细胞因子的检测和应用 (2)课件.ppt

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1、关于细胞因子的检测和应用(2)现在学习的是第1页，共46页发展历史和命名 19661966年年年年 -巨噬巨噬细细胞移胞移动动抑制因子抑制因子 1969196919691969年提出了年提出了年提出了年提出了“淋巴因子淋巴因子淋巴因子淋巴因子”的的的的概概概概念念念念 此后，又提出了此后，又提出了“单单单单核因子核因子核因子核因子”的的的的概概概概念念念念(由于如此由于如此由于如此由于如此众众众众多的免疫活性因子的多的免疫活性因子的多的免疫活性因子的多的免疫活性因子的发现发现发现发现，且，且，且，且鉴鉴鉴鉴于于于于对对对对其其其其本本本本质质质质尚尚尚尚不不不不清清清清楚，均以其生物楚，均以其

2、生物楚，均以其生物楚，均以其生物学学学学活性命名，致使活性命名，致使活性命名，致使活性命名，致使这这这这些因些因些因些因子的名子的名子的名子的名称称称称相相相相当当当当混混混混乱乱乱乱。)1979 1979 1979 1979年在瑞士召年在瑞士召年在瑞士召年在瑞士召开开开开的第二的第二的第二的第二届届届届淋巴因子淋巴因子淋巴因子淋巴因子国国国国际际际际会会会会议议议议上提出了上提出了上提出了上提出了白白白白细细细细胞介素的胞介素的胞介素的胞介素的概概概概念念念念,并并按按发现顺发现顺序以阿拉伯序以阿拉伯数数字排列。字排列。尚尚尚尚有其有其有其有其它它它它细细细细胞分泌的活性介胞分泌的活性介胞分

3、泌的活性介胞分泌的活性介质质质质，如，如，如，如IFN-IFN-IFN-IFN-和和和和IFNIFNIFNIFN 分分分分别别别别由白由白由白由白细细细细胞和胞和胞和胞和纤维纤维纤维纤维母母母母细细细细胞胞胞胞产产产产生。目前生。目前生。目前生。目前将将将将所有所有所有所有这这这这些因子些因子些因子些因子统统统统称称称称为为为为细细细细胞因子。胞因子。胞因子。胞因子。现在学习的是第2页，共46页概述 概念概念概念概念 细胞因子（细胞因子（细胞因子（细胞因子（cytokinecytokine）是指由活化的免疫细胞（包是指由活化的免疫细胞（包是指由活化的免疫细胞（包是指由活化的免疫细胞（包括淋巴细

4、胞和非淋巴细胞）和某些基质细胞分泌的、括淋巴细胞和非淋巴细胞）和某些基质细胞分泌的、括淋巴细胞和非淋巴细胞）和某些基质细胞分泌的、括淋巴细胞和非淋巴细胞）和某些基质细胞分泌的、介导和调节免疫应答及炎症反应的小分子多肽类因子，介导和调节免疫应答及炎症反应的小分子多肽类因子，介导和调节免疫应答及炎症反应的小分子多肽类因子，介导和调节免疫应答及炎症反应的小分子多肽类因子，它们是除免疫球蛋白和补体之外的另一类非特异性免它们是除免疫球蛋白和补体之外的另一类非特异性免它们是除免疫球蛋白和补体之外的另一类非特异性免它们是除免疫球蛋白和补体之外的另一类非特异性免疫效应物质疫效应物质疫效应物质疫效应物质 。产生

