余甘子提取物对尿酸钠诱导大鼠急性痛风性关节炎的作用研究_岑志芳.docx

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1、余甘子提取物对尿酸钠诱导大鼠急性痛风性关节炎的作用研究 岑志 芳 1 ， 张继 平 2， 李海 燕 1， 曾煦 欣 1， 吴剑 峰 1（# 医院 ， 佛山市 528000） 1.佛山科学技术学院 ， 佛山市 528000； 2.广东佛山市第二人民 中图分类号 R285； R97 文献标识码 A 文章编号 1001-0408（ 2011） 47-4425-03 摘 要 目的 ： 研究余甘子不同提取部位提取物对大鼠急性痛风性关节炎的作用 。 方法 ： 实验分为空白对照 、 模型 、 秋水仙碱和余 甘子醇提物 、 石油醚 、 乙酸乙酯 、 正丁醇 、 水相部位组 ， 采用尿酸钠诱导大鼠痛风性关节炎模

2、型 ， 测定大鼠关节肿胀度 、 观察大鼠 步 态 、 测定关节组织前列腺 素 E（2 PGE2） 和血清肿瘤坏死因子 -（ TNF-） 含量 ， 考察余甘子不同部位提取物对痛风性关节炎的作用 。 结果 ： 与模型组比较 ， 余甘子醇提物 、 乙酸乙酯部位 、 正丁醇部位 、 水相部位的踝关节肿胀度显著降 低 （ P 0.05） ； 各提取物组步 态 评分显著降 低 （ P 0.05） ； 醇提物 、 乙酸乙酯部位 、 石油醚部位 、 正丁醇部位 的 PGE2含量显著降 低 （ P 0.01 或 P 0.05） ； 正丁醇部位 、 乙酸 乙酯部位 、 石油醚部位组大鼠血清 的 TNF-含量显著降

3、 低 （ P 0.05） 。 结论 ： 余甘子提取物正丁醇和乙酸乙酯部位对大鼠痛风性关节炎 有明显的抗炎镇痛作用 ， 其作用机制是通过抑制局部组织和血清炎症介 质 （ PGE2和 TNF-） 的释放而减轻炎症反应 。 关键词 余甘子 ； 提取部位 ； 痛风性关节炎 ； 大鼠 Effects of Different Extracts of Phyllanthus emblica on Sodium Urate-induced Acute Gouty Arthritis in Rats CEN Zhi-fang， LI Hai-yan， ZENG Xun-xin， WU Jian-feng（ F

4、oshan College of Science and Technology， Foshan 528000， China） ZHANG Ji-ping（ Foshan Second People s Hospital of Guangdong Province， Foshan 528000， China） ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of different extract parts from Phyllanthus emblica on acute gouty arthritis in rats. METHODS： Rats were

5、 divided into blank control group， model group， colchicine group and methanol extracts group， petroleum ether part group， ethyl acetate part group， n-butyl alcohol part group， water-phase part group of P. embilica. Gouty arthritis model of rat was induced by sodium urate in above groups. The swellin

6、g degree of joint， gait， the contents of PEG2 and serum TNF- were observed and determined. The effects of different extract parts from P. emblica on gouty arthritis were investigated. RE- SULTS： Compared with model group， the swelling degree of ankle joint of methanol extracts of P. emblica group， e

7、thyl acetate part group， n-butyl alcohol part group and water-phase part group decreased significantly（ P 0.05） .Gain score of each extracts group de- creased significantly（ P 0.05） .PEG2 content of methanol extracts of P. emblica group, ethyl acetate part group， petroleum benzine group， n-butyl alc

8、ohol part group decreased significantly（ P 0.05） .TNF- content of acetic ether group， n-butanol group， petro- leum benzine group also decreased significantly（ P 0.05） . CONCLUSION： Ethyl acetate part and n-butyl alcohol part of the ex- tracts of P. emblica show obvious anti-inflammatory and analgesi

9、c effect on gouty arthritis in rats. The mechanism of relieving in- flammation reaction is to inhibit the release of PGE2 and TNF- in local tissue and serum. KEY WORDS Phyllanthus emblica； Extract parts； Gouty arthritis； Rat 痛风是因长期嘌呤代谢障碍 ， 高尿酸血症引起组织损伤 的一组临床综合征 。 临床上可见高尿酸血症 、 特征性关节炎 反复发作 、 痛风石形成 ， 严重

