高中生物竞赛：DNA复制课件.pptx

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1、DNA复制 (DNA Replication),建议阅读：基因10中文版第14章 341 369第16章 418 - 445,第一节 基 本 概 念,1、DNA复制 亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分别以各单链 DNA分子为模板，聚合与自身碱基可以互补配对的游离的dNTP, 合成出两条与亲代DNA分子完全相同的子代DNA分子的过程。2、复制子（Replicon） 复制子是基因组中能够独立进行复制的单位。每个复制子都有控制复制开始的复制起点（origin）以及终止复制的终点（terminus）。任何起点和终点之间的序列都作为复制子的一部分参与复制。在一个细胞周期中，每个复制子只启动一次

2、。原核生物只有一个复制子，噬菌体、病毒的DNA也是单复制子。3、 复制体 （Replisome）复制叉处的许多酶和蛋白组成的复合体，协同动作合成DNA。,当蛋白质复合体结合于起始点并熔解开那里的DNA时，复制就起始了。接着，包括DNA聚合酶在内的复制体组件组装起来。复制体沿DNA移动，并合成两条新链。,第二节 复制概况,一、复制起点、方式和方向,1、复制起点（origin、ori或 o） 复制开始处DNA分子的特定位置，复制起点有一般特征： 由多个独特的短重复序列组成； 这些短重复序列被多亚基复制起始因子所识别并结合； 一般富含AT，利用双螺旋DNA解旋，产生单链DNA作为复制模板。,真核生物

3、（Eukaryote） : 多复制起点 ，即一个genome中有多个复制单位,原核生物（Prokaryote）：单复制起点，即整个染色体只有一个复制单位,复制叉（Replication fork）：染色体中参与复制的活性区域，即复制正在发生的位点。,2、复制方向（复制过程的顺序性）,复制眼（replication eye）：电子显微镜下观察正在复制的DNA，复制 的区域形如一只眼睛。,真核生物的多复制子 多个复制眼,（1）单双向复制取决于起点处有一个还是两个复制叉,单向复制,双向复制,2、复制方向（复制过程的顺序性）,（2） 复制的多模式,单起点、单方向（原核）,多起点、单方向（真核）,单起点

4、、双方向（原核）,多起点、双方向（真核）,2、复制方向（复制过程的顺序性）,3、复制方式,大多数以对称方式进行，即两条链同时复制也有一定时期内DNA只复制一条链的情况,（1） 从新起始（ denovo initiation ）或复制叉式(replication fork ) 比较形象的 复制双链环状DNA的复制眼可以形成一种结构，形状 像希腊字母 。,（2） 置换式 （Displacement form ）又称 D 环复制 两条链的合成高度不对称，一条链迅速合成出互补链，另一条则形成游离的单链环(D-环) 线粒体和叶绿体DNA的复制方式,3、复制方式,（3）共价延伸方式或滚环式复制（rolli

5、ng circle replication） 由于复制时产生的滚环结构形状象，又称复制 病毒、细菌因子,3、复制方式,二、DNA的半保留复制（Semi-Conservation Replication）,二、DNA的半保留复制（Semi-Conservation Replication）,1958 Meselson-stahl 设计的CsCl超离心试验证实了DNA复制的这一特性,概念： 复制过程中各以双螺旋DNA的其中一条链为模板合成其互补链，新生的互补链与母链构成子代DNA分子。,亲代DNA,子代,子代,新合成的链,实验的具体方法：, 细胞生长在15N 标记培养基中 转入正常N源培养基中 分

6、离各代DNA 分析各代DNA的浮力密度,CsCL密度梯度离心 浮力密度 N15DNA 1.742g/ml N15N14DNA 1.717g/ml N14DNA 1.710g/ml,三、DNA复制的半不连续性,复制叉,后随链 冈崎片段,连续合成,复制总方向,不连续合成,前导链,先导链（leading strand）：DNA复制时，与复制叉向前移动的方向一致，以35链为模板，按53方向连续合成的一条链,后随链（lagging strand）： DNA复制时，与复制叉向前移动的方向相反，以53链为模板，按5 3方向不连续合成的一条链,原核生物先导链的起始需要 RNA聚合酶的转录激活，通过RNApol

