蛋白质分离技术层析课件.ppt

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1、关于蛋白质分离技术层关于蛋白质分离技术层析析第1页，此课件共90页哦一、概述 1 1、定义、定义 层析层析层析层析(又名色谱又名色谱又名色谱又名色谱)一一一一种种种种利利利利用用用用混混混混合合合合物物物物中中中中各各各各组组组组分分分分的的的的物物物物理理理理化化化化学学学学性性性性质质质质间间间间的的的的差差差差异异异异，使使各各组组分分在在层层析析两两相相中中以以不不同同程程度度分分配配，借借此此将将各各组组分分离。分分离。第2页，此课件共90页哦分子极性分子极性分子大小分子大小分子形状分子形状离子亲和力分离子亲和力分子亲和力吸附子亲和力吸附能力能力凝胶层析凝胶层析离子交换层析离子交换层

2、析亲和层析亲和层析2 2、物理化学性质间的差异、物理化学性质间的差异吸附层析吸附层析第3页，此课件共90页哦19031903年年年年 俄国植物学家俄国植物学家俄国植物学家俄国植物学家 茨维特茨维特茨维特茨维特 发表了有关填充以菊根粉的玻璃柱分离植物色素，发表了有关填充以菊根粉的玻璃柱分离植物色素，以石油醚冲洗，得到黄色、绿色区带以石油醚冲洗，得到黄色、绿色区带;1970s1970s1970s1970s早期早期 高效液相色谱法（高效液相色谱法（高效液相色谱法（高效液相色谱法（HPLC)HPLC)HPLC)HPLC)目前目前目前目前 气相层析仪和气相层析仪和气相层析仪和气相层析仪和HPLCHPLC

3、HPLCHPLC与色谱、质谱以及计算机联用。与色谱、质谱以及计算机联用。与色谱、质谱以及计算机联用。与色谱、质谱以及计算机联用。3 3、层析的发展、层析的发展第4页，此课件共90页哦 层层析析法法进进行行时时有有两两个个相相，一一个个相相称称为为固定相固定相，另一相称为，另一相称为流动相流动相。支持物支持物含待分离物质含待分离物质第5页，此课件共90页哦气气相相层层析析液液相相层层析析气气-固固 气气-液液 液液-固固 液液-液液二二.层析技术的分类层析技术的分类1.1.按两相所处的状态分类按两相所处的状态分类以气体作为流动相以气体作为流动相以液体作为流动相以液体作为流动相第6页，此课件共90

4、页哦2.按层析的机制可分为n n吸附层析吸附层析n n分配层析分配层析n n凝胶层析凝胶层析n n亲和层析亲和层析n n离子交换层析离子交换层析第7页，此课件共90页哦n n定义定义定义定义 指指指指混混混混合合合合物物物物随随随随流流流流动动动动相相相相通通通通过过过过吸吸吸吸附附附附剂剂剂剂时时时时，由由由由于于于于吸吸吸吸附附附附剂剂剂剂对对对对不不不不同同同同物物物物质质质质的的的的吸吸吸吸附附附附力力力力而而而而使使使使混混混混合合合合物物物物分分分分离离离离的方法。的方法。的方法。的方法。n n原理原理原理原理 在不同条件下，吸附剂与在不同条件下，吸附剂与在不同条件下，吸附剂与在不

5、同条件下，吸附剂与被吸附物之间的作用被吸附物之间的作用被吸附物之间的作用被吸附物之间的作用物物物物理理理理作作作作用用用用的的的的范范范范德德德德华华华华吸吸吸吸附附附附：无无无无选选选选择择择择性性性性，吸吸吸吸附附附附速速速速度度度度快快快快，吸吸吸吸附附附附的的的的过过过过程程程程是可逆的是可逆的是可逆的是可逆的化化化化学学学学吸吸吸吸附附附附：由由由由原原原原子子子子价价价价力力力力的的的的作作作作用用用用引引引引起起起起。有有有有选选选选择择择择性性性性，吸吸吸吸附附附附速速速速度度度度较较较较慢慢慢慢，不易解吸不易解吸不易解吸不易解吸（1）吸附层析 在单位时间内被吸附于吸附剂的某一

6、表面积上的分子和同一单位时在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡，吸附层析就是不断地产间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡，吸附层析就是不断地产生平衡与不平衡，吸附与解吸。生平衡与不平衡，吸附与解吸。第8页，此课件共90页哦吸附层析n n常用的吸附剂常用的吸附剂 硅胶碱性碱性碱性碱性:碳氢化合物碳氢化合物碳氢化合物碳氢化合物 中中中中性性性性:醛醛醛醛,酮酮酮酮,醌醌醌醌,酯酯酯酯,内酯酸性内酯酸性内酯酸性内酯酸性:酸性色素酸性色素酸性色素酸性色素,醛醛醛醛,酸酸酸酸聚酰胺氧化铝 活性炭磷酸钙粉末粉末粉末粉末:吸附力大吸附力大吸附

