余甘子不同提取物对人消化道菌群抑菌作用的对比研究_罗兰.docx

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1、Chin J Mod Appl Pharm, 2014 September, Vol.31 No.9 1045 中国现 代 应用 药 学 2014 年 9 月 第 31 卷第 9 期 6 SHEN S W, CAO H T, TIAN X F, et al. Experimental studies on effect of Weichang Shutai granule on promoting intestinal propulsion of mice, gastric juice content of rats and intestinal motion of rabbits J. Ch

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3、 Med(中 医学报 ), 2011, 26(6): 761-762. 收稿日期： 2014-02-21 余甘子不同提取物对人消化道菌群抑菌作用的对比研究 罗兰 1，刘佳佳 2，朱宏阳 1，饶雪娥 1，林坤鑫 1，余阿妹 1(1.福建卫生职业技术学院药学系，福州 350101； 2.中南大学化 学化工学院，长沙 410083) 摘要：目的 通过余甘子醇提物和盐提物对消化道代表菌种大肠杆菌的抑菌试验，确定余甘子对消化道菌群的最佳抑制 提取物，并确定最佳抑菌部位，从而进行该部位对消化道菌群的抑制作用研究。 方法 采用管碟法用余甘子醇提物和盐 水浸提物对消化道代表菌种大肠杆菌进行抑菌试验，测量抑菌圈

4、直径及菌落生长状况来确定最佳抑菌提取物及最佳抑菌 部位。 采用宏量肉汤稀释法 ( 试管法 )进行该部位对消化道菌群的抑菌试验， 测定最低抑菌浓度 (minimal inhibitory concentration， MIC)值。 结果 抑菌试验显示余甘子醇提物和盐提物均有抑菌作用，且盐提物抑菌作用较强，其最佳的 抑菌部位为乙酸乙酯部位。余甘子醇提物和盐提物乙酸乙酯部位对各菌群的 MIC 值表明，对消化道常见菌群均有抑菌效 果，且对厌氧菌的抑菌效果比需氧菌更好。 结论 余甘子盐提物的抑菌效果优于醇提物，乙酸乙酯部位对消化道菌群有 较强抑菌作用。 关键词： 余甘子；消化道菌群；提取物；乙酸乙酯部位

5、；抑菌作用；最低抑菌浓度 中图分类号： R285.6 文献标志码： A 文章编号： 1007-7693(2014)09-1045-04 DOI: 10.13748/ki.issn1007-7693.2014.09.003 Bacteriostastic Comparison of Different Extracts of the Fruit of Phyllanthus Emblica L. on the Microflora of the Digestive Tract LUO Lan1, LIU Jiajia2, ZHU Hongyang1, RAO Xuee1, LIN Kunxin1

6、, YU Amei1(1.Medicine Department, Fujian Health College, Fuzhou 350101, China; 2.College of Chemistry and Chemical Engineering, Central South University, Changsha 410083, China) ABSTRACT: OBJECTIVE To investigate the bacteriostatic action of ethanol extracts and salt extracts of the fruit of Phyllan

7、thus emblica L. on the microflora of the digestive tract, and determine its best antimicrobial part, so as to carry out its bacteriostatic effect. METHODS The bacteriositatic action of ethanol extracts and salt extracts of the fruit of Phyllanthus emblica L. was determined by cup plate method, and t

8、heir MICs were measured by doubling dilution method. The bacteriostatic test of the active part to the microflora on the digestive tract was determined by macro broth dilution method. And their MICs were measured. RESULTS The test by comparing the inhibition zone diameter and colony growth condition

9、s indicated alcohol extracts and salt extracts of Phyllanthus emblica L. had strong inhibitory effect, the best site for the antibacterial was ethyl acetate portion. The salt extracts had the better bacteriostatic action. The MICs showed not only ethanol extracts but also salt extracts had inhibitor