5、细胞因子的细胞种类产生细胞因子的细胞种类产生细胞因子的细胞种类产生细胞因子的细胞种类很多，但归纳起来主要有三类：很多，但归纳起来主要有三类：很多，但归纳起来主要有三类：很多，但归纳起来主要有三类：活活活活化的免疫细胞，包括淋巴细胞、单核巨噬细胞、大颗粒淋化的免疫细胞，包括淋巴细胞、单核巨噬细胞、大颗粒淋化的免疫细胞，包括淋巴细胞、单核巨噬细胞、大颗粒淋化的免疫细胞，包括淋巴细胞、单核巨噬细胞、大颗粒淋巴细胞、粒细胞、肥大细胞等；巴细胞、粒细胞、肥大细胞等；巴细胞、粒细胞、肥大细胞等；巴细胞、粒细胞、肥大细胞等；基质细胞类，包括骨髓和基质细胞类，包括骨髓和基质细胞类，包括骨髓和基质细胞类，包括骨

6、髓和胸腺的基质细胞、内皮细胞、上皮细胞、纤维母细胞、中枢胸腺的基质细胞、内皮细胞、上皮细胞、纤维母细胞、中枢胸腺的基质细胞、内皮细胞、上皮细胞、纤维母细胞、中枢胸腺的基质细胞、内皮细胞、上皮细胞、纤维母细胞、中枢神经系统的小胶质细胞等；神经系统的小胶质细胞等；神经系统的小胶质细胞等；神经系统的小胶质细胞等；某些肿瘤细胞系。某些肿瘤细胞系。某些肿瘤细胞系。某些肿瘤细胞系。产生：产生：产生：产生：抗原、致分裂原、感染、炎症等多种因素可刺激细胞因抗原、致分裂原、感染、炎症等多种因素可刺激细胞因抗原、致分裂原、感染、炎症等多种因素可刺激细胞因抗原、致分裂原、感染、炎症等多种因素可刺激细胞因子的产生，各

7、细胞因子之间也有相互刺激合成和分泌的作用。子的产生，各细胞因子之间也有相互刺激合成和分泌的作用。子的产生，各细胞因子之间也有相互刺激合成和分泌的作用。子的产生，各细胞因子之间也有相互刺激合成和分泌的作用。现在学习的是第3页，共46页共同特点共同特点 1)1)正常休止状态的正常休止状态的正常休止状态的正常休止状态的细胞必须经刺激和活化后才能合成和分泌细胞必须经刺激和活化后才能合成和分泌细胞必须经刺激和活化后才能合成和分泌细胞必须经刺激和活化后才能合成和分泌CKs,CKs,细胞内无细胞因子前体储存细胞内无细胞因子前体储存细胞内无细胞因子前体储存细胞内无细胞因子前体储存,接受刺激后从激活基因开始至合

8、接受刺激后从激活基因开始至合接受刺激后从激活基因开始至合接受刺激后从激活基因开始至合成成成成,分泌分泌分泌分泌,刺激结束后细胞因子的产生随即停止刺激结束后细胞因子的产生随即停止刺激结束后细胞因子的产生随即停止刺激结束后细胞因子的产生随即停止.。2 2）绝大多数绝大多数绝大多数绝大多数CKsCKs均为低分子量（均为低分子量（均为低分子量（均为低分子量（4 480kD80kD）的）的）的）的糖蛋白糖蛋白糖蛋白糖蛋白。3 3）分泌特性：分泌特性：分泌特性：分泌特性：大多数的大多数的大多数的大多数的CKsCKs是通过旁分泌（是通过旁分泌（是通过旁分泌（是通过旁分泌（paracrineparacrine

9、），或自，或自，或自，或自分泌（分泌（分泌（分泌（autocrineautocrine），少部分通过内分泌的形式作用于远处靶细），少部分通过内分泌的形式作用于远处靶细），少部分通过内分泌的形式作用于远处靶细），少部分通过内分泌的形式作用于远处靶细胞或靶器官；胞或靶器官；胞或靶器官；胞或靶器官；4 4）多样性：）多样性：）多样性：）多样性：一种细胞可产生多种细胞因子，不同类型细胞也一种细胞可产生多种细胞因子，不同类型细胞也一种细胞可产生多种细胞因子，不同类型细胞也一种细胞可产生多种细胞因子，不同类型细胞也可产生一种或几种相同的细胞因子。可产生一种或几种相同的细胞因子。可产生一种或几种相同的细胞因