7、力大吸附力大,流速慢流速慢流速慢流速慢 颗颗颗颗粒粒粒粒:吸附力中吸附力中吸附力中吸附力中,流速易控流速易控流速易控流速易控 锦锦锦锦纶纶纶纶-活性炭活性炭活性炭活性炭:吸附力弱吸附力弱吸附力弱吸附力弱锦纶锦纶锦纶锦纶66666666或锦纶或锦纶或锦纶或锦纶6 6 6 6 酰胺基团酰胺基团酰胺基团酰胺基团 对酚对酚对酚对酚,DNP-,DNP-,DNP-,DNP-氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸,醌醌醌醌,羧酸羧酸羧酸羧酸 氢键：羟基与羰基氢键：羟基与羰基氢键：羟基与羰基氢键：羟基与羰基唯一用于生物活性物质唯一用于生物活性物质唯一用于生物活性物质唯一用于生物活性物质 羟基磷灰石羟基磷灰石羟基磷灰石羟基磷

8、灰石第9页，此课件共90页哦（2）分配层析利利用用不不同同组组分分在在在在流流流流动动动动相相相相和和和和固固固固定定定定相相相相中中中中的的的的分分分分配配配配系系系系数数数数不不不不同同同同而进行分离的方法。而进行分离的方法。而进行分离的方法。而进行分离的方法。第10页，此课件共90页哦n n柱层析柱层析 进样量大且容易回收进样量大且容易回收n n薄层层析薄层层析 小量样品，快速，小量样品，快速，操作简便操作简便3.3.按制备量分类按制备量分类第11页，此课件共90页哦 层层析法的演变过程析法的演变过程：圆形滤纸长条滤纸薄层层析(TLC)柱层析容量变大容量更大加展开液第12页，此课件共90

9、页哦纸层析纸层析薄层层析薄层层析第13页，此课件共90页哦三.层析的一般原理 1.1.1.1.分配系数分配系数分配系数分配系数 表示表示一种物质在两种特定相（流动相和固定相）中一种物质在两种特定相（流动相和固定相）中分配程度。分配程度。溶质在固定相中的浓度溶质在固定相中的浓度 CsCsK=K=溶质在流动相中的浓度溶质在流动相中的浓度 CmCm 特定的温度：常数特定的温度：常数 K K大：被固定相吸附的牢固，随流动相大：被固定相吸附的牢固，随流动相 的移动速度较慢。的移动速度较慢。第14页，此课件共90页哦纯化生物物质的纯度纯化生物物质的纯度 取决于混合物中各组分取决于混合物中各组分K K 值的

10、差异程度。值的差异程度。混混合合物物中中各各组组分分若若 K K值值相相差差较较大大,则则能能较较易易地地把把混混合合物物中中的的生生物物物物质质分分离离。反反之之,K,K值值相相差差较较小小,不不易易把把混混合合物物中中的的生生物物物质分离。物质分离。第15页，此课件共90页哦凝胶层析Gel Chromatography凝胶过滤凝胶过滤 （gel filtrationgel filtration）(Porath,Flodin,1959)分子筛层析（分子筛层析（molecular sieve chromatographymolecular sieve chromatography）(Hjert

11、n,Mosbach,1962)排阻层析排阻层析 （exclusion chromatographyexclusion chromatography）(Pedersen,1962)指混合物随流动相经固定相的层析柱时，混合指混合物随流动相经固定相的层析柱时，混合物中各组份按其分子大小不同而被分离的技术。物中各组份按其分子大小不同而被分离的技术。第16页，此课件共90页哦一、基本原理 第17页，此课件共90页哦固定相（凝胶）n n三维空间网状结构三维空间网状结构三维空间网状结构三维空间网状结构A good gel for gel filtration contains about95%water第1

12、8页，此课件共90页哦 凝胶层凝胶层析法：析法：样品样品固定相流动相小分子被延滯小分子大分子较快流出 分子筛效应分子筛效应：分子大小不同分子大小不同,在在凝胶受到的阻滞凝胶受到的阻滞作用有差异作用有差异,从而从而造成各组分在凝造成各组分在凝胶柱中的迁移速胶柱中的迁移速度不同得到分度不同得到分离。第19页，此课件共90页哦第20页，此课件共90页哦凝胶层析过程的数理关系 1、柱床体积、柱床体积(V(VT)2 2、洗脱体积（洗脱体积（Ve）n n即即欲欲分分离离物物质质通通过过层层析析柱柱洗洗脱脱下下来来所所需需洗洗脱脱液液的的总体积。总体积。3 3、外水体积（外水体积（V0）4、内水体积（内水体