10、y effect, and had better effect on the anaerobe. CONCLUSION Antibacterial effect of salt extracts was better than the alcohol extract, and ethyl acetate portion had better inhibitory action on gastrointestinal microflora. KEY WORDS: Phyllanthus emblica L.; gastrointestinal flora; extract; ethyl acet

11、ate portion; inhibition; minimal inhibitory concentration 余甘子 (Phyllanthi Fructus)是大戟科 (Euphorbiaceae) 叶下 珠属 (Phyllanthus) 植物 余甘 子 (Phyllanthus emblica L.)的成熟果实。余甘子味甘、酸、涩，性 凉，具有清热凉血，消食健胃，生津止渴的功效， 基金项目： 福建卫生职业技术学院生物医药工程中心开放基金项目 (2014-KFJJ-PT-3) 作者简介： 罗兰，女，硕士，讲师 Tel: 18960868933 E-mail: 1046 Chin J M

12、od Appl Pharm, 2014 September, Vol.31 No.9 中国 现 代 应 用药学 2014 年 9 月第 31 卷 第 9 期 可用于治疗血热血瘀、消化不良、腹胀、咳嗽、喉 痛、口干等 1。余甘子是一味卫生部颁布的药食兼 用的重要传统民族药物，自 1977 年起的历版中国 药典中均有收载。全世界约有 17 个国家在传统药物 中使用余甘子，而我国约有 16 个民族使用该药 2。 近年来，关于余甘子抗菌、抗炎作用已有报 道，现代药理研究证实 3-6，余甘子具有广泛的抗 菌能力，对常见的枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球 菌以及沙门氏菌有很好的抑制作用，对革兰氏阳 性菌的抑制活

13、性大于革兰氏阴性菌。福建盛产余 甘子，常见于酒泡和盐腌治疗腹泻和健胃消食。 本研究对福建常见余甘子处理方法所得提取物采 用管碟 法 7和宏量肉汤稀释法 8，比较盐提物和醇 提物对消化道菌群的抑菌作用。 1 材料 余甘子采购于福建省惠安县紫山镇，由福建 卫生职业技术学院中药教研室朱扶蓉副教授鉴定 为大戟科余甘子 Phyllanthus emblica L.的果实。 SPX-280 型生化培养箱 (宁波市科技园区新江 南仪器有限公司 )； TS-100C 型恒温摇床 (上海天呈 试验仪器制造有限公司 )； SW-CJ-2FD 型洁净工作 台 ( 苏净 集团 苏州 安泰空 气技 术有限 公司 ) ；

14、 FD-1C-50 型冷冻干燥机 (北京博医康实验仪器有 限公司 )； SY-2002 型电子天平 (上海良平仪器仪表 有限公司 )； DW-86L388 型超低温保存箱 (青岛海 尔特种电器有限公司 )； RE-52A 型旋转蒸发器 (巩 义市予华仪器有限责任公司 )。 细菌琼脂粉 (北京陆桥技术有限公司，批号： 20110303)；牛肉浸膏 (北京陆桥技术有限公司，批 号： 20100903)；营养肉汤 (杭州天和微生物试剂有 限公司，批号： 121227)；维生素 K1(成都格雷西 亚化学技术有限公司，批号： 20130223， CAS 号： 84-80-0)；氯化血红素 (成都格雷西亚

15、化学技术有限 公司，批号： 20130307， CAS 号： 16009-13-5)； 布氏肉 汤 ( 北京陆 桥商检新技 术公司，批 号： 011210)； MH 肉汤 (杭州天和微生物试剂有限公司， 批号： 121122)； MGC AnaeroPack 系列厌氧产气袋 (日本三菱瓦斯化学株式会社，批号： 2297LJ-4)， 其他试剂均为分析纯。 大肠杆菌 (ATCC 25922)、奇异变形杆菌 (ATCC 35659)、金黄色葡萄球菌 (ATCC 25923)、表皮葡萄 球菌 (ATCC 12228)、肠道沙门氏菌 (ATCC 14028)、 白色念珠菌 (ATCC 90029)、枯草

