酸水解为小的核酸片断。,分类： Class I 能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近切割双链，但切割序列没有专一性。 Class II 识别位点（回文序列）严格专一，并在识别位点内将双链切断。 Class III 识别位点严格专一（不是回文序列），但切点不专一，往往不在识别位点内部。 用途：Class II应用最广泛，是分子生物学研究的重要Tool enzyme。,Class II Restriction enzyme对底物(DNA)具有特异识别位点（识别序列，通常具有48bp的回纹结构） Example：E.coR I (E-菌的属，co-菌的种，R-菌的株

25、，I-酶的编号)。 5GAATTC3 5G AATTC3 3CTTAAG5 3CTTAA G5 5GGCC3 5GG CC3 3CCGG5 3CC GG5,Hae III,+,E.coR I,+,cohesive end 粘性末端,blunt end 平端,二、Nt NS 单酯酶 特异性 3Nt E及5Nt E 非特异 3 5皆可切 三、 NS + H2O Pu (Py) + R（Ribose） （水解E，植、微中特异酶） NS + Pi Pu (Py) + R-1-P（P化酶，非特异）,来自食物的核蛋白 胃酸 蛋白质 核酸（DNA、RNA） 胰核酸酶（DNase,RNase） （磷酸二酯酶） 核苷酸 胰、肠核苷酸酶（磷酸单酯酶） Pi 核苷 碱基 核糖,人，猿、鸟、昆虫、爬虫 尿酸（Uric Acid） 人猿外哺乳类 尿囊素 硬骨鱼 尿囊酸 鱼类，两栖 尿素 乙醛酸 少数低等动物 NH3 CO2,Section 1、核苷酸的分解代谢,一、 嘌呤核苷酸的分解代谢,Gout(痛风),嘌呤代谢酶的缺陷；进食高嘌呤饮食、核酸分解增加及肾脏疾病Hyperuricemia(高尿酸血症)：尿酸盐结晶沉积于关节、软组织、软骨及肾，导致关节炎、尿路结石和肾脏疾病。Treat with allopurinol,（别嘌呤醇）,