蛋白质分离纯化和表征课件.ppt

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1、蛋白质分离纯化和表征蛋白质分离纯化和表征第1页，此课件共36页哦第第7 7章章 蛋白质的分离、纯化和表征蛋白质的分离、纯化和表征 p290p290一、蛋白质的酸碱性质一、蛋白质的酸碱性质 二、蛋白质分子的大小与形状二、蛋白质分子的大小与形状三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀四、蛋白质分离纯化的一般原则四、蛋白质分离纯化的一般原则五、蛋白质的分离纯化方法五、蛋白质的分离纯化方法六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定七、蛋白质性质小结（补充）七、蛋白质性质小结（补充）第2页，此课件共36页哦一、蛋白质的酸碱性质一、蛋白质的酸碱性质 蛋白质分子

2、由氨基酸组成，在蛋白质分子中保存着游离的蛋白质分子由氨基酸组成，在蛋白质分子中保存着游离的-氨基和氨基和-羧基及侧链上的各种功能团，所以其物理化学性质有些羧基及侧链上的各种功能团，所以其物理化学性质有些与氨基酸相同。与氨基酸相同。蛋白质也是一类两性电解质蛋白质也是一类两性电解质，能和酸或碱发生作用。在蛋白质，能和酸或碱发生作用。在蛋白质分子中，可解离基团主要来自侧链上的功能团，这些基团能解分子中，可解离基团主要来自侧链上的功能团，这些基团能解离为带电基团，从而使蛋白质带电荷。离为带电基团，从而使蛋白质带电荷。第3页，此课件共36页哦 在酸性情况下，在酸性情况下，蛋白质中的各碱性基团接受质子，使

3、蛋白质蛋白质中的各碱性基团接受质子，使蛋白质带正电荷；带正电荷；在碱性情况下，在碱性情况下，蛋白质中的各酸性基团解离出质子，使蛋白质蛋白质中的各酸性基团解离出质子，使蛋白质带负电荷。带负电荷。在某一在某一pHpH值时值时，白质所带的正电荷与负电荷恰好相等，即净，白质所带的正电荷与负电荷恰好相等，即净电荷为零，此时溶液的电荷为零，此时溶液的pHpH值就是蛋白质的值就是蛋白质的等电点等电点。每种蛋白质都有它特有的等电点每种蛋白质都有它特有的等电点，这也是鉴别蛋白质的指标，这也是鉴别蛋白质的指标之一。之一。等电点和蛋白质分子中所含氨基酸的种类有关等电点和蛋白质分子中所含氨基酸的种类有关 中性中性 碱

4、性碱性 酸性。酸性。第4页，此课件共36页哦蛋白质的酸性氨基酸和碱性氨基酸含量蛋白质的酸性氨基酸和碱性氨基酸含量 与等电点的关系与等电点的关系 蛋白质蛋白质酸性氨基酸酸性氨基酸每摩尔残基数每摩尔残基数碱性氨基酸碱性氨基酸每摩尔残基数每摩尔残基数碱性碱性/酸性酸性等电点等电点37胃蛋白酶胃蛋白酶60.21.0血清蛋白血清蛋白血红蛋白血红蛋白核糖核酸酶核糖核酸酶82991.24.753881.76.77202.99.5第5页，此课件共36页哦二、蛋白质分子的大小与形状二、蛋白质分子的大小与形状 (一一)根据化学组成测定最低相对分子质量根据化学组成测定最低相对分子质量 (二二)渗透压法测定相对分子质

5、量渗透压法测定相对分子质量（三（三)蛋白质的扩散和扩散系数蛋白质的扩散和扩散系数 (四四)沉降分析法测定相对分子质量沉降分析法测定相对分子质量 (五五)凝胶过滤法测定相对分子质量凝胶过滤法测定相对分子质量 (六六)SDS)SDS酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量 (七七)蛋白质分子的形状蛋白质分子的形状第6页，此课件共36页哦(一一)根据化学组成根据化学组成 测定最低相对分子质量测定最低相对分子质量 用化学分析方法测定出蛋白质某一微量元素（如铁）的含量，并假设蛋白质分子中只有一个铁原子，则可计算出蛋白质的相对分子质量。例 肌红蛋白含铁量为0.335%，其最低相对分子质