16、芽孢杆菌 (ATCC 6538)、肺炎链球菌 (ATCC 49619)、产气荚膜杆菌 (ATCC 13124)、破伤风杆菌 (ATCC 19404)由福建卫 生职业技术学院医学技术系微生物教研室提供。 2方法与结果 2.1 提取物的制备 2.1.1 余甘子醇提物的制备 取新鲜余甘子，用 蒸馏水洗净晾干，用 80%乙醇常温浸提 30 d，过 滤。取适量减压回收溶剂得流浸膏，将其溶解分 散于蒸馏水中，冻干成粉末，保存于 4 冰箱中， 临用前用蒸馏水配制成所需浓度。 2.1.2 余甘子盐提物的制备 取新鲜余甘子，用 蒸馏水洗净晾干，用 80%氯化钠水溶液常温浸提 30 d，过滤。取适量减压回收溶剂得

17、流浸膏，将其 溶解分散于蒸馏水中，冻干成粉末，保存于 4 冰 箱中，临用前用蒸馏水配制成所需浓度。 2.1.3 不同极性萃取物的制备 取适量余甘子醇 提物和盐提物，分别用石油醚、三氯甲烷、乙酸 乙酯和正丁醇各萃取 3 次，分别得石油醚部、三 氯甲烷部、乙酸乙酯部和正丁醇部和水余部，将 5 个部位的提取物减压回收溶剂得流浸膏，冻干成 粉末，保存于 4 冰箱中，临用前配制成所需浓度。 2.2 余甘子醇提物和盐提物不同部位对大肠杆菌 的抑菌作用 取大肠杆菌接种于 MH 琼脂平板， 35 培养 过夜，用 MH 液体培养基制作菌悬液，并稀释至 102，取适量与 MH 琼脂培养基混匀制作双层 MH 琼脂平

18、板 (管碟法 )。将余甘子醇提物及盐提物的石 油醚部、乙酸乙酯部、三氯甲烷部、正丁醇部、 水余部的干粉配制成一定浓度，灭菌，备用。将 平板均分为 4 个区域，在每块区域的培养基表面 放置牛津杯，每区域 1 只，在对角区域的牛津杯 内分别加入相同浓度的不同部位的余甘子提取溶 液，相邻区域分别加入不同浓度的不同部位的余 甘子溶液，每个浓度设定 3 个平行组，空白对照 组为无菌水，阳性对照组为 0.02 mgmL1 庆大霉 素溶液。每只牛津杯加入不同部位的余甘子醇提 物和盐提物 (10， 5， 2， 1， 0.5 mgmL1)溶液 100 L， 空白对照组加入 100 L 无菌水。置 35 恒温培养

19、 20 h 后观察，通过比较抑菌圈大小来显示不同部 位的余甘子醇提物和盐提物的抑菌作用。结果显 示，与庆大霉素对大肠杆菌产生极敏效果做比较， 余甘子醇提物和盐提物 5 个部位均对大肠杆菌具 有抑制作用，随浓度降低，抑菌作用明显降低， Chin J Mod Appl Pharm, 2014 September, Vol.31 No.9 1047 中国现 代 应用 药 学 2014 年 9 月 第 31 卷第 9 期 乙酸乙酯部的抑菌效果最佳，石油醚次之。由此 可知，乙酸乙酯部是余甘子醇提物和盐提物中最 佳抑菌部位，且盐提物的抑菌效果明显高于醇提 物。结果见表 1。 表 1 余甘子不同部位提取物对

20、大肠杆菌的抑菌作用 (n=3) Tab. 1 Bacteriostatic action of different extracts of the fruit of Phyllanthus emblica L.(n=3) 抑菌环直径 /cm 浓度 / 2.3 余甘子醇提物和盐提物乙酸乙酯部位对消化 道各菌种 的抑菌作用 和最低抑菌 浓度 (minimal inhibitory concentration， MIC) 2.3.1 对消化道各需氧菌种的抑菌作用和 MIC 取大肠杆菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮 葡萄球菌、沙门氏菌、白色念珠菌、枯草芽孢杆 菌、肺炎链球菌接种于 MH 琼脂平板上，