10、子。可产生一种或几种相同的细胞因子。5 5）网络性：）网络性：）网络性：）网络性：协同效应；重叠效应；拮抗效应。协同效应；重叠效应；拮抗效应。协同效应；重叠效应；拮抗效应。协同效应；重叠效应；拮抗效应。6 6）高效性：）高效性：）高效性：）高效性：它们的受体亲和力高，表现很强的生物学活性，它们的受体亲和力高，表现很强的生物学活性，它们的受体亲和力高，表现很强的生物学活性，它们的受体亲和力高，表现很强的生物学活性，是免疫球蛋白等分子远不能及的是免疫球蛋白等分子远不能及的是免疫球蛋白等分子远不能及的是免疫球蛋白等分子远不能及的 。7)7)非特异性非特异性非特异性非特异性:细胞因子多由免疫细胞在特定

11、抗原或丝裂原刺激下所产细胞因子多由免疫细胞在特定抗原或丝裂原刺激下所产细胞因子多由免疫细胞在特定抗原或丝裂原刺激下所产细胞因子多由免疫细胞在特定抗原或丝裂原刺激下所产生生生生,但其对靶细胞发挥功能却为非特异性但其对靶细胞发挥功能却为非特异性但其对靶细胞发挥功能却为非特异性但其对靶细胞发挥功能却为非特异性,也不受也不受也不受也不受MHCMHC限制限制限制限制.现在学习的是第4页，共46页 3分类白细胞介素（interferon）IL 干扰素（interferon）IFN 肿瘤坏死因子（TNF）集落刺激因子（CSF）生长因子（grow factor）GF 趋化因子 现在学习的是第5页，共46页受受

12、体体检检测测技技 术术 生物学生物学细细胞胞增增殖殖靶靶细细胞胞杀杀伤伤 趋趋化化活活性性诱诱导导产产物物细细胞胞病病变变抑抑制制分子生物学分子生物学DNARNA检测检测ELISA免疫学免疫学流流式式细细胞胞技技术术现在学习的是第6页，共46页生物学检测法生物学检测法(1)细胞增殖法细胞增殖法依赖细胞株依赖细胞株：许多细胞因子具有细胞生长因子活性，许多细胞因子具有细胞生长因子活性，利用这一特性，现已筛选出一些对特定细胞因子起利用这一特性，现已筛选出一些对特定细胞因子起反应的细胞，并建立了只依赖于某种因子的细胞系，反应的细胞，并建立了只依赖于某种因子的细胞系，即依赖细胞株（简称依赖株）。即依赖细

13、胞株（简称依赖株）。这些依赖株在通常这些依赖株在通常情况下不能存活，只有在加入特定因子后才能增情况下不能存活，只有在加入特定因子后才能增殖。殖。例如例如IL-2依赖株依赖株CTLL-2在不含在不含IL-2的培养基的培养基中很快死亡，而加入中很快死亡，而加入IL-2后则可在体外长期培养。后则可在体外长期培养。在一定浓度范围内，细胞增殖与在一定浓度范围内，细胞增殖与IL-2量成正比。量成正比。除依赖株外，还有一些短期培养的细胞，如胸腺细胞、骨髓细胞、促有丝除依赖株外，还有一些短期培养的细胞，如胸腺细胞、骨髓细胞、促有丝除依赖株外，还有一些短期培养的细胞，如胸腺细胞、骨髓细胞、促有丝除依赖株外，还有