13、积（内水体积（内水体积（Vi）5 5、凝胶干体积（、凝胶干体积（、凝胶干体积（、凝胶干体积（Vg）第21页，此课件共90页哦柱床体积柱床体积VT凝胶干体积凝胶干体积Vg内水体积内水体积Vi存在于柱床内凝胶外存在于柱床内凝胶外面空隙之间的水相体面空隙之间的水相体积，相应于一般层析积，相应于一般层析法中流动相的体积。法中流动相的体积。颗粒内部所含水相的颗粒内部所含水相的体积它可从干凝胶颗体积它可从干凝胶颗粒重量和吸水重量相粒重量和吸水重量相减求得。减求得。凝胶体积以及颗粒内凝胶体积以及颗粒内外间隙体积的总和。外间隙体积的总和。VT=1/4 D2h外水体积外水体积V0V VT T =Vg+V=Vg+

14、V0 0+Vi+Vi数理关系数理关系第22页，此课件共90页哦Ve-VoVe-Vo Kd=Kd=Vi Vi6、分配系数（、分配系数（Kd）：）：特点：特点：（1）与被分离物质分子）与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小和凝胶颗粒孔隙的大小有关的大小有关（2）与柱的长短粗细）与柱的长短粗细无关无关 每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个特定每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个特定每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个特定每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个特定的分配系数（的分配系数（的分配系数（的分配系数（KdKd）Ve=Vo+KdViVe=Vo+KdVi第23页，此课件共90页哦(2)

15、Ve=Vo+Vi(2)Ve=Vo+Vi Kd=1 Kd=1n分子完全不被排阻分子完全不被排阻n完全向凝胶颗粒内部完全向凝胶颗粒内部扩散扩散n在两相分配的比值为在两相分配的比值为1,1,最后流出最后流出.(1)Ve=Vo(1)Ve=Vo Kd=0 Kd=0n分分子子完完全全被被排排阻阻于于凝凝胶胶颗颗粒粒之之外外n全全部部分分布布于于流流动动相里相里,n最先流出。最先流出。(3)0 Kd 1 (3)0 Kd 1 Ve=Vo+ViKdVe=Vo+ViKd为溶质以某种程为溶质以某种程度向凝胶颗粒内扩度向凝胶颗粒内扩散散 Kd=0Kd=0Kd=0Kd=0 0 0 0 0Kd1Kd1Kd1Kd1 Kd=

16、1Kd=1Kd=1Kd=1洗脱体积洗脱体积洗脱体积洗脱体积第24页，此课件共90页哦 三三.凝胶层析的优点凝胶层析的优点 1.1.1.1.凝凝胶胶是是一一种种不不带带电电荷荷的的惰惰性性载载体体，结结构构稳定稳定。2.2.2.2.操作条件较温和操作条件较温和。3.3.样样品品得得率率高高,重重复复性性好好,可可可可进进进进行行行行大大大大量量量量样样样样品品品品的的的的分离纯化。分离纯化。分离纯化。分离纯化。四、凝胶层析的缺点四、凝胶层析的缺点1.1.要要要要求求求求样样品品和和洗洗脱脱液液的的粘粘度很低度很低。2.2.2.2.凝凝凝凝胶胶胶胶颗颗颗颗粒粒粒粒网网网网络络络络孔孔孔孔径径径径大

17、大大大小小小小非非非非常常常常有有有有限限限限,所所所所以以以以可可可可被被被被纯纯纯纯化化化化的的的的物物物物质质质质的的的的分分分分子子子子量量量量范范范范围围围围受受受受到限制到限制到限制到限制。3.3.3.3.凝凝胶胶结结构构对对某某些些溶溶质质分分子具有吸附作用子具有吸附作用。第25页，此课件共90页哦五、凝胶的结构与性能 1.1.1.1.葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶1959195919591959年年PorathPorath和和和和FlodinFlodinFlodinFlodin合成合成合成合成（商品名为（商品名为（商品名为（商品名为SephadexSephadex）（1 1）结构：）结构