21、 35 培 养过夜，用无菌生理盐水制作菌悬液，并调整菌 液浓度至 0.5 麦氏比浊相当。将余甘子醇提物及盐 提物乙酸乙酯部干粉配制成一定浓度，灭菌，保 存于 60 以下。按宏量肉汤稀释法进行操作，混 匀后，置于 35 恒温培养 1824 h 后，得 MIC。 余甘子醇提物乙酸乙酯部对消化道各需氧菌种 的抑菌作用随着余甘子醇提物乙酸乙酯部浓度的降 低而抑制作用明显降低，乙酸乙酯部对金黄色葡萄 球菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、 变形杆菌、沙门氏菌的 MIC 值均为 2.500 mgmL1， 对肺炎链球菌的 MIC 值为 0.625 mgmL1，对大肠 1 杆菌 MIC 值为 1.25

22、0 mgmL ；盐提物的乙酸乙酯 注：抑菌圈 2.00 cm 为极敏； 1.501.0001.00 cm 低敏； 0 为不敏。 Note: inhibition zone 2.00 cm, extremely sensitive; 1.502.00 cm, highly sensitive; 1.001.50 cm, middle sensitive; 01.00 cm, low sensitivity; 0, not sensitive. 部对表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、 变形杆菌、沙门氏菌的 MIC 值均为 2.500 mgmL1， 对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌的 M

23、IC 值均为 1.250 mgmL1。结果见表 2。 表 2 余甘子醇提物及盐提物乙酸乙酯部位对消化道各需氧菌种的抑菌作用和 MIC(n=3) Tab. 2 The MICs of aerobe of ethyl acetate extracted from the fruit of Phyllanthus emblica L.(n=3) 浓度 /mgmL1 组 别 菌 株 醇提物乙酸乙酯部位 盐提物乙酸乙酯部位 金黄色葡萄球菌 表皮葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 肺炎链球菌 白色念珠菌 大肠杆菌 变形杆菌 沙门氏菌 金黄色葡萄球菌 表皮葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 肺炎链球菌 白色念珠菌 大肠杆菌 变形杆

24、菌 沙门氏菌 注： “”代表无菌落生长， “+”代表有菌落生长。 Note: “”No bacterium growing; “+” bacterium growing. 5.000 2.500 1.250 0.625 0.312 0.156 0.078 0.039 0.019 空白 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

25、 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 组 别 mgmL1石油 醚部 乙酸 乙酯部 三氯 甲烷部 正丁 醇部 水余部 10 2.45 2.86 0.80 1.20 0.64 5 2.19 2.20 0 0.40 0 醇 提 物 2 1.54 1.81 0 0 0 1 0.80 1.15 0 0 0 0.5 0 0.80 0 0 0 10 1.57 3.57 0.50 1.00 0.64 5 1.40 2.80 0.10 0.56 0 盐 提 物 2 1.00 1

26、.62 0 0.17 0 1 0.60 1.15 0 0 0 0.5 0 0.80 0 0 0 空 白对 照 组 0 0 0 0 0 0 庆 大霉 素 组 0.02 2.56 2.56 2.56 2.56 2.56 1048 Chin J Mod Appl Pharm, 2014 September, Vol.31 No.9 中国 现 代 应 用药学 2014 年 9 月第 31 卷 第 9 期 2.3.2 对消化道各厌氧菌种的抑菌作用和 MIC 取产气荚膜杆菌和破伤风杆菌接种于血琼脂平 板， 35 厌氧培养过夜，用已加入适量维生素 K1 和氯化血红素的布氏肉汤制作菌悬液，并调整菌 液浓度至

