高中生物竞赛：常用分子生物学技术的原理及应用课件.ppt

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1、常用分子生物学技术的原理及应用The popular technology in molecular biology: principle and application, PCR技术的原理：在体外要靠温度(90以上)打双链，而不是解旋酶，也是以DNA为模板，需要引物，需DNA聚合酶，需要dNTP为前体。PCR与体内(细胞内)DNA复制的最大差异是温度。检测核分裂指数：在细胞培养中，加入3H标记的dNTP前体物，被细胞摄取后，参与DNA复制，复制速度越快，参入的3H标记的dNTP越多，可用液闪计数仪检测放射性强度，据此判断。,DNA的复制给了我们一些启示,中心法则给了我们一些启示：,遗传信息由

2、DNA上的基因决定。一旦基因发生突变，将最终导致所翻译的蛋白质发生改变，从而导致生理功能改变，甚至出现疾病，如癌症、肥胖等。 mRNA更能准确简便地反映DNA上基因所携带的遗传信息。因此对基因序列的分析，常分析mRNA的序列即可。,基因的表达有组织特异性，且受许多因素的影响，使mRNA的表达增强、降低甚至关闭，从而影响机体正常生理功能，甚至出现疾病。因此常需要检测mRNA的表达的丰度(含量)，常用方法有Northernblot、RT-PCR。定量(Real time)PCR等。这里需要特别强调：在检测mRNA(或蛋白)表达时，一定要先弄清该基因在某种组织中是否有表达。,根据中心法则，可以RNA

3、为模板，在逆转录酶作用下形成cDNA，于是建立了RT-PCR的方法。 根据mRNA的3端有poly(A)的特点，在进行反转录时，就以poly(A)为模板设计了引物。并且纯化mRNA的方法，也是根据poly(A)的原理设计的。根据最后的翻译蛋白质去向的不同，建立不同的蛋白质提取方法，如在线粒体，在细胞核、在细胞浆、分泌到血液中。,Section 1 分子杂交与印迹技术Molecular hybridization & blotting technology,核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA

4、与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可在不同的分子之间形成杂化双链的这种现象。,一、分子杂交与印迹技术的原理,杂交的原理实质是核酸分子的变性与复性过程,8,9,原位杂交技术：直接用探针与菌落或组织细胞中的核酸杂交，未改变核酸所在的位置。点杂交：将核酸直接点在膜上，再与核酸杂交。探针：用放射性同位素或荧光标记的DNA或RNA片段。Southern印迹法：将电泳分离后的DNA片段从凝胶转移到硝酸纤维素膜上，再进行杂交。Northern印迹法：将电泳分离后的RNA吸印到纤维素膜上再进行分子杂交。,（一）印迹(blotting)技术,1. 具体步骤 Southe

5、rn E 1975年首次应用,Southern EM. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol，1975, 98(3):503-517.,原始文献出处：,1. 具体步骤 Southern E 1975年首次应用,琼脂糖分离的DNA片段 变性为单链 将一张NC膜放在胶上，上面放吸水纸巾 利用毛细作用使胶中的DNA片段转移到NC膜上，使之成为固相化分子。,载有DNA单链分子的NC膜可在杂交液与另一种DNA或RNA分子（探针）杂交，具有互补序列的R

6、NA或DNA结合到存在于NC膜的DNA分子上，经检测分析可显现出杂交分子的区带。,（一）印迹(blotting)技术,探针(probe)的概念,用来检测某一特定核苷酸序列或基因序列的DNA片段或RNA片段,探针的种类,寡核苷酸探针基因组DNA探针cDNA探针RNA探针,将探针与固定在NC膜上的DNA或RNA进行结合反应，探针的序列如与NC膜上的核酸序列相互补，就可结合到膜上的相应区带，经放射自显影或其他检测手段就可判断膜上是否有同源的核酸分子存在。,2. 应用,广泛用于DNA、RNA、蛋白质的检测,3. 发展,电转移印迹技术、真空吸引转移印迹等,二、印迹技术的类别及应用,（一）DNA印迹技术