14、一些短期培养的细胞，如胸腺细胞、骨髓细胞、促有丝分裂原刺激后的淋巴母细胞等，均可作为靶细胞来测定某种因子活性。分裂原刺激后的淋巴母细胞等，均可作为靶细胞来测定某种因子活性。分裂原刺激后的淋巴母细胞等，均可作为靶细胞来测定某种因子活性。分裂原刺激后的淋巴母细胞等，均可作为靶细胞来测定某种因子活性。现在学习的是第7页，共46页3H-TdR掺入法原理：将原理：将3H-TdR作为作为DNA合成的原料掺合成的原料掺入到新增殖的细胞中，细胞入到新增殖的细胞中，细胞DNA合成的增合成的增加或减少而间接判断细胞增殖的方法，而加或减少而间接判断细胞增殖的方法，而用放射物质标记的胸腺嘧啶则可代表细胞用放射物质标记

15、的胸腺嘧啶则可代表细胞DNA的增值程度，通过与细胞因子标准品的增值程度，通过与细胞因子标准品比较，而推算出待测标本中细胞因子的含比较，而推算出待测标本中细胞因子的含量。量。现在学习的是第8页，共46页步骤：步骤：1 1依赖细胞株的培养。用血细胞计数仪测定细胞密度，取依赖细胞株的培养。用血细胞计数仪测定细胞密度，取适当体积的细胞用于测定。用适当体积的细胞用于测定。用基础培养液基础培养液基础培养液基础培养液洗细胞两次后，测定细胞洗细胞两次后，测定细胞活力（应活力（应80%80%），并以），并以测定培养液测定培养液测定培养液测定培养液重悬细胞至合适终浓度用以重悬细胞至合适终浓度用以测定。表提供了参考

16、。测定。表提供了参考。用细胞因子标准品建立一个标准曲线，并设置已知含测定培用细胞因子标准品建立一个标准曲线，并设置已知含测定培养液的质控孔。养液的质控孔。适当稀释待测标本，加入微孔板中双份重复测定。适当稀释待测标本，加入微孔板中双份重复测定。每孔中加入细胞悬液，置于湿润的每孔中加入细胞悬液，置于湿润的COCO2 2培养箱中培养箱中培养。培养。（培养时间按所用细胞株而定）（培养时间按所用细胞株而定）加入加入3 3H H标记的胸腺嘧啶，在置于标记的胸腺嘧啶，在置于COCO2 2培养箱中培养箱中培养约培养约4h4h。收集细胞于玻璃纤维滤纸上，是用液体闪烁仪测定放射活性。收集细胞于玻璃纤维滤纸上，是用

17、液体闪烁仪测定放射活性。此方法优点是易于自动化，测定的信噪比最好，可常规用于大标本此方法优点是易于自动化，测定的信噪比最好，可常规用于大标本量的测定。缺点是使用放射性核素，试验废物处理麻烦。量的测定。缺点是使用放射性核素，试验废物处理麻烦。现在学习的是第9页，共46页MTT法法MTTMTT（四唑盐）比色法是一种检测细胞存活和增殖（四唑盐）比色法是一种检测细胞存活和增殖的方法，所用的显色剂是一种能接受氢原子的化合的方法，所用的显色剂是一种能接受氢原子的化合物物MTTMTT。原理是，活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶能将淡黄色的原理是，活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶能将淡黄色的原理是，活细胞内线粒体琥珀酸脱氢

18、酶能将淡黄色的原理是，活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶能将淡黄色的MTTMTT还原为蓝紫色的结晶还原为蓝紫色的结晶还原为蓝紫色的结晶还原为蓝紫色的结晶formazan，后者的产量与活，后者的产量与活，后者的产量与活，后者的产量与活细胞数成正相关。细胞数成正相关。细胞数成正相关。细胞数成正相关。formazan可用可用可用可用DMSODMSO、无水乙醇或、无水乙醇或、无水乙醇或、无水乙醇或酸化异丙醇等溶解，在酶标仪上以波长酸化异丙醇等溶解，在酶标仪上以波长酸化异丙醇等溶解，在酶标仪上以波长酸化异丙醇等溶解，在酶标仪上以波长620nm进行比进行比色。所检测的色。所检测的ODOD值的大小可反应细胞代谢活性