7、ymerse的转录过程而解开局部的双链，先导链的合成受利福平的抑制；而后随链的起始由引物酶合成引物，而引物酶不受利福平的抑制。,为了保证遗传的稳定，DNA的复制必须具有高保真性。DNA复制时的保真性主要与下列因素有关： 1遵守严格的碱基配对规律； 2DNA聚合酶在复制时对碱基的正确选择； 3对复制过程中出现的错误及时进行校正。,四、DNA复制具有高度保真性（忠实性）,第三节 DNA复制的酶学,一、原核的DNA聚合酶,所有原核生物和真核生物的DNA聚合酶都具有基本的DNA合成活性。DNA通过在3-羟基端加上核苷酸来延长DNA链，因此新链生长的方向是53。DNA合成前体是核苷三磷酸，在反应中它会失

8、去两个末端磷酸基团。,一、原核的DNA聚合酶,DNA聚合酶I(由polA基因编码)与损伤DNA的修复反应有关，其辅助功能是参与半保留复制；当复制过程被损伤DNA阻断时，DNA聚合酶是重新开始复制叉所必需的。DNA聚合酶和V参与允许复制从旁路通过某种类型的损伤，称为易错聚合酶( error-prone polymerase)。DNA聚合酶是一个多亚基蛋白质，它是一个负责从头合成新链DNA的复制聚合酶。,一、原核的DNA聚合酶 1、DNA聚合酶,大肠杆菌DNA聚合酶是第一个被鉴定的DNA聚合酶，它是由polA基因编码的103 kDa的单链多肽。 当底物和模板存在时， DNA聚合酶可使脱氧核糖核苷酸

9、依次加到具有3-OH末端的多核苷酸链上。它的催化需含3-OH的RNA或DNA为引物，催化引物3 -OH亲核攻击4种 dNTP的-P及催化PPi水解。,一、原核的DNA聚合酶 1、DNA聚合酶,DNA聚合酶I，是一个103kDa的单一肽链，可以被蛋白酶切成两个区段。较大切割片段(68kDa)称为 Klenow片段，可用于体外的DNA合成反应，具有DNA聚合酶活性和35外切核酸酶校正活性。这两个活性位点的距离是30，说明碱基添加功能和碱基切除功能在空间上是分开的。,一、原核的DNA聚合酶 1、DNA聚合酶,小片段(35kDa)具有5 3外切核酸酶活性，可以切除少量的核苷酸，一次最多可切割10碱基，

10、此活性与合成/校正活性互相协调，使DNA聚合酶I在体外具有从切口处起始复制的独特能力(其他DNA聚合酶均无此能力)。在双链DNA磷酸二酯键的断裂处，此酶能从3-羟基端延伸出来。随着DNA新片段的合成，它可置换双链体中已有的同源链，而置换出来的链被这个酶的5 3外切核酸酶活性所降解。,一、原核的DNA聚合酶 1、DNA聚合酶,DNA聚合酶是一个多功能酶，它可以催化以下的反应： 1、DNA链沿5 3方向的延长（DNA聚合酶活性） 2、从3端水解DNA链，即3 5外切核酸酶活性 双重校对：配对一重；错配后3 5 外切为另一重校对。 正常情况突变率为10-710-8 ，衰老细胞则明显增加 3、从5端水

11、解DNA链，即5 3 外切核酸酶活性（特有），切引物和修复,一、原核的DNA聚合酶 2、DNA聚合酶,DNA聚合酶是一条分子量为120,000的多肽链。这个酶的活性很低，只有DNA聚合酶的5。 DNA聚合酶也以4种脱氧核糖核苷酸为底物，从5-3方向合成DNA。 DNA聚合酶具有3-5外切核酸酶活性，活力低。但无5-3外切酶活性。 DNA聚合酶主修复，当复制被损伤DNA阻断，酶2是重新开始复制叉必需的。,一、原核的DNA聚合酶 3、DNA聚合酶,DNA聚合酶是真正负责大肠杆菌细胞内合成DNA的复制酶。 DNA聚合酶是多亚基组成的蛋白质。 DNA聚合酶全酶由、和，共10种不同的亚基组成。 DNA聚

12、合酶至少含有3种重要的酶活性。 即53 DNA 聚合酶活性、35 外切核酸酶活性和依赖DNA的ATP酶活性。 DNA聚合酶不具有5 3外切核酸酶活性。 DNA聚合酶全酶在细胞中的含量很少，在每个细胞中只有1020个拷贝的全酶（holoenzyme）。,一、原核的DNA聚合酶 3、DNA聚合酶,DNA聚合酶含有以下4个不同的功能组分：1）核心聚合酶（core polymerase） 核心聚合酶由、三种亚基组成。 亚基具有5-3方向合成DNA的催化活性。 亚基具有3 -5外切核酸酶的校对功能，控制复制的忠实性。 亚基与亚基形成一个紧密的1：1复合物，协同发挥作用。 亚基促进亚基的作用。,一、原核的