10、者可致肾尿酸结石和痛风性肾实 质病变和其他并发症 ， 严重危害人体健康 。 余甘子又名山油 柑 、 油甘子 、 余甘果等 ， 为大戟科叶下珠属植物余甘子 （ Phyll- lanthus emblica） 的成熟果实 1。 民间一直有服用该药治疗痛风 的习惯 ， 并且与其他药材一起配制成复方使用 ， 如藏药十五味 乳鹏丸 ， 对于关节红肿疼痛 、 发痒 、 痛风 、 黄水积聚就有良好疗 效 2。 本文研究余甘子不同部位提取物对大鼠痛风性关节炎 的防治作用及作用机制 。 建设中医药强省科研立项资助课题 （ 2009056） 高 级 实 验 师 。 研 究 方 向 ： 药 物 质 量 标 准 。

11、E-mail： fs # 通迅作者 ： 教授 。 研究方向 ： 天然活性成分的研发 。 电话 ： 0757-82836985。 E-mail： 1 仪器与材料 1.1 仪器 PV-200 型足趾容积测量仪 （ 成都泰盟科技有限公司 ）； 水 浴箱 （ 浙江金坛市白塔金昌实验仪器厂 ）； UV-2450/2550 型紫 外分光光度计 （ 日本岛津公司 ）； TGL-16G-A 型台式离心机 （ 上 海安亭科学仪器厂 ）； SN-695B 型放免 测量仪 （ 上海原子核所 日环仪器厂 ）。 1.2 试药 余甘子药材 （ 采自广东汕头 ） 经佛山科学技术学院李海燕 副教授鉴定为真品 ； 秋水仙碱

12、片 （ 西双版纳版纳药业有限公 司 ， 批号 ： 101028）； 尿酸钠 （ 美国 Sigma 公司 ）； 甲醇 （ 江苏强盛 化工有限公司 ， 批号 ： 20080729）； 氢氧化钠 （ 广东光华化学厂 有限公司 ， 批号 ： 20040803）。 1.3 动物 SPF 级 SD 大鼠 80 只 ， ， 体重 180 220 g， 由广州中医药 中国药房 2011 年第 22 卷第 47 期 China Pharmacy 2011 Vol. 22 No. 47 4425 足趾容积/mL大学实验动物中心提 供 （ 动 物生产合格证号 ： SCXK（ 粤 ） 2008-0020）。 2 方法

13、 2.1 溶液的制备 2.1.1 余甘子提取物的制备 取余甘子生药材适量 ， 置于锥 形瓶中 ， 加入甲醇 。 加热连续回流 4 次 ， 每次 1.5 h， 趁热过滤 。 将 4 次所得滤液减压蒸馏 ， 回收甲醇 ， 得到余甘子醇提浓缩液 ， 呈浸膏状 。 取醇提物 500 g， 加适量蒸馏水溶解 ， 再依次用石油 醚 、 乙酸乙酯 、 正丁醇分别提取出 3 个极性部位 ， 最后的部分静 置使其分出水相部分 。 得到各部分提取液后减压蒸馏 ， 得到 各部分浓缩液用于实验 ， 余甘子醇 、 石油醚 、 乙酸乙酯 、 正丁醇 提取物得率分别为 0.85 、 7.8 、 13.35 、 38.60

14、。 2.1.2 尿酸钠晶体溶液的制备 用 194 mL 蒸馏水加 6 mL 的 1 mol L-1 NaOH， 煮沸 ， 加 1 g 尿酸 ， 用 1 mol L-1HCl 调 pH 值为 7.2， 搅拌冷却 ， 4 贮藏 24 h， 去上清液 ， 用滤纸将沉淀物水分 吸干 ， 放入干燥箱烘 2 h， 取出 ， 刮下粉末 3， 放入研钵内研成细 末 ， 用孔径 250 m 的金属网筛过筛 ， 制成尿酸钠结晶 。 取尿酸 钠结晶加生理盐水 ， 再加 1 mL 吐温 80， 加热搅拌 ， 得 25 mg mL-1 尿酸钠溶液 。 2.2 模型的复制 、 分组与给药 液 ， 20 贮藏 ， 放射免疫