18、：）结构：）结构：基本骨架：基本骨架：基本骨架：基本骨架：葡聚糖（葡聚糖（dextrandextrandextrandextran）交联剂：交联剂：交联剂：交联剂：3-3-氯代氯代-1,2-1,2-1,2-1,2-环氧氯丙环氧氯丙环氧氯丙环氧氯丙烷使葡聚糖之间通过醚键交联烷使葡聚糖之间通过醚键交联聚合而成的聚合而成的聚合而成的聚合而成的三维空间网状结构三维空间网状结构三维空间网状结构三维空间网状结构。第26页，此课件共90页哦（2）特点：交联度：交联度：n n交联剂越多交联剂越多交联度越大交联度越大网孔结构越紧密网孔结构越紧密n n交联剂越少交联剂越少交联度越小交联度越小网孔结构越疏松网孔结构

19、越疏松化学性质：化学性质：稳稳定定,不不溶溶于于水水、盐盐、弱弱酸酸、碱碱和和一一般般有有机机溶溶剂剂,耐耐热耐碱不耐强酸热耐碱不耐强酸第27页，此课件共90页哦（2）特点：SephadexSephadex的分级范围的分级范围 G10 700G10 700G10 700G10 700G15 1,500G15 1,500G15 1,500G15 1,500G25 1,000 5,000G25 1,000 5,000G-50 1,50030,000G-50 1,50030,000G-75 3,00070,000G-75 3,00070,000G100 4,000 150,000G100 4,000

20、 150,000G100 4,000 150,000G100 4,000 150,000G150 5,000 400,000G150 5,000 400,000G150 5,000 400,000G150 5,000 400,000G200 5,000 800,000G200 5,000 800,000G200 5,000 800,000G200 5,000 800,000吸水性吸水性n nG类的型号类的型号表示每克干凝胶吸表示每克干凝胶吸水量（水量（ml）x10如如G-50每克干凝胶吸水每克干凝胶吸水量为量为5ml。第28页，此课件共90页哦n n大孔凝胶大孔凝胶n n工作范围的下限几乎是工

21、作范围的下限几乎是SephadexSephadex的上限的上限的上限的上限n n可分离可分离可分离可分离MW40万以上万以上万以上万以上的物质的物质的物质的物质n n可用来分离核酸及病毒。可用来分离核酸及病毒。2.琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶（商品名为（商品名为Sepharose)3.聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶第29页，此课件共90页哦各种层析胶体：PharmaciaSephadexSepharoseSephacrylSephacelglucoseagaroseglucose+acrylamidecelluloseBio-RadBioGel PBioGel Aacrylamideagarose第30

22、页，此课件共90页哦六六.其它条件选择其它条件选择 1.1.1.1.柱的选择柱的选择柱的选择柱的选择 柱柱柱柱短短短短而而而而粗粗粗粗,则则则则易易易易使使使使样样样样品品品品稀稀稀稀释释释释,柱柱柱柱长长长长而而而而窄窄窄窄,则则则则柱柱柱柱的的的的管管管管壁壁壁壁效效效效应应应应较较较较大大大大,会造成拖尾现象。会造成拖尾现象。会造成拖尾现象。会造成拖尾现象。2.2.2.2.样品的选择：样品的选择：样品的选择：样品的选择：量适当量适当量适当量适当,粘度小粘度小粘度小粘度小。3.3.3.3.洗脱液的选择：洗脱液的选择：洗脱液的选择：洗脱液的选择：每每每每种种种种样样样样品品品品分分分分离离离

23、离所所所所用用用用的的的的缓缓缓缓冲冲冲冲洗洗洗洗脱脱脱脱液液液液应应应应根根根根据据据据使使使使样样样样品品品品稳稳稳稳定定定定的原则使用。的原则使用。的原则使用。的原则使用。七、应用七、应用1.1.1.1.分离纯化分离纯化分离纯化分离纯化 2.2.2.2.脱盐脱盐脱盐脱盐 3.3.3.3.测分子量测分子量测分子量测分子量第31页，此课件共90页哦Elution volume(ml)AlbuminNaClnDesalting in a simple column 第32页，此课件共90页哦测分子量 Velog Mr第33页，此课件共90页哦实验：实验：凝胶层析法分离蛋白质凝胶层析法分离蛋白质

24、第34页，此课件共90页哦血红蛋白血红蛋白64,480二硝基苯二硝基苯-鱼精蛋白鱼精蛋白2,000-12,000SephadexG-50孔径孔径1,500-30,000一、原理：一、原理：Kd=0Kd=0Kd=1Kd=1第35页，此课件共90页哦1、装柱、装柱先用蒸馏水赶走层析柱中的死体积；先用蒸馏水赶走层析柱中的死体积；凝胶不能有气泡和分层现象；凝胶不能有气泡和分层现象；装柱结束后要保持凝胶表面平整。装柱结束后要保持凝胶表面平整。二、操作注意点：二、操作注意点：第36页，此课件共90页哦2、加样、加样、加样、加样使液面和凝胶表面相切，关闭出口；使液面和凝胶表面相切，关闭出口；使液面和凝胶表面