6、量可按下式计算:铁的原子量 最低相对分子质量=100 铁的百分含量 =(55.8/0.335)100 =16700 注：真实的Mr(相对分子质量)为最低相对分子质量的n倍(n=1，2，3 )第7页，此课件共36页哦(二二)渗透压法测定相对分子质量渗透压法测定相对分子质量 渗透压渗透压:为了制止溶液与纯溶剂之间的净移动所需施加为了制止溶液与纯溶剂之间的净移动所需施加于溶液的压力，它是单位体积内溶质质点数的函数，与溶于溶液的压力，它是单位体积内溶质质点数的函数，与溶质的性质和形状无关。质的性质和形状无关。优点优点:所用实验装置简单所用实验装置简单 准确度不亚于其他方法准确度不亚于其他方法 缺点缺点

7、:蛋白质的渗透压受蛋白质的渗透压受PHPH影响，只有蛋白质分子处于等影响，只有蛋白质分子处于等电点时，测定的渗透压才不受缓冲液中无机离子的影响。电点时，测定的渗透压才不受缓冲液中无机离子的影响。需要纯品。需要纯品。P292 图图7-1第8页，此课件共36页哦 蛋白质的相对分子量可以直接用沉降蛋白质的相对分子量可以直接用沉降系数表示。一般把单位离心场里的沉降速度称系数表示。一般把单位离心场里的沉降速度称为沉降系数。为沉降系数。沉降系数沉降系数 用用s s表示。表示。一个一个s s单位：为单位：为110110-13-13秒秒,810 810-13-13秒用秒用8s8s表示。表示。超速离心机最初是超

8、速离心机最初是SvedbergSvedberg于于19401940年设年设计制造的。计制造的。沉降分析法测定相对分子质量沉降分析法测定相对分子质量第9页，此课件共36页哦（1 1）沉降速度法）沉降速度法 把蛋白质样品放在离心机中，在离心力的作用下，把蛋白质样品放在离心机中，在离心力的作用下，蛋白质分子沿旋转中心向四周移动，并产生沉降界面，蛋白质分子沿旋转中心向四周移动，并产生沉降界面，界面的移动速度代表蛋白质的移动速度。在界面处由于界面的移动速度代表蛋白质的移动速度。在界面处由于浓度差造成折射率不同，可借助适当的光学系统，分析浓度差造成折射率不同，可借助适当的光学系统，分析计算蛋白质的分子量。

9、计算蛋白质的分子量。第10页，此课件共36页哦 利用沉降平衡法测定分子量是在较低速度的离心力场进行的。以较低速度较长时间离心，使拟分析的物质沉降与扩散间达到平衡，离心期间不形成界面，只表现浓度梯度曲线的曲率。离心开始时，分子颗粒发生沉降，由于沉降的结果造成浓度梯度，因而产生分子扩散作用，扩散力的作用方向和离心力相反。（2）沉降平衡法）沉降平衡法第11页，此课件共36页哦三、蛋白质的胶体性质三、蛋白质的胶体性质 与蛋白质的沉淀与蛋白质的沉淀 (一一)蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质 (二二)蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀第12页，此课件共36页哦(一一)蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质 蛋白质蛋白质是

10、高分子化合物，由于相对分子质量大，是高分子化合物，由于相对分子质量大，它它在水溶液中所形成的颗粒具有胶体溶液的特征在水溶液中所形成的颗粒具有胶体溶液的特征如如布朗运动、丁道尔现象、电泳现象，不能透过半透布朗运动、丁道尔现象、电泳现象，不能透过半透膜以及具有吸附能力等。膜以及具有吸附能力等。利用蛋白质不能透过半透膜的性质利用蛋白质不能透过半透膜的性质，可用羊皮，可用羊皮纸、火棉胶、玻璃纸等纸、火棉胶、玻璃纸等来分离纯化蛋白质，这个方来分离纯化蛋白质，这个方法称为法称为透析法透析法。第13页，此课件共36页哦蛋白质溶液是胶体溶液（如血清、蛋清）蛋白质溶液是胶体溶液（如血清、蛋清）胶体条件：胶体条件

11、：1.1.大小：大小：1-100nm1-100nm 2.2.有水膜：有水膜：表面有许多极性、亲水基团表面有许多极性、亲水基团(-NH(-NH3 3、-COOH-COOH、-OH-OH、-SH-SH、-CONH-CONH2 2等）。等）。3.3.带相同的电荷带相同的电荷（同性相斥）（同性相斥）第14页，此课件共36页哦(二二)蛋白质的沉淀反应蛋白质的沉淀反应 如果在蛋白质溶液中加入适当的试剂，破坏了蛋白质的水膜或如果在蛋白质溶液中加入适当的试剂，破坏了蛋白质的水膜或中和了蛋白质的电荷，则蛋白质胶体溶液就不稳定而出现沉淀现中和了蛋白质的电荷，则蛋白质胶体溶液就不稳定而出现沉淀现象。象。蛋白质可因加