15、法测定 TNF-含量 。 2.6 统计学方法 实验数据以 x s 表示 ， 量反应采用 t 检验统计方法 ， 以 P 0.05 表示有统计学意义 ； 质反应采用 2 检验方法 ， 以 P0.05 表 示有统计学意义 。 3 结果 3.1 对模型大鼠踝关节肿胀的影响 与空白对照组同一时间点比较 ， 模型组大鼠踝关节肿胀 度均显著增加 （ P 0.01）， 复制模型约 0.5 h 后开始肿胀 ， 随后 显著增加 ， 大概在 4 h 时达到最高峰 ， 提示复制模型成功 。 与 模型组比较 ， 余甘子醇提物组 8 、 12、 24 h 时 ， 余甘子乙酸乙酯 部位组 6、 8、 24、 48 h 时

16、， 余甘子正丁醇部位组在 8、 12、 24、 48 h 时 ， 余甘子水相部位组 8、 12、 24 h 时 ， 余甘子石油醚部位组在 24 h 时显著降低 （ P 0.05）。 提示余甘子对模型大鼠踝关节肿 胀有显著的抑制作用 ， 尤其是醇提物 、 正丁醇部位 、 水相部位 和乙酸乙酯部位作用较为明显 。 余甘子提取物对模型大鼠关 节肿胀的影响见图 1。 2.8 空白对照组 模型组 实验分为 8 组 ， 即 空白对照 、 模 型 、 秋 水仙 碱 （ 0.8 mg kg-1）、 石油醚部位 （ 5 g kg-1）、 乙酸乙酯部位 （ 5 g kg-1）、 正丁醇 部位 （ 5 g kg-1

17、）、 水相部位 （ 5 g kg-1）、 醇提物 （ 5 g kg-1） 组 。 ig 给药 ， 每天 1 次 ， 连续 7 d。 末次给药前 ， 将大鼠的左后肢浸入 足趾容积测定仪内 ， 读取大鼠左后肢的正常足趾容积 ， 连续 3 次 ， 求其平均值作为正常值 （ 此为 0 h 的足肿胀值 ）。 末次给药 2.3 1.8 1.3 0 1 2 4 6 8 12 24 48 时间 /t 秋水仙碱组 余甘子醇提物组 余甘子水相部位组 余甘子正丁醇部位组 余甘子乙酸乙酯部位组 余甘子石油醚部位组 1 h 后 ， 无菌操作 ， 每只鼠左后足趾 sc 0.2 mL 尿酸钠晶体溶液 复制模型 ， 分别于注

18、射后 1、 2、 4、 6、 8、 12、 24、 48 h 测定大鼠足 趾容积 。 2.3 余甘子提取物对大鼠 24 h 步态行为的影响 分别于复制模型 24 h 后观察各组大鼠的步态并进行评分 分级 ， 根据文献 4标准进行评分 ： 0 分为正常步态 ， 双足均匀着 地 ； 1 分为轻度跛行 ， 受试下肢略有弯曲 ； 2 分为中度跛行 ， 受试 下肢刚触及地面 ； 3 分为重度跛行 ， 受试下肢离开地面 ， 三足着 地行走 。 2.4 余甘子提取物对大鼠关节组织前列腺 素 E（2 PGE2） 含 量 的影响 各组大鼠测完最后时间点 （ 复制模型后 48 h） 踝关节肿胀 后 ， 处死大鼠

19、， 距右踝关节上 0.5 cm 处剪下右足 ， 称重 ， 剥皮后 浸泡于 5 mL 生理盐水中 1 h， 以 1 500 r min-1 离心 10 min， 吸取 上清液 0.5 mL， 加入 0.5 mol L-1 氢氧化钠 -甲醇溶液 2 mL， 于 50 水浴箱中水浴异构化 20 min， 加甲醇稀释至 20 mL 后 ， 参 照文献 5 方法于紫外分光光度计 278 nm 波长处测定吸光度 （ OD）， 以每 1 g 炎性组织相当的 OD 值显示 PGE2 的含量 。 2.5 余甘子提取物对模型大鼠血清肿瘤坏死因子 -（ TNF-） 含量的影响 各组大鼠测完最后时间点 （ 复制模型后