25、相切，关闭出口；使液面和凝胶表面相切，关闭出口；加样时尽量不要破坏凝胶面；加样时尽量不要破坏凝胶面；加样时尽量不要破坏凝胶面；加样时尽量不要破坏凝胶面；让样品进入凝胶以后在加蒸馏水开始洗脱。让样品进入凝胶以后在加蒸馏水开始洗脱。第37页，此课件共90页哦血红蛋白和二硝基苯血红蛋白和二硝基苯-鱼精蛋白的洗脱鱼精蛋白的洗脱体积？体积？柱的外水体积和内水体积柱的外水体积和内水体积三、结果要求：三、结果要求：第38页，此课件共90页哦亲 和 层 析Affinity ChromatographyNi Peihua 第39页，此课件共90页哦一、原理n n亲亲和和层层析析是是利利用用生生物物大大分分子子所

26、所具具有有的的专专一一亲亲和力而设计的纯化技术。和力而设计的纯化技术。n n寻找配基寻找配基n n使配基固定化使配基固定化n n制成亲和层析柱制成亲和层析柱第40页，此课件共90页哦基本过程基本过程+固相化固相化第41页，此课件共90页哦+洗洗洗洗脱脱脱脱吸附吸附第42页，此课件共90页哦解吸+第43页，此课件共90页哦样品样品样品样品固相化 再生第44页，此课件共90页哦第45页，此课件共90页哦第46页，此课件共90页哦酶：酶：基质类似物，抑制剂，辅酶基质类似物，抑制剂，辅酶抗体：抗体：抗体：抗体：抗原，病毒，细胞抗原，病毒，细胞抗原，病毒，细胞抗原，病毒，细胞细胞：细胞：细胞表面特异蛋白

27、，外源凝集素细胞表面特异蛋白，外源凝集素核酸：核酸：核酸：核酸：互补碱基序列，组蛋白，核酸聚合酶，互补碱基序列，组蛋白，核酸聚合酶，互补碱基序列，组蛋白，核酸聚合酶，互补碱基序列，组蛋白，核酸聚合酶，结合结合 蛋白蛋白激素或药物：受体，载体蛋白激素或药物：受体，载体蛋白激素或药物：受体，载体蛋白激素或药物：受体，载体蛋白外源凝集素：多糖，糖蛋白，细胞表面受体，细胞外源凝集素：多糖，糖蛋白，细胞表面受体，细胞外源凝集素：多糖，糖蛋白，细胞表面受体，细胞外源凝集素：多糖，糖蛋白，细胞表面受体，细胞常见具有专一性亲和力的生物分子对：常见具有专一性亲和力的生物分子对：第47页，此课件共90页哦（一）载

28、体的选择1 1、载体要求：、载体要求：（1 1）不溶性）不溶性（2 2）渗透性：疏松网状结构，有良好的液）渗透性：疏松网状结构，有良好的液 体流动性体流动性（3 3）化学和机械性能稳定）化学和机械性能稳定（4 4）具备大量能被活化的基因）具备大量能被活化的基因（5 5）抗微生物和酶的侵蚀）抗微生物和酶的侵蚀第48页，此课件共90页哦2 2、常用载体、常用载体（1 1）纤维素）纤维素 特点：价廉、来源充足特点：价廉、来源充足特点：价廉、来源充足特点：价廉、来源充足 纤维性、非均一性限制大分子的掺入纤维性、非均一性限制大分子的掺入纤维性、非均一性限制大分子的掺入纤维性、非均一性限制大分子的掺入 非

29、专一性吸附严重非专一性吸附严重 用于抗体和酶的纯化用于抗体和酶的纯化（2 2）葡聚糖凝胶）葡聚糖凝胶特点：特点：化学及物理性质稳定化学及物理性质稳定 多孔性比琼脂糖低多孔性比琼脂糖低第49页，此课件共90页哦（3）琼脂糖凝胶浓度浓度 商品商品2 2 Sepharose 2B Sepharose 2B Sepharose 2B Sepharose 2B 4%Sepharose 4B 4%Sepharose 4B 4%Sepharose 4B 4%Sepharose 4B 6%Sepharose 6B6%Sepharose 6B 凝胶浓度越低凝胶浓度越低结构越疏松即多孔性越高结构越疏松即多孔性越高