19、的强弱。值的大小可反应细胞代谢活性的强弱。值的大小可反应细胞代谢活性的强弱。值的大小可反应细胞代谢活性的强弱。优点：灵敏度高，操作简便，自动化。优点：灵敏度高，操作简便，自动化。缺点：影响因素多，重复性较差。缺点：影响因素多，重复性较差。注意：注意：注意：注意：MTTMTT有毒性致突变性，操作时应注意防护。有毒性致突变性，操作时应注意防护。有毒性致突变性，操作时应注意防护。有毒性致突变性，操作时应注意防护。现在学习的是第10页，共46页(2)靶细胞杀伤法靶细胞杀伤法 根据某些细胞因子（如根据某些细胞因子（如TNF）能在体外杀伤靶）能在体外杀伤靶细胞而设计的检测方法。通常靶细胞多选择细胞而设计的

20、检测方法。通常靶细胞多选择体外长期传代的肿瘤细胞株体外长期传代的肿瘤细胞株，利用同位素方法，利用同位素方法或颜料染色等方法判定细胞的杀伤率。一般活或颜料染色等方法判定细胞的杀伤率。一般活细胞的检测可采用染料甲紫、萘酚蓝黑、细胞的检测可采用染料甲紫、萘酚蓝黑、MTT等使细胞着色，再用脱色液将燃料脱出，然后用等使细胞着色，再用脱色液将燃料脱出，然后用酶标仪比色来反映细胞存活状态。酶标仪比色来反映细胞存活状态。现在学习的是第11页，共46页培养孔特定细胞株加入TNF37 MTT酶标仪比色吸光度与细胞因子的量成吸光度与细胞因子的量成反比，用细胞因子标准品反比，用细胞因子标准品稀释度作线性曲线，便可稀释

21、度作线性曲线，便可得到特定细胞因子的含量。得到特定细胞因子的含量。现在学习的是第12页，共46页(3)趋化活性测定法 本法主要用于趋化因子和本法主要用于趋化因子和IL-8的生物学活性测定。趋化的生物学活性测定。趋化性细胞因子主要由白细胞与造血微环境中的基质细胞性细胞因子主要由白细胞与造血微环境中的基质细胞分泌，可结合在内皮细胞的表面，具有对中性粒细胞、分泌，可结合在内皮细胞的表面，具有对中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、巨噬细胞的趋化性单核细胞、淋巴细胞、巨噬细胞的趋化性（chemotaxis）和化学增活性（）和化学增活性（chemokinesis）。）。趋化性趋化性指趋化因子诱导细胞有趋化因子

22、浓度指趋化因子诱导细胞有趋化因子浓度低的地方向浓度高的地方移动的特性，可采用琼低的地方向浓度高的地方移动的特性，可采用琼脂糖和微孔小室趋化试验测定；化学增活性是指脂糖和微孔小室趋化试验测定；化学增活性是指其增强细胞运动能力的特性，可采用琼脂糖小滴其增强细胞运动能力的特性，可采用琼脂糖小滴化学动力学实验测定。化学动力学实验测定。现在学习的是第13页，共46页35m孔径的微孔滤膜靶细胞滤液受检的趋化因子 温育数小时取膜固定、干燥、着染、脱色将透明后的滤膜置油镜下检测细胞在膜内通过距离，求其趋化单位滤膜微孔小室法滤膜微孔小室法现在学习的是第14页，共46页细胞悬液对照培养液趋化因子或待测液将含小牛血