20、 48 h） 踝关节肿胀 后 ， 乙醚麻醉取血 ， 全血以 3 000 r min-1 离心 10 min， 取上清 图 1 余甘子提取物对模型大鼠关节肿胀的影响 Fig 1 Effects of the extracts of P. emblica on joint swelling in model rats 3.2 对模型大鼠 24 h 步态行为的影响 与空白对照组比较 ， 模型组大鼠活动减少 ， 右后肢弯曲 ， 行走时出现不同程度的跛行 ， 大鼠 24 h 步态评分显著升高 （ P 0.05）。 与模型组比较 ， 余甘子醇提物 、 乙酸乙酯部位 、 正 丁醇部位 、 石油醚部位 、 水

21、相部位组大鼠步态明显得到改善 ， 评分显著降低 （ P 0.05）。 余甘子提取物对模型大鼠 24 h 步 态行为的影响见表 1。 3.3 对模型大鼠关节组织 PGE2 含量的影响 与空白对照组比较 ， 模型组大鼠关节组织 PGE2 含量显著 提高 （ P 0.01）， 提示关节局部炎症反应剧烈 。 与模型组比较 ， 余甘子的醇提物 、 正丁醇部位 、 石油醚部位 、 乙酸乙酯部位组 大鼠关节组织 PGE2 含量显著降低 （ P 0.01 或 P 0.05）。 余甘 子提取物对模型大鼠关节组织 PGE2 含量的影响见表 2。 3.4 对模型大鼠血清 TNF-含量的影响 与空白对照组比较 ， 模

22、型组大鼠血清 TNF- 的含量显著提 高 （ P 0.01）。 与模型组比较 ， 正丁醇部位 、 乙酸乙酯部位 、石 油醚部位组大鼠血清 TNF- 含量显著降低 （ P 0.05）， 说明余 甘子可能通过抑制血清炎性介质释放从而减轻炎症反应 。余 甘子提取物对模型大鼠血清 TNF-含量的影响见表 3。 4426 China Pharmacy 2011 Vol. 22 No. 47 中国药房 2011 年第 22 卷第 47 期 -1 表 1 余甘子提取物对模型大鼠 24 h 步态行为的影响 （ xs， n 10） Tab 1 Effects of the extracts of P. embl

23、ica on 24 h gait be- havior in model rat（ s xs， n 10） 24 h 步态评分 4 讨论 现代药理研究证明 ， 余甘子乙醇和水提取物对醋酸所致 的小鼠扭体反应有明显的镇痛作用 ； 余甘子粉能显著抑制大 鼠琼脂性足跖肿胀和二甲苯所致小鼠耳壳肿胀 ， 显著抑制组 胺所致的毛细管通透性增强和白细胞游出 5， 6。 也有文献显 组别 剂量 0 分 1 分 2 分 3 分 示 ， 余甘子醇提物乙酸乙酯部位对金黄色葡萄球菌 、 枯草杆 与空白对照组比较 ： P 0.05； 与模型组比较 ： #P 0.05 vs.blank control group： P

24、0.05； vs.model group： #P 0.05 表 2 余甘子提取物对模型大鼠关节组织 PGE2 的影响 （ xs， n 10） Tab 2 Effects of the extracts of P. emblica on PGE2 level of joint tissue in model rat（ s xs， n 10） 组别 剂量 PGE2/mg kg 提取部位的药效结果进行比较分析 ， 发现正丁醇与乙酸乙酯 对上述指标均有明显作用 ， 醇提部位虽然对足肿胀 、 步态指 数 、 组织 PGE2 有明显作用 ， 但对血清 TNF-无影响 ， 而且对足 肿胀的有效时间只能持续到

25、 24 h， 不如正丁醇部位与乙酸乙酯 部位 。 本研究对象为大鼠急性痛风性关节炎模型 ， 综合上述 指标判断 ， 余甘子抗痛风作用的有效部位主要在正丁醇和乙 酸乙酯部位 ， 本研究可为进一步探讨余甘子抗痛风作用机制 空白对照组 模型组 秋水仙碱组 余甘子醇提物组 余甘子石油醚部位组 余甘子乙酸乙酯部位组 余甘子正丁醇部位组 余甘子水相部位组 - - 0.8 mg kg-1 5 g kg-1 5 g kg-1 5 g kg-1 5 g kg-1 5 g kg-1 6.653.02 46.9120.31 31.749.98# 19.076.01# 30.1817.26# 31.3813.75#