30、机械强度越低机械强度越低第50页，此课件共90页哦（4 4）聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶（5 5 5 5）多孔玻璃）多孔玻璃特点：不受微生物的侵蚀特点：不受微生物的侵蚀 耐酸、碱、有机溶剂耐酸、碱、有机溶剂耐酸、碱、有机溶剂耐酸、碱、有机溶剂 表面非专一性吸附表面非专一性吸附表面非专一性吸附表面非专一性吸附特点：物理化学性质稳定特点：物理化学性质稳定 抗微生物侵蚀能力比琼脂糖强抗微生物侵蚀能力比琼脂糖强 可供化学反应的可供化学反应的酰胺基较多酰胺基较多酰胺基较多酰胺基较多第51页，此课件共90页哦（二）配基的选择1、对于欲纯化的物质应有专一亲和力、对于欲纯化的物质应有专一亲和力2、必须具备能被

31、修饰的功能基团、必须具备能被修饰的功能基团第52页，此课件共90页哦以酶和底物为例：E+L ELE+L ELE+L ELE+L ELK KL L L L=EL/EL=E=EL/EL=E=EL/EL=E=EL/EL=E0 0-ELL-ELL-ELL-ELL0 0-EL/EL-EL/ELE E E E0 0、L L0 0 0 0：起始浓度：起始浓度：起始浓度：起始浓度当当当当L L0 0 0 0E E E E0 0时时K K K KL L=E=E0 0 0 0-E-EL L L LLL0 0 0 0/E/E/E/EL L EL=EEL=E0 0-E-EL L L LLL0 0 0 0/K/KL L

32、 L LKd=Kd=结合酶结合酶/游离酶游离酶=EL/E=EL/E=EL/E=EL/E0 0-EL=L-EL=L-EL=L-EL=L0 0 0 0/K/KL L L LKLK K K KL L：解离常数：解离常数：解离常数：解离常数 E E E E：酶：酶 L L L L：底物：底物ELEL：复合物：复合物第53页，此课件共90页哦（三）固相化（三）固相化将配体以共价键连接于固相基质上制成固相化吸附剂n n载体的排斥效应载体的排斥效应n n载体的空间障碍载体的空间障碍第54页，此课件共90页哦二、亲和层析分离二、亲和层析分离1 1 1 1、装柱和平衡、装柱和平衡、装柱和平衡、装柱和平衡2 2、

33、上样、亲和吸附、上样、亲和吸附、上样、亲和吸附、上样、亲和吸附3 3 3 3、洗脱、洗脱无效洗脱吸附效率不高有效吸附第55页，此课件共90页哦洗脱方法洗脱方法（1 1）非特异性洗脱：改变）非特异性洗脱：改变洗脱液洗脱液洗脱液洗脱液pHpH值值离子强度离子强度梯度洗脱梯度洗脱梯度洗脱梯度洗脱（2 2）特殊洗脱：当蛋白吸附紧密或上述方法洗脱会引起）特殊洗脱：当蛋白吸附紧密或上述方法洗脱会引起）特殊洗脱：当蛋白吸附紧密或上述方法洗脱会引起）特殊洗脱：当蛋白吸附紧密或上述方法洗脱会引起失活，可用专一的化学方法裂解配基与载体的连接键，再失活，可用专一的化学方法裂解配基与载体的连接键，再失活，可用专一的化

34、学方法裂解配基与载体的连接键，再失活，可用专一的化学方法裂解配基与载体的连接键，再用透析或凝胶层析法去除配基。用透析或凝胶层析法去除配基。用透析或凝胶层析法去除配基。用透析或凝胶层析法去除配基。断键方法：硫酯键、偶氮键、二硫键断键方法：硫酯键、偶氮键、二硫键断键方法：硫酯键、偶氮键、二硫键断键方法：硫酯键、偶氮键、二硫键（3 3）专一性洗脱）专一性洗脱）专一性洗脱）专一性洗脱第56页，此课件共90页哦 已已已已使使使使用用用用过过过过和和和和柱柱柱柱，经经经经过过过过再再再再生生生生处处处处理理理理，去去去去除除除除非非非非特特特特异异异异吸吸吸吸附附附附的杂质后，可重复使用。的杂质后，可重复

35、使用。的杂质后，可重复使用。的杂质后，可重复使用。再生步骤：再生步骤：再生步骤：再生步骤：n n起始缓冲液重复平衡一次起始缓冲液重复平衡一次n n用高离子强度和低离子强度溶液处用高离子强度和低离子强度溶液处n n用弱酸或弱碱溶液处理用弱酸或弱碱溶液处理4 4、亲和柱的再生：、亲和柱的再生：第57页，此课件共90页哦三、特点1、只需一步纯化步骤、只需一步纯化步骤2、产物非常纯、产物非常纯3、可从很稀的溶液中纯化到所需物质、可从很稀的溶液中纯化到所需物质4、还可去除已变性或部分降解物质、还可去除已变性或部分降解物质第58页，此课件共90页哦四、应用1、分离和纯化、分离和纯化2、分辨化学或遗传学上修