13、DNA聚合酶 3、DNA聚合酶,DNA聚合酶含有以下4个不同的功能组分：2）二聚体 亚基是以二聚体的形式存在的。 二聚体是环状的，环绕着DNA并在DNA上自由滑动，构成一个滑动钳。 滑动钳可以把全酶束缚在模板DNA上，从而保证高度的进行性。钳的存在对于大肠杆菌的高效复制是十分必要的。,一、原核的DNA聚合酶 3、DNA聚合酶,DNA聚合酶含有以下4个不同的功能组分：3）复合物 复合物含有5种不同的亚基，复合物是滑动钳的载体，二聚体自己并不能组装到DNA上，它是通过复合物与ATP协同作用催化ATP的水解而组装到DNA上的，它可以帮助滑动钳结合到DNA上，也可从DNA上卸载滑动钳。 复合物有依赖D

14、NA的ATP酶活性。,一、原核的DNA聚合酶 3、DNA聚合酶,DNA聚合酶含有以下4个不同的功能组分：4）二聚体 连接蛋白（2）可结合两个核心酶分子和一个复合物。 亚基是一个依赖于DNA的ATP酶， 二聚体可结合两个核心酶，每个亚基结合一个核心酶。 在一个分子结构中存在两个聚合酶表明复制性的聚合酶成对起作用，协同复制双螺旋DNA的两条链。,二、 DNA连接酶（DNA Ligase）,DNA聚合酶只能催化多核苷酸链的延长反应，不能使链与链之间连接。 DNA连接酶能催化双链DNA切口处的5-磷酸基和3-羟基生成磷酸二酯键。,DNA聚合酶的5 3外切核酸酶活性使RNA引物移除，同时用一段DNA序列

15、来替代它，这段DNA延伸自下一个冈崎片段的3-羟基端。这个过程和切口平移过程是等同的，除了是用新合成的DNA代替旧的RNA而不是替代DNA这一差别之外。,一旦RNA被移除，邻近的冈崎片段需要连接起来，此时，一个冈崎片段的3-羟基端与前一个片段的5磷酸端相邻。DNA连接酶利用携带AMP的复合体负责将缺口封闭。,三、 解螺旋酶 （helicase）:又称解旋酶,是使DNA 两条链分开的酶，解旋酶具有依赖DNA的ATPase活性，可把ATP水解产生的自由能转化为解旋DNA并使解旋酶本身沿DNA链移动的机械能。每解开一个碱基对需要水解1分子ATP,四、单链结合蛋白,单链结合蛋白( single-str

16、and binding protein，SSB蛋白)与单链DNA结合，阻止其再形成双链体状态。SSB蛋白的结合方式通常具有协同性，即SSB蛋白与单链DNA结合后的复合体会增强另一个单体的结合能力。大肠杆菌的SSB蛋白是一个四聚体；而真核生物的SSB蛋白(也称为RPA)是一个三聚体。单链结合蛋白可以加强单链DNA对DNA聚合酶的亲和力，DNA聚合酶前进时，会置换出结合在单链上SSB蛋白。,五、DNA拓扑异构酶,复制过程中，DNA双螺旋的解旋使复制叉前面产生正超螺旋，将妨碍复制叉的前进。DNA拓扑异构酶则可以使超螺旋分子松弛。 拓朴异构酶(Topo )，其作用是使双链DNA中的一股切断，使链的末端

17、沿着螺旋轴按双螺旋反方向旋转，超螺旋消除后再将切口封闭，使DNA变为松弛状态。即松弛或消除负超螺旋,催化反应不需ATP。 拓朴异构酶(Topo )：又称DNA旋转酶。广泛存在于各种生物中。作用是在水解ATP的同时能迅速使DNA链断开又接上，而使松弛态的DNA转变为超螺旋状态，引入负超螺旋；在没有ATP时，它又可使负超螺旋DNA变为松弛态。,II型DNA拓扑异构酶的作用机制,DNA聚合酶的一个共同特征是不能从头合成一条DNA链，而只能延伸链。所有DNA聚合酶都需要3-OH引发末端起始DNA合成。引发末端可以由RNA引物、DNA切口或引发蛋白提供。就DNA复制而言，引发酶(一种特殊的RNA聚合酶)