12、入下列试剂而产生沉淀。蛋白质可因加入下列试剂而产生沉淀。1 1、加高浓度盐类、加高浓度盐类 2 2、加有机溶剂、加有机溶剂 3 3、加重金属盐、加重金属盐 4 4、加某些酸类或生物碱试剂、加某些酸类或生物碱试剂 5 5、加热变性沉淀、加热变性沉淀第15页，此课件共36页哦加高浓度盐类加高浓度盐类 硫酸铵硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等可以破坏蛋白质胶体周围的、硫酸钠、氯化钠等可以破坏蛋白质胶体周围的水膜，同时又中和了蛋白质分子的电荷，因此使蛋白质产生水膜，同时又中和了蛋白质分子的电荷，因此使蛋白质产生沉淀，沉淀，这种加盐使蛋白质沉淀析出的现象，称为这种加盐使蛋白质沉淀析出的现象，称为盐析盐析。盐析盐析

13、法是分离制备蛋白质的常用方法。法是分离制备蛋白质的常用方法。根据各种蛋白质的颗粒大小、亲水性的程度不同，在盐根据各种蛋白质的颗粒大小、亲水性的程度不同，在盐析时需要盐的浓度也不一致。因此，析时需要盐的浓度也不一致。因此，这种调节中性盐的浓度这种调节中性盐的浓度使蛋白溶液中的几种蛋白质分段析出的方法称使蛋白溶液中的几种蛋白质分段析出的方法称分段盐析法分段盐析法。第16页，此课件共36页哦加有机溶剂加有机溶剂 酒精、丙酮等可使蛋白质产生沉淀，这是由于酒精、丙酮等可使蛋白质产生沉淀，这是由于这些有机溶剂和水有较强的作用，破坏了蛋白质分这些有机溶剂和水有较强的作用，破坏了蛋白质分子周围的水膜，因此发生

14、沉淀反应。子周围的水膜，因此发生沉淀反应。第17页，此课件共36页哦加重金属盐加重金属盐 氯化高汞、硝酸银、醋酸铅及三氯化铁等，因为蛋氯化高汞、硝酸银、醋酸铅及三氯化铁等，因为蛋白质在碱性溶液中带负离子，可与这些重金属的正离子作白质在碱性溶液中带负离子，可与这些重金属的正离子作用而生成不易溶解的盐而沉淀。用而生成不易溶解的盐而沉淀。碱性条件下碱性条件下第18页，此课件共36页哦加某些酸类或生物碱试剂加某些酸类或生物碱试剂 酸性条件下酸性条件下 加苦味酸、单宁酸、三氯乙酸等能和蛋白加苦味酸、单宁酸、三氯乙酸等能和蛋白质化合成不溶解的蛋白质盐而沉淀。质化合成不溶解的蛋白质盐而沉淀。生物碱试剂是指能

15、引起生物碱沉淀的一类试剂，生物碱试剂是指能引起生物碱沉淀的一类试剂，如鞣酸、苦味酸、碘化钾等。如鞣酸、苦味酸、碘化钾等。酸性条件下酸性条件下第19页，此课件共36页哦加热变性沉淀加热变性沉淀 几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。少量的盐类促几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。少量的盐类促进蛋白质加热凝固。当蛋白质处于等电点时，加热凝固最进蛋白质加热凝固。当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全最迅速。完全最迅速。加热变性引起蛋白质凝固沉淀的原因加热变性引起蛋白质凝固沉淀的原因可能是由于热变可能是由于热变性使蛋白质天然结构解体，疏水基外露，破坏了水化层。性使蛋白质天然结构解体，疏水基外露，破坏了水化

16、层。第20页，此课件共36页哦五、蛋白质的分离纯化方法五、蛋白质的分离纯化方法蛋白质的分离纯化依据（一）根据分子大小不同的纯化方法（二）利用溶解度差别的纯化方法（三）根据电荷不同的纯化方法（四）利用选择性吸附的纯化方法第21页，此课件共36页哦（一）根据分子大小不同的纯化方法（一）根据分子大小不同的纯化方法 1 1、透析和超过滤：、透析和超过滤：利用蛋白质分子不能通过半透膜而与小分子分利用蛋白质分子不能通过半透膜而与小分子分离。离。2 2、密度梯度离心：、密度梯度离心：蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快