7、(Southern blotting),（二）RNA印迹技术 (Northern blotting),（三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting),（一）Southern blotting,10SSC 转移缓冲液,Whatman滤纸,凝胶,Whatman滤纸,纸巾,玻璃板,重物,与探针同源杂交的基因DNA片段,基因组DNA,DNA酶切片段,NC或尼龙膜,NC膜或尼龙膜,基因组DNA的定性与定量分析。 如对在基因组中特异基因的定位及检测等。重组质粒和噬菌体的分析。,Southert blotting用途,放射自显影照片,（二）RNA印迹技术(Northern blotting),

8、相同点：,Alwine JC, et al. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes.Proc Natl Acad Sci USA, 1977, 74(12):5350-5354,原始文献出处,名称相对于Southern blotting,转移的是RNA转移前无需酶切转移效率较高变性方法,不同点,原理均为毛细作用。,Northern blotting 用途 检测某一组织或细胞中

9、已知的特异mRNA 的表达水平。 比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。,（二）RNA印迹技术(Northern blotting),Northern blotting结果,由于基因组测序的完成及基因芯片技术的成熟以上两种技术应用的越来越少,（三）蛋白质的印迹技术(免疫印迹),首先将混合蛋白质用PAGE按分子大小分开，再将蛋白质转移到NC膜上，蛋白质的位置可保持在胶中的原位上。,与DNA和RNA印迹相似之处,蛋白质的转移只有靠电转移。蛋白质的检测以抗体作探针。用碱性磷酸酶（ALP/AP）、辣根过氧化酶（HRP）标记第二抗体，底物显色来检测蛋白区带的信号，底物亦可与化学发光剂结合以提高敏感度。

10、或用同位素标记第二抗体，放射自显影法检测蛋白区带的信号。,与DNA和RNA印迹不同之处,Y,Y,SuperSignal 底物与二抗HRP,AP反应,显色或发光,5,SuperSignal,HRP,AP标记二抗与一抗蛋白复合物结合,4,2,漂洗和封闭,1,电泳分离，转膜，固定蛋白于膜上,3,一抗与蛋白结合 (小鼠单抗 或兔多抗),间接Western Blotting操作流程:,间接法：优点： 1.免疫特异性不受标记影响 2.信号放大,灵敏度高（多个二抗结合位点） 3.多种标记的二抗可供选择 4.可选择不同的Marker,（三）蛋白质的印迹技术(免疫印迹),Western blotting应用,检

11、测样品中的特异蛋白质的存在。 细胞中特异蛋白质的定量分析。 蛋白质分子的相互作用研究。,Section 2 PCR技术的原理与应用,（Polymerase Chain Reaction，PCR）,聚合酶链反应,The Nobel Prize in Chemistry 1993,for contributions to the developments of methods within DNA-based chemistry,Michael Smith,1944 -,1932 - 2000,La Jolla, CA, USA,Kary B. Mullis,University of Briti

12、sh Columbia Vancouver, Canada,for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method,for his fundamental contributions to the establishment of oligonucleotide-based, site-directed mutagenesis and its development for protein studies,PCR技术是1985年由美国科学家Kary B Mullis建立的体外扩增基因片段的方法，它具有特异、敏感、产率高、简

13、便、重复性好、易自动化等突出优点，是分子生物学技术中一项具有革命性的创举。,PCR方法被美国Science杂志评为1989年的十大科技成就之一，而Taq DNA聚合酶被评选为象征1989年的“年分子”(the molecule of year)。,5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,一、PCR技术的工作原理,模板DNA 特异性引物耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+,PCR体系基本组成成分,PCR反应循环,变性95C左右,延伸适温,退火Tm-5C,2. 利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得已知目的基因片段。,3. 利用简并引物从cDNA文

14、库或基因组文库中获得具有一定同源性的基因片段。(简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。PCR为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少简并性。简并度越低，产物特异性越强),4. 利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中随机克隆,1. 与反转录反应相结合，直接从组织和细胞的mRNA获得目的基因片段。,二、PCR技术的主要用途,（一）目的基因的克隆,（二）基因的体外突变（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA序列测定（五）基因突变分析,二、PCR技术的主要用途,三、几种重要的PCR衍生技术,（一）反转录PCR技术 (RT-PCR)（二）实