36、饰的酶、分辨化学或遗传学上修饰的酶3、纯化亲和标记的活化中心肽段和蛋白质结构、纯化亲和标记的活化中心肽段和蛋白质结构研究研究4、纯化人工合成的多肽和蛋白质、纯化人工合成的多肽和蛋白质5、解释酶作用机理、解释酶作用机理第59页，此课件共90页哦实验分离豌豆凝集素n n载体载体 Sephdax G50Sephdax G50n n配基配基 葡聚糖葡聚糖n n洗脱液洗脱液 1mol/L NaCl1mol/L NaCln n特异性洗脱液特异性洗脱液 1mol/L NaCl1mol/L NaCl 0.2mol/L 0.2mol/L葡萄糖葡萄糖第60页，此课件共90页哦1mol/L NaCl1mol/L N

37、aCl1mol/L NaCl1mol/L NaCl杂蛋白1mol/L NaCl1mol/L NaCl1mol/L NaCl1mol/L NaCl0.2mol/L 0.2mol/L 0.2mol/L 0.2mol/L 葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖豌豆凝集素活性检测活性检测活性检测活性检测与兔红细胞与兔红细胞与兔红细胞与兔红细胞发生凝集反发生凝集反发生凝集反发生凝集反应应应应第61页，此课件共90页哦离子交换层析ion exchange chromatography第62页，此课件共90页哦一、原理 离离子子交交换换层层析析是是用用离离子子交交换换剂剂（具具有有离离子子交交换换性性能能的的物物质质）作

38、作固固定定相相，利利用用它它与与流流动动相相中中的的某某种种离离子子进进行行可可逆逆的的交交换换性性质质来来分分离离子型混合物的层析方法。子型混合物的层析方法。第63页，此课件共90页哦低盐高盐分离结束第64页，此课件共90页哦带电荷不同蛋白在特定不同蛋白在特定pH值下有不同带电性质值下有不同带电性质第65页，此课件共90页哦离子交换树脂如何分离蛋白质离子交换树脂如何分离蛋白质洗脱树脂与树脂结合力第66页，此课件共90页哦二、离子交换剂的类型在在惰性载体惰性载体上引入带有电荷的上引入带有电荷的活性基团活性基团（一）按活性功能基团带电荷性质不同（一）按活性功能基团带电荷性质不同阳离子交换剂阳离子

39、交换剂 带负电荷，与阳离子交换带负电荷，与阳离子交换阴离子交换剂阴离子交换剂带正电荷，与阴离子交换带正电荷，与阴离子交换 阴阴离离子子交交换换树树脂脂对对化化学学试试剂剂及及热热都都不不如如阳阳离子交换树脂稳定。离子交换树脂稳定。胶体胶体第67页，此课件共90页哦1.1.离子交换树脂离子交换树脂：(1)(1)(1)(1)类型类型聚苯乙烯树脂：聚苯乙烯树脂：（二）按载体种类不同二）按载体种类不同苯乙烯苯乙烯二乙烯苯二乙烯苯聚苯乙烯聚苯乙烯母体母体母体母体交联剂交联剂交联剂交联剂第68页，此课件共90页哦聚丙烯酸聚丙烯酸聚丙烯酸聚丙烯酸阳离子交换树脂阳离子交换树脂甲基丙烯酸甲基丙烯酸 二乙烯苯二乙

40、烯苯特点：高交换量特点：高交换量 pH8 pH电电荷高者荷高者离子离子大者大者浓度浓度大者大者第74页，此课件共90页哦（4）离子交换树脂对离子的亲和力阳离子树脂阳离子树脂阳离子树脂阳离子树脂n n电价数：电价数：电价数：电价数：NaNaNaNa+CaCaCaCa+AlAlAlAl+TiTiTiTi+n n原子价数相同，原子序数原子价数相同，原子序数原子价数相同，原子序数原子价数相同，原子序数 Li Li Li Li+NaNaNaNa+KKKK+PbPbPbPb+阴离子阴离子阴离子阴离子n n强碱性交换树脂强碱性交换树脂强碱性交换树脂强碱性交换树脂CHCHCHCH3 3 3 3COOCOOCO