17、，且每种蛋白质质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，且每种蛋白质颗粒沉降到与其自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后颗粒沉降到与其自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离成不同的区带。各种蛋白质在离心管中被分离成不同的区带。3 3、凝胶过滤、凝胶过滤第22页，此课件共36页哦凝胶过滤：凝胶过滤：即分子排阻层析。即分子排阻层析。凝胶颗粒内部为凝胶颗粒内部为多孔的网状结构。多孔的网状结构。大分子最先流出大分子最先流出层析柱。层析柱。大分大分子子 小分小分子子葡聚糖葡聚糖小株小株第23页，此课件共36页哦（二）利用溶解度差别的纯化方法（二）利用溶解度

18、差别的纯化方法1、等电点沉淀和、等电点沉淀和PH过滤过滤2、蛋白质的盐溶和盐析：中性盐在低浓度时可增加蛋白质的溶解度，、蛋白质的盐溶和盐析：中性盐在低浓度时可增加蛋白质的溶解度，即即盐溶盐溶。原因是蛋白质分子吸附盐类离子后，带电层使蛋白质。原因是蛋白质分子吸附盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而与水分子相互作用加强；当分子彼此排斥，而与水分子相互作用加强；当离子强度离子强度增大到增大到足够高时，此时与蛋白质疏水基团接触的足够高时，此时与蛋白质疏水基团接触的自由水自由水被移去以溶化盐离被移去以溶化盐离子，导致蛋白质疏水基团暴露，使蛋白质因疏水作用凝聚沉淀，即子，导致蛋白质疏水基团暴露，使蛋

19、白质因疏水作用凝聚沉淀，即盐析盐析。3、有机溶剂分级分离法：一是降低介质的、有机溶剂分级分离法：一是降低介质的介电常数介电常数，二是与蛋白质争，二是与蛋白质争夺水膜水。夺水膜水。4、温度对蛋白质溶解度的影响：低温稳定，高温不稳定。在、温度对蛋白质溶解度的影响：低温稳定，高温不稳定。在040，大部分球状蛋白质溶解度随温度升高而增加。，大部分球状蛋白质溶解度随温度升高而增加。第24页，此课件共36页哦 一、一、测定含量方法：测定含量方法：1.1.凯氏定氮法：凯氏定氮法：灵敏度较低灵敏度较低 2.2.双缩脲法双缩脲法 0.20.2 1.7mg/L1.7mg/L；3.Folin-3.Folin-酚法（

20、酚法（LowryLowry法）：法）：2525 g g 250250 g/mlg/ml 4.4.紫外吸收法、染料结合法和胶体金测定法等。紫外吸收法、染料结合法和胶体金测定法等。二、二、测定纯度方法：测定纯度方法：六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定第25页，此课件共36页哦样品量样品量0.20.2 1.7mg/L1.7mg/L；双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物。双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物。将尿素加热到将尿素加热到180180，则两分子尿素缩合成一分，则两分子尿素缩合成一分子双缩脲，并放出一分子氨。子双缩脲，并放出一分子氨。双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应产

21、生双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应产生红紫色络和物红紫色络和物，此反应称双缩脲反应此反应称双缩脲反应 双缩脲法双缩脲法第26页，此课件共36页哦 在碱性条件下磷钼酸、磷钨酸混合试剂与酪在碱性条件下磷钼酸、磷钨酸混合试剂与酪氨酸上的酚发生反应，生成蓝色化合物，将其氨酸上的酚发生反应，生成蓝色化合物，将其与与双缩脲法结合双缩脲法结合起来，蛋白质形成两种颜色的混合起来，蛋白质形成两种颜色的混合物老绿色，在物老绿色，在650nm650nm具有特定的吸收。具有特定的吸收。Folin-酚法（酚法（Lowry法）法）第27页，此课件共36页哦考马斯亮蓝法（考马斯亮蓝法（Bradford法）法）考马斯亮蓝考马

22、斯亮蓝G G250250是一种带有负电荷的染料，在是一种带有负电荷的染料，在酸性条件下，可与蛋白质上的正电荷结合，形成酸性条件下，可与蛋白质上的正电荷结合，形成蓝色化合物，在蓝色化合物，在595595nmnm具有特定吸收，反应简便、具有特定吸收，反应简便、快速、灵敏度高，快速、灵敏度高，5 5 5050 g/mlg/ml。第28页，此课件共36页哦 由于核酸在由于核酸在260nm260nm具有光吸收，对测定具有光吸收，对测定干扰较大，可采用干扰较大，可采用280280nmnm、260nm260nm同测法。同测法。蛋白质浓度蛋白质浓度（mg/mlmg/ml）1.45A1.45A280280-0.