23、清的1%琼脂糖倾于平皿，如上图操作后经 温育后，用2%戊二醛固定，除去琼脂糖层，经染色后，测量细胞运动的距离，计算移动指数。移动指数=趋化移动距离/任意移动距离琼琼脂脂糖糖平平板板法法现在学习的是第15页，共46页(4)细胞因子诱导的产物分析法细胞因子诱导的产物分析法某些细胞因子可刺激特定细胞产生生物活性物某些细胞因子可刺激特定细胞产生生物活性物质，如质，如IL-2诱导骨髓细胞合成组胺、诱导骨髓细胞合成组胺、IL-6诱诱导肝细胞合成导肝细胞合成a1-抗胰蛋白酶等。通过测定所抗胰蛋白酶等。通过测定所诱生的相应产物，可反映细胞因子的活性诱生的相应产物，可反映细胞因子的活性(5)细胞病变抑制法细胞病

24、变抑制法 病毒可造成靶细胞的损伤，干扰素等则可抑制病毒可造成靶细胞的损伤，干扰素等则可抑制病毒所导致的细胞病变，因此可利用细胞病变病毒所导致的细胞病变，因此可利用细胞病变抑制法检测这类因子。抑制法检测这类因子。现在学习的是第16页，共46页免疫学检测法免疫学检测法 细胞因子均为蛋白或多肽，具有较强的抗原性。随着重组细胞因子的出现，可较方便制得细胞因子的特异性抗血清或单克隆抗体，因此尽管细胞因子的种类繁多，只要获得了针对某一因子的特异性抗体（包括多克隆抗体或单克隆抗体）均可采用相似的技术开展工作。常用的方法有ELISA、RIA及免疫印迹法等。目前，几乎所有常见细胞因子的检测试剂盒均有商品供应。现

25、在学习的是第17页，共46页流式细胞技术flow cytometry 可以测定单个细胞因子产生特性。原理：荧光素标记的细胞因子特异的单克隆抗体，在一定条件下，与活化的靶细胞内的特异细胞因子结合，然后用流式细胞仪分析荧光标记的阳性细胞百分率和平均荧光强度，其与细胞内细胞因子的含量成正比。现在学习的是第18页，共46页流式细胞术检测细胞内细胞因子流式细胞术检测细胞内细胞因子 cytokines in cell Detection cytokines in cell Detection by flow cytometryby flow cytometry 分离待测细胞分离待测细胞分离待测细胞分离待测

26、细胞活化细胞（活化细胞（活化细胞（活化细胞（莫能菌素（莫能菌素（莫能菌素（莫能菌素（monensin)和布雷和布雷菲尔德菌素）菲尔德菌素）封闭细胞表面封闭细胞表面封闭细胞表面封闭细胞表面FcFcFcFc受体受体（脱脂奶）（脱脂奶）细胞表面抗原染色细胞表面抗原染色细胞表面抗原染色细胞表面抗原染色固定和通透细胞膜固定和通透细胞膜固定和通透细胞膜固定和通透细胞膜（多聚甲醛）（多聚甲醛）（多聚甲醛）（多聚甲醛）细胞内细胞因子染色细胞内细胞因子染色细胞内细胞因子染色细胞内细胞因子染色流式细胞分析流式细胞分析流式细胞分析流式细胞分析现在学习的是第19页，共46页现在学习的是第20页，共46页分子生物学检测

27、法(DNA)提取细胞基因组的提取细胞基因组的提取细胞基因组的提取细胞基因组的DNADNA，将其用限制性，将其用限制性核酸内切酶切，核酸内切酶切，再做琼脂糖凝胶电泳将酶切再做琼脂糖凝胶电泳将酶切再做琼脂糖凝胶电泳将酶切再做琼脂糖凝胶电泳将酶切DNADNA片断分离，片断分离，将经变性的将经变性的DNA片断转移到硝酸纤维素膜片断转移到硝酸纤维素膜片断转移到硝酸纤维素膜片断转移到硝酸纤维素膜上，上，上，上，用相应细胞因子的核酸探针来检测其特定用相应细胞因子的核酸探针来检测其特定用相应细胞因子的核酸探针来检测其特定用相应细胞因子的核酸探针来检测其特定DNADNA序列结构。序列结构。序列结构。序列结构。可