26、20.044.51# 38.6722.78 奠定理论基础 。 参考文献 1 国家药典委员会 .中华人民共和国药典（一部） S.2010 年版 .北京 ： 中国医药科技出版社 ， 2010： 124 2 侯开卫 .余甘子化学成分及其在民族民间传统医药中的 应用J.中国民族民间医药杂志 ， 2002， 11（ 6）： 345. 与空白对照组比较 ： P 0.01； 与模型组比较 ： #P 0.05， # P 0.01 vs.blank control group： P 0.01； vs.model group： #P 0.05， # P 0.01 表 3 余 甘 子 提 取 物 对 模 型 大 鼠

27、 血 清 TNF- 含 量 的 影 响 （ xs， n 10） Tab 3 Effects of the extracts of P. emblica on serum TNF- level in model rat（ s xs， n 10） 3 孙晓波 ， 李会芳 ， 代竹青 ， 等 .藏药桑当抗痛风作用的实验 研究 J.四川中医 ， 2005， 6（ 23）： 19. 3 前田悦子 ， 藤吉俊夫 ， 植松利南 .Alminoprofen 对尿酸盐 诱发炎症的作用 J.日本药理志 ， 1991， 98： 467. 4 旷惠桃 ， 周 珂 ， 高小峰 .痛风克冲剂对痛风大鼠前列腺 素 E2 的

28、影响 J.现代中西医结合杂志 ， 2003， 12（ 11）： 1 136. 组别 空白对照组 模型组 秋水仙碱组 余甘子醇提物组 余甘子石油醚部位组 余甘子乙酸乙酯部位组 余甘子正丁醇部位组 余甘子水相部位组 剂量 - - 0.8 mg kg-1 5 g kg-1 5 g kg-1 5 g kg-1 5 g kg-1 5 g kg-1 TNF-/ng mL-1 0.3300.099 0.4890.111 0.3700.086# 0.4300.101 0.3560.059# 0.3740.095# 0.3360.103# 0.3930.131 5 perianayagam JB.Evaluat

29、ion of anti-pyretic and analgesic activity of officinalis gaertaJ. J Ethnophamacol， 2004， 95 （ 1）： 83. 6 高 鹰 ， 李存仁 . 余甘子的抗炎作用与毒性的实验研究 J.云南中医中药杂志 ， 1996， 17（ 2）： 47. 7 邓才彬 ， 谢庆娟 ， 曲中堂 .余甘子 4 种不同部位醇提物的 抑菌作用研究 J.中国药房 ， 2010， 21（ 3）： 209. 与空白对照组比较 ： P 0.01； 与模型组比较 ： #P 0.05 vs.blank control group： P 0.0

30、1； vs.model group： #P 0.05 （ 收稿日期 ： 2011-03-12 修回日期 ： 2011-08-29） 中国药房 杂志 中国科学引文数据库 （ CSCD） 来源期刊 ， 欢迎投稿 、 订阅 中国药房 2011 年第 22 卷第 47 期 China Pharmacy 2011 Vol. 22 No. 47 4427 空白对照组 10 0 0 0 模型组 - 0 0 3 7 菌 、 大肠杆菌和白色念珠菌有强抑制作用7。 本研究显示 ， 余 秋水仙碱组 # 0.8 mg kg-1 0 4 5 1 甘子提取物能显著改善模型大鼠关节肿胀程度 、 步态指数 等 余甘子醇提物组 # 5 g kg-1 0 3 5 2 关节炎的症状与指标 ， 同时能显著降低模型大鼠关节组 织 余甘子石油醚部位组 # 5 g kg-1 0 1 6 3 PGE2 与血 清 TNF-水平 ， 与上述文献结果相吻合 。 说明余 甘 余甘子乙酸乙酯部位组 # 5 g kg-1 0 1 8 1 余甘子正丁醇部位组 # 5 g kg-1 0 3 6 1 子具有抗炎镇痛作用 ， 其机制是抑制局部组织和血清炎症 介 余甘子水相部位组 # 5 g kg-1 0 1 7 2 质 PGE2 和 TNF-的释放 。 对石油 醚 、 正丁 醇 、 乙酸乙酯 等 5 个