15、时PCR技术 (real time PCR)（三）反向PCR（inverse PCR）（四）不对称PCR（asymmetric PCR）（五）复合PCR（Multiplex PCR）（六）随机引物PCR ( arbitrary primer PCR),RT-PCR技术,AAnA,TTnT 5,5,mRNA,反转录酶,mRNA,cDNA,3,TTnT,AAnA,核糖核酸酶H,TTnT,3,DNA poly I,cDNA,核酸酶S1,双链cDNA,3,5,3,5,5,加热变性,加入特异性引物,DNA聚合酶,PCR,扩增出大量的产物,Section 3核 酸 序 列 分 析Nucleic acid

16、sequence analysis,核酸序列分析的基本原理,化学裂解法 (Maxam-Gillbert法)-略,DNA链的末端合成终止法 (Sanger法),(Sanger双脱氧链终止法),HO P O P O P O CH2,O,A, C, G or T,1,3 ,OH,5 ,双脱氧核苷三磷酸,脱去,一、DNA链末端合成终止法,Sanger 1958年和1980年两次获Nobel奖,The Nobel Prize in Chemistry 1980,for his fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids, with p

17、articular regard to recombinant-DNA,for their contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acids,Paul Berg,Walter Gilbert,Frederick Sanger,1/2 of the prize,1/4 of the prize,1/4 of the prize,Stanford University Stanford, CA, USA,Harvard University, Biological Laboratories C

18、ambridge, MA, USA,MRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge, United Kingdom,1926-,1932-,1918-,二、DNA自动测序,用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记4种ddNTP，然后进行Sanger测序反应，产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离。通过4种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出4种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。,目前所用自动测序技术的改进同位素标记到荧光标记，平板电泳到毛细管电泳,多色荧光标记毛细管电泳,

19、单色荧光标记平板电泳,同位素标记平板电泳,A,C,G,T,Section 4基因工程,49,第一节 分子克隆载体与宿主,分子克隆载体(vector)是一类可供外源DNA插入并携带重组DNA分子进入适当宿主细胞的DNA分子,50,质粒载体（ Plasmid vectors ）,质粒是一类存在于细菌细胞中能独立于染色体DNA而自主复制的共价,闭合,环状双链DNA分子 (1500 kb),pBR322,载体（ Lambda vector ）,噬菌体的基因组 48514 bp，线状双链DNA 线状分子两端具有12 n.t的5-端突起的可互补的粘性末端（cohensive end，cos），该末端称为c

20、os位点，可被编码的A蛋白所识别 当侵入宿主细胞后，线装DNA分子借助粘性末端连接成环状分子,52,DNA,cos位点,cos位点,53,Yeast Artificial Chromosome (YAC) 酵母人工染色体 Carry 12 Mb DNA 1Mb = 1,000,000 bp,克隆片段大小约1Mb,55,分子克隆载体的功能:,为外源基因提供进入受体细胞的转移能力为外源基因提供在受体细胞的复制或整合能力为外源基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力,56,至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中有效复制，稳定遗传至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞至

21、少应有一个限制酶识别位点，以供外源DNA插入具有较小的分子量和较高的拷贝数具有对受体细胞的可转移性，提高载体导入受体细胞的效率,57,标记基因的作用：指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞 指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子,58,标记基因的种类：抗性标记基因 营养标记基因 生化标记基因,59,60,常用的遗传标记基因,四环素抗性基因（Tcr）氨苄青霉素抗性基因（Apr）氯霉素抗性基因（Cmr）卡那霉素(Kanr)、 新霉素(Neor)、G418抗性基因(G418r),61,半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZ） 半乳糖苷酶基因编码1021个 氨基酸 其氨基末端称为链

22、，羧基末端称为链 链负责将链装配为四聚体 单独的链不具酶活性，只有在链的帮助下组装成4才具有酶活性-互补作用 为链编码的基因称之为lacZ(编码145 AAs),62,63,半乳糖苷酶基因的优点,酶催化X-Gal水解为蓝色产物，检测直观 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- -D-galactosideLacZ和链基因的分别表达可使载体小而容量的大 通常以 LacZ作为载体的遗传标记基因，而由 宿主细胞表达链,64,荧光素酶基因 荧光素酶或由萤火虫产生，可催化荧光素氧化，并产生荧光 或由发光细菌（Photobacterium fischeri）产生,65,绿色荧光蛋白基因（GFP） GFP是由水母产生的一种可发光的蛋白质,66,see movie,67,筛选重组子的示意图,