41、OCOO-FFFF-OHOHOHOH-HCOOHCOOHCOOHCOO-CLCLCLCL-SCNSCNSCNSCN-BrBrBrBr-CrOCrOCrOCrO4 4 4 4=NONONONO3 3 3 3-IIII-CCCC2 2 2 2OOOO4 4 4 4=SOSOSOSO4 4 4 4=n n弱碱性交换树脂弱碱性交换树脂弱碱性交换树脂弱碱性交换树脂F F F F-CL CL CL CL-Br Br Br Br-=I=I=I=I-=CH=CH=CH=CH3 3 3 3COOMoCOOMoCOOMoCOOMo4 4 4 4=POPOPOPO4 4 4 4=NONONONO3 3 3 3-酒石

42、酸酒石酸酒石酸酒石酸根根根根柠檬酸根柠檬酸根柠檬酸根柠檬酸根CCCC2 2 2 2OOOO4 4 4 4=SOSOSOSO4 4 4 4=OHOHOH4条件下使用条件下使用条件下使用条件下使用,具有羧甲基具有羧甲基具有羧甲基具有羧甲基 2.2.离子交换纤维素离子交换纤维素第76页，此课件共90页哦3.3.离子交换凝胶离子交换凝胶 分离大分子物质分离大分子物质分离大分子物质分离大分子物质如：葡聚糖（如：葡聚糖（SephadexSephadexSephadexSephadex）聚丙烯酰胺（聚丙烯酰胺（聚丙烯酰胺（聚丙烯酰胺（PAGPAGPAGPAG）琼脂糖（琼脂糖（琼脂糖（琼脂糖（Sepharos

43、eSepharoseSepharoseSepharose）第77页，此课件共90页哦操作过程：操作过程：1.1.装柱；装柱；2.2.离子交换；离子交换；3.3.洗脱洗脱第78页，此课件共90页哦第79页，此课件共90页哦 带带电电荷荷量量少少，亲亲和和力力小小的的先先被被洗洗脱脱下下来来，带带电电荷荷量量多多，亲亲和和力力大大的的后后被被洗洗脱脱下来。下来。第80页，此课件共90页哦三、操作注意点（一）离子交换剂的选择一）离子交换剂的选择原则：原则：根根据据被被分分离离物物质质的的性性质质选选择择同同一一性性质质离离子子交交换换剂剂中中选选用用对对被被分分离离物物质质各各组组分之间结合力分之间

44、结合力差异大差异大的型号交换剂的型号交换剂第81页，此课件共90页哦1.1.被分离物质带何种电荷被分离物质带何种电荷2.2.被分离物质分子的大小被分离物质分子的大小 大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素考虑因素：考虑因素：根据分离过程的实验条件根据分离过程的实验条件 强酸强碱强酸强碱应用广泛应用广泛 弱酸型弱酸型只能在碱性范围内使用只能在碱性范围内使用 弱碱型弱碱型只能在酸性范围内使用只能在酸性范围内使用第82页，此课件共90页哦3.3.被分离物质所处的环境被分离物质所处的环境4.4.被分离物质的物理化学性质被分离物质的物理化学性质5.5.被分离物质的大概数量被

45、分离物质的大概数量第83页，此课件共90页哦原则原则：不能发生化学反应，避免使样品变性不能发生化学反应，避免使样品变性（二）缓冲液的选择（二）缓冲液的选择第84页，此课件共90页哦 原则原则：所所用用洗洗脱脱液液比比吸吸着着物物质质具具有有更更活活泼泼的的离离子子或基团或基团 改变改变pHpH或离子强度或离子强度 增强洗脱液与离子交换剂的结合力增强洗脱液与离子交换剂的结合力 降低分离物与离子交换剂的结合力降低分离物与离子交换剂的结合力 洗脱方式：梯度洗脱洗脱方式：梯度洗脱(三三)洗脱剂洗脱剂第85页，此课件共90页哦四、应用 分分离离多多肽肽蛋蛋白白、氨氨基基酸酸、核核酸酸及及其他带电的生物分子。其他带电的生物分子。第86页，此课件共90页哦实验：实验：离子交换层析分离氨基酸离子交换层析分离氨基酸第87页，此课件共90页哦一、原理：一、原理：Dowex50阳离子交换树脂阳离子交换树脂pH 4.2pH 4.2pI 9.7Mr 147pI 2.97pI 2.97Mr 133+-第88页，此课件共90页哦一、操作注意点：一、操作注意点：1、装柱和加样同凝胶层析、装柱和加样同凝胶层析2、洗脱液、洗脱液(NaOH和柠檬酸和柠檬酸)别混淆别混淆3、控制流速：、控制流速：20滴滴/min第89页，此课件共90页哦感感谢谢大大家家观观看看第90页，此课件共90页哦