18、合成RNA链，它提供引发末端。,六、引物（Primer）和引物酶（Primase）,前导链只需要一次这种起始事件，它发生在复制起始点；但后随链必须有一系列的起始事件，因为每个冈崎片段都需要自己从头起始。每个冈崎片段从它的引物开始，这个引物是一段RNA序列，约10碱基长，,六、引物（Primer）和引物酶（Primase）,七、真核的DNA聚合酶,三种不同的DNA聚合酶组成了真核生物复制叉。一个复制叉含有一个DNA聚合酶/引发酶复合体、一个DNA聚合酶复合体和一个DNA聚合酶复合体。DNA聚合酶 /引发酶复合体起始DNA两条链的合成。DNA聚合酶延伸前导链；第二个DNA聚合酶延伸后随链。MCM解

19、旋酶(DnaB蛋白在真核生物的同源物)解开双链DNA。,七、真核的DNA聚合酶,真核生物细胞拥有大量的DNA聚合酶，可大致将它们分为两类：复制所需的酶和修复损伤DNA所需的酶。在细胞核中发生的DNA复制需要DNA聚合酶、和。,七、真核的DNA聚合酶,DNA聚合酶比较特殊，因为它能起始新链的合成，即能起始前导链和后随链的合成。DNA聚合酶为多亚基酶，其中一个亚基具有引物合成酶活性，最大的亚基具有聚合酶活性，无外切酶活性的亚基。现在认为它的功能只是合成引物，但它在合成一小段RNA链后还可聚合45个寡聚脱氧核糖核苷酸。,七、真核的DNA聚合酶,DNA聚合酶既有持续合成DNA链的能力，又有校正功能，由

20、它完成DNA复制。推测在复制叉上有一个DNA聚合酶 ，以合成引物；两个DNA聚合酶，分别合成前导链和滞后链。之前PPT，不同地方解释有差异,七、真核的DNA聚合酶,DNA聚合酶是一个具有高度持续合成能力的酶，可以持续地合成前导链。,DNA聚合酶可能相当于细菌的DNA聚合酶I，它是一种修复酶，参与DNA的修补合成，并存在于复制叉用以取代滞后链冈崎片段的引物。RNA引物被 RNase H11和MF-1核酸酶水解，然后由DNA聚合酶填补缺口，DNA连接酶将冈崎片段相连接。 之前PPT，不同地方解释有差异,七、真核的DNA聚合酶,有与修复有关的酶中，DNA聚合酶拥有中等的保真度。其他酶都存在高得多的差

21、错率。所有线粒体中的复制和重组由DNA聚合酶来执行。,第四节 原核生物DNA复制 (DNA replication in Prokaryote),一、DNA复制的起始：在oriC形成复制叉,大肠杆菌的复制起点称为oriC，由245个bp构成，其序列和控制元件在细菌复制起点中十分保守。关键序列在于两组短的重复：三个13bp的序列和四个9bp序列,DnaA蛋白结合复制起点上四个9bp重复序列，大约2040个。DnaA蛋白是一种ATP结合蛋白，DnaA-ATP蛋白复合体结合到被完全甲基化的oriC位点，形成起始复合物( initial complex).,a、起始过程涉及主要酶系： DnaA（复制起

22、始）、RNApol是必不可少的，此外涉及到 DnaB（解旋酶）、 DnaC（引发体组分）、拓扑异构酶、SSB和引物酶,b、简单步骤： * DnaA 识别并结合复制起点，DnaB六聚体在DnaC帮助下结合解链区， DnaB借助水解ATP产生的能量，沿53的方向移动，解开DNA双链，形成前引发复合体。 * 旋转（促旋）酶（拓扑异构酶）和单链结合蛋白（SSB）结合，前者消除解螺旋产生的拓扑张力，后者保护单链防止恢复双链。 * 引物合成酶合成RNA引物，可以开始DNA的复制,二、延伸过程,进入的标志：DNApol 把第一个核苷酸加到引物的3-OH端,复制延伸阶段同时进行前导链和后随链的合成，这两条链合

23、成的基本反应相同，并且都是由DNA聚合酶所催化。但两条链的合成也有显著差别，前者持续合成，后者分段合成，因此参与的蛋白质因子也有不同。亲代DNA首先必须由DNA解螺旋酶将双链解开，其产生的拓扑张力由拓扑异构酶释放。分开的链被单链结合蛋白所稳定。自此之后，前导链与滞后链的合成便有所不同。,x174 phage负链合成,SSB,引发酶,引物,引发体,三、复制终止,细菌环状染色体的两个复制叉向前推移，最后在终止区( terminus regon)相遇并停止复制，该区含有多个约22bp的终止子( terminator)位点。大肠杆菌有6个终止子位点，分别称为terA-terF。与ter位点结合的蛋白质