23、74A-0.74A260260 紫外吸收法紫外吸收法第29页，此课件共36页哦（二）蛋白质纯度鉴定（二）蛋白质纯度鉴定 纯度和分子量的测定：纯度和分子量的测定：采用电泳（如聚丙烯采用电泳（如聚丙烯酰胺凝胶电泳，梯度凝胶电泳等）、高速离心、分酰胺凝胶电泳，梯度凝胶电泳等）、高速离心、分子筛层析、高效液相色谱等技术测定。子筛层析、高效液相色谱等技术测定。等电点的测定：等电点的测定：利用等电聚焦方法测定。利用等电聚焦方法测定。亚基个数的测定：亚基个数的测定：采用采用SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电聚丙烯酰胺凝胶电泳方法测定。泳方法测定。第30页，此课件共36页哦加入的固体的蛋白质的量加入的固体的蛋白质的

24、量溶溶解解的的蛋蛋白白质质的的量量恒定浓度法鉴定蛋白纯度恒定浓度法鉴定蛋白纯度纯的蛋白一个拐点纯的蛋白一个拐点第31页，此课件共36页哦七、蛋白质性质小结七、蛋白质性质小结1 1、蛋白质的分子量、蛋白质的分子量2 2、蛋白质的两性电离及等电点、蛋白质的两性电离及等电点3 3、蛋白质的胶体性质、蛋白质的胶体性质4 4、蛋白质的沉淀反应、蛋白质的沉淀反应5 5、蛋白质的变性、蛋白质的变性6 6、蛋白质的颜色反应、蛋白质的颜色反应(补充）补充）第32页，此课件共36页哦蛋白质的变性蛋白质的变性 天然蛋白质分子受到某些物理因素如：热、紫外线、高压和表面张天然蛋白质分子受到某些物理因素如：热、紫外线、高

25、压和表面张力或化学因素的作用时，生物活性丧失，溶解度降低，不对称性增力或化学因素的作用时，生物活性丧失，溶解度降低，不对称性增高以及其他的物理化学因素发生改变，这种过程称为高以及其他的物理化学因素发生改变，这种过程称为变性作用变性作用。蛋白质变性过程中，往往出现以下现象蛋白质变性过程中，往往出现以下现象：（1 1）生物活性丧失；）生物活性丧失；（2 2）一些侧链基团暴露；）一些侧链基团暴露；（3 3）物理化学性质改变；）物理化学性质改变；（4 4）生物化学性质发生改变，分子结构伸展疏松，易为蛋白水解）生物化学性质发生改变，分子结构伸展疏松，易为蛋白水解酶分解。酶分解。第33页，此课件共36页哦

26、1、双、双缩脲缩脲反反应应2、米、米伦伦氏反氏反应应3、乙、乙醛醛酸反酸反应应4、坂口反、坂口反应应5、酚、酚试剂试剂（福林（福林试剂试剂）反）反应应蛋白质的颜色反应蛋白质的颜色反应第34页，此课件共36页哦双缩脲反应双缩脲反应 双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物。将尿素加热到双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物。将尿素加热到180，则两分子尿素缩合成一分子双缩脲，并放出一分子氨。，则两分子尿素缩合成一分子双缩脲，并放出一分子氨。双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应产生红紫色络和物，此反双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应产生红紫色络和物，此反应称双缩脲反应。应称双缩脲反应。第35页，此课件共36页哦米伦试剂反应米伦试剂反应 米伦试剂为硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸和亚硝酸的混合液，蛋白质米伦试剂为硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸和亚硝酸的混合液，蛋白质溶液加入米伦试剂后即产生白色沉淀，加热后沉淀变成红色。酚类化溶液加入米伦试剂后即产生白色沉淀，加热后沉淀变成红色。酚类化合物有此反应，酪氨酸含有酚基，故酪氨酸及含有酪氨酸的蛋白质都合物有此反应，酪氨酸含有酚基，故酪氨酸及含有酪氨酸的蛋白质都有此反应有此反应。Tyr +米伦试剂米伦试剂 红色红色 （硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸、亚硝酸硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸、亚硝酸 )第36页，此课件共36页哦