27、0.5 麦氏比浊相当。将余甘子醇提物及盐 提物乙酸乙酯部干粉配制成一定浓度，灭菌，保 存于 60 以下。按宏量肉汤稀释法进行操作，混 匀后置于 37 恒温厌氧培养 1824 h，观察抑菌 作用。结果显示，余甘子醇提物对消化道各需氧菌 种的抑菌作用随着余甘子醇提物乙酸乙酯部浓度 的降低而抑制作用明显降低，余甘子醇提物的乙酸 乙酯部对破伤风杆菌的 MIC 值为 0.156 mgmL1， 对产气荚膜杆菌的 MIC 值为 1.250 mgmL1。余甘 子盐提物的乙酸乙酯部对破伤风杆菌的 MIC 值为 0.312 mgmL1 ，对产气荚膜杆菌 的 MIC 值为 0.625 mgmL1。结果见表 3。 表

28、 3 余甘子醇提物及盐提物乙酸乙酯部位对消化道各厌氧菌种的抑菌作用和 MIC(n=3) Tab. 3 The MICs of anaerobe of ethyl acetate part extracted from the fruit of Phyllanthus emblica L.(n=3) 浓度 /mgmL1组 别 菌 株 醇提物乙酸乙酯部位 盐提物乙酸乙酯部位 3 讨论 通过余甘子醇提物中 5 个部位 (石油醚部、乙 酸乙酯部、三氯甲烷部、正丁醇部、水余部 )对大 肠杆菌的抑菌作用，测量抑菌圈的直径和比较菌 落生长状况，可得出余甘子醇提物和盐提物的 5 个部位对大肠杆菌均具有抑制作用

29、，且随浓度的 降低，抑菌效果明显降低，其中乙酸乙酯部的抑 菌效果最强，石油醚次之。即乙酸乙酯部位抑菌 活性最强，是余甘子的主要抑菌活性部位，且盐 提物的乙酸乙酯部位抑菌效果较醇提物的乙酸乙 酯部位更好。 通过对余甘子醇提物和盐提物乙酸乙酯部位 的消化道菌群抑菌实验，余甘子醇提物和盐提物 中乙酸乙酯部位对需氧菌和厌氧菌的 MIC 数据对 比，可得出余甘子醇提物和盐提物的乙酸乙酯部 位对厌氧菌的抑菌效果比对需氧菌的抑菌效果好。 余甘子主要成分有黄酮类、多糖、蛋白质、生 物碱、香豆素、有机酸、微量元素及挥发油等 9-11。 盐水中主要为多糖、蛋白质、生物碱、有机酸类 成分。因此，初步可推测余甘子抑菌

30、的化学成分 为多糖和有机酸类成分。 近年来，有关耐药菌株的报道越来越多，而 大量研究发现，中药在预防和治疗细菌性感染疾 病上具有积极作用。而且由于中药化学成分组成 复杂，对细菌具有广谱抑菌性和低耐药性等优点。 本研究发现，余甘子对消化道菌群具有较广谱的 抑制作用，为中药抗菌作用的研究和开发提供了 实验数据和理论依据。 REFERENCES 1 Ch.P(2010)Vol (中国药典 2010 年版 . 一部 ) S. 2010: 167. 2 XIA Q, XIAO P E, WANG L E. Ethnopharmacology of Phyllanthus emblica L. J. Ch

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36、on of essential oils from Emblica (Phyllant husemblica L.) Fruit by supercritical fluid extraction and their antioxidant activity J. J Southwest Univ(Nat Sci Edit)(西南 大学学报：自然科学版 ), 2007, 29(5): 122-127. 收稿日期： 2013-11-12 5.000 2.500 1.250 0.625 0.312 0.156 0.078 0.039 0.019 空白 破 伤风 杆 菌 + + + + 产 气荚 膜 杆菌 + + + + + + + 破 伤风 杆 菌 + + + + + 产 气荚 膜 杆菌 + + + + + +