24、称为Tus( terminus utilization substance)。Tus-ter复合物只能够阻止一个方向的复制叉前移，即不让对侧复制叉超过中点后过量复制。在正常情况下，两个复制叉前移的速度是相等的，到达终止区后就都停止复制。,第五节 真核生物DNA的复制特点(DNA replication in Eukaryote),1、 关于复制起点 真核生物DNA的复制速度比原核生物慢，基因组比原核生物大，然而真核生物染色体DNA上有许多复制起点，它们可以分段进行复制。例如，细菌DNA复制叉的移动速度为50000bp/min，哺乳类动物复制叉移动速度实际仅10003000bp/min，相差约2

25、050倍，然而哺乳类动物的复制子大小只有细菌的几十分之，所以从每个复制单位而言，复制所需时间在同一数量级。 真核生物与原核生物染色体DNA的复制还有一个明显的区别是：真核生物染色体在全部复制完成之前起点不再从新开始复制；而在快速生长的原核生物中，起点可以连续发动复制。,2、 关于冈崎片段的连接,在哺乳动物细胞系统中(DNA聚合酶没有5 3外切核酸酶活性)，冈崎片段是分两步连接起来的。首先，冈崎片段的合成将前面的RNA引物片段以“副翼(fap)”的形式置换出来。如图显示。副翼的碱基由副翼内切核酸酶1( flap endonuclease1，FENl蛋白)切割去除。FEN1蛋白以内切核酸酶发挥活性

26、，但它也具有外切核酸酶活性。物质。,3、真核生物染色体 DNA末端补齐模式,原核生物染色体是环状的，其5最末端RNA引物被除去后的空缺，可借助另一半圈DNA链向前延伸来填补。 真核生物不能像原核生物那样填补5末端空缺。而是通过形成端粒结构来解决。,端粒(telomeres)是染色体末端的结构，它是由许多富含鸟嘌呤核苷酸的特殊的重复顺序DNA及相关蛋白质组成的复合体。 端粒酶（telomerase）是催化端粒合成的酶。端粒酶是由蛋白质及RNA组成的，它具有逆转录酶的活性，能与自身携带的RNA为模板，逆转录合成端粒DNA 。,端粒酶(telomerase)的作用机制尺蠖模型 (爬行模型),通过TG

27、链的回折形成发夹结构（GG氢键）实现端粒酶位置的调整,3末端回折，复制子链,4、 真核生物复制过程中的核小体结构,（1） 组蛋白的合成在细胞核中与DNA复制同步进行 （2） 且组蛋白八聚体在DNA复制时并不离开亲本DNA链 （3） 组蛋白八聚体以全保留方式传给子代 （4） 组蛋白八聚体与先导链结合,第六节 在RNA指导下的RNA和DNA的合成,RNA的复制,以RNA为模板合成RNA ，是病毒RNA的特殊繁殖方式。有实验指出，当病毒RNA侵入寄主细胞后，这些病毒在RNA复制酶催化下即可自行复制产生新的病毒RNA。复制酶不存在于正常大肠杆菌细胞中，只有受感染时，寄主细胞才产生复制酶。,RNA复制酶

28、需要专一性的RNA模板，例如Q噬菌体的RNA复制酶只能用Q病毒RNA为模板，它不用寄主的RNA为模板。,RNA的逆转录,（1）什么是逆转录？ 以RNA为模板，按RNA中的核苷酸顺序合成DNA，这与通常转录过程中遗传信息流从DNA到RNA的方向相反，故称为逆转录。如劳氏病毒则以RNA为模板反转录为DNA，然后再从DNA转录为RNA。,（2）逆转录酶：即 “RNA指导的DNA聚合酶”,1970年从致癌RNA病毒中发现逆转录酶，有力地证明了“前病毒学说”，这类病毒感染并不引起细胞死亡，而使细胞发生恶性转化。,RNA的逆转录,（3）逆转录酶的性质以RNA作模板，在其上合成一条互补的DNA链，形成RNA-DNA杂种分子（ RNA指导的DNA聚合酶活力）。在新合成的DNA链上合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子（ DNA指导的DNA聚合酶活力）。核酸外切酶的作用，切除杂种分子中的RNA部分。,（4）逆转录的生物学意义：有助于人们对RNA病毒致癌机制的了解，防止逆转录病毒的致癌作用。,