28、进行基因的定性及定量、可进行基因的定性及定量、基因突变分析基因突变分析及及限制性片断长度多态性分析（限制性片断长度多态性分析（RLFPRLFP）等）等）等）等 。SOUTHERN BLOT现在学习的是第21页，共46页重物500g吸水纸滤纸转移膜凝胶滤纸杂交缓冲液玻璃支撑Southern blot现在学习的是第22页，共46页分子生物学检测法聚合酶链反应（PCR）PCRPCR可用于检测细胞因子基因有无缺失、突变，当有缺失可用于检测细胞因子基因有无缺失、突变，当有缺失时则缺少扩增的时则缺少扩增的DNADNA片断，而当基因突变时可产生新片断，而当基因突变时可产生新的酶切位点或原有的内切酶位点丧失，

29、经的酶切位点或原有的内切酶位点丧失，经RLFP或或PCRPCR结合序列特异寡核苷酸探针斑点杂交分析可发现突变结合序列特异寡核苷酸探针斑点杂交分析可发现突变的基因，如严格控制杂交及洗膜条件，可发现单个碱的基因，如严格控制杂交及洗膜条件，可发现单个碱基的突变；还可应用基的突变；还可应用PCR结合序列特异引物及上述两种方法检测某些细胞因子的多态性。现在学习的是第23页，共46页实时荧光实时荧光PCR技术技术特点：实时（特点：实时（real time)测定测定，靶核酸扩增和，靶核酸扩增和产物检测同时完成，扩增管在整个测定过程中完产物检测同时完成，扩增管在整个测定过程中完全处于闭管状态，不容易出现扩增产

30、物对实验室全处于闭管状态，不容易出现扩增产物对实验室的的“污染污染”，对实验技术人员的测定操作及实验，对实验技术人员的测定操作及实验室设置的要求都相室设置的要求都相 对要低一些。对要低一些。TaqMan技术技术“分子信标分子信标”技术技术现在学习的是第24页，共46页TaqMan技术技术oCH2OPOH5端标记报告荧光端标记报告荧光3端标记淬灭荧光端标记淬灭荧光没有杂交，没有杂交，距离近而距离近而发生荧光发生荧光能量转移能量转移样本中原始模板的数量与荧光强度超出选定阈样本中原始模板的数量与荧光强度超出选定阈值时的扩增循环数（值时的扩增循环数（Ct)Ct)成反比成反比TaqMan聚合酶聚合酶现在

31、学习的是第25页，共46页“分子信标”技术53现在学习的是第26页，共46页分子生物学检测法(mRNA)Northern印迹杂交本方法有一定的限制性，因为mRNA的稳定性及其降解的稳定性及其降解速率直接影响细胞内速率直接影响细胞内mRNA的积累量的积累量，因此用细胞总RNA作Northern印迹杂交，其结果不能完全反映mRNA的转录活性。反转录PCR（RT-PCR）细胞因子的mRNA寿命短、拷贝数低，难以在小量样本中进行检测。RT-PCR能检测细胞内低丰度特异mRNA的方法。现在学习的是第27页，共46页原位杂交将标记的特异原位杂交将标记的特异DNADNA或或RNARNA探探针与细胞内染色体上

32、相应的针与细胞内染色体上相应的DNADNA形成稳形成稳定的杂交体。此法可用于细胞因子基因定的杂交体。此法可用于细胞因子基因的组织细胞及染色体定位。的组织细胞及染色体定位。原位原位PCRPCR原位杂交的应用受到其敏原位杂交的应用受到其敏感性的影响，而细胞因子的基因均为单感性的影响，而细胞因子的基因均为单拷贝，有时不能被检出。原位拷贝，有时不能被检出。原位PCRPCR就是就是以特定的以特定的DNADNA或或RNARNA为模板，在细胞核内为模板，在细胞核内原位进行扩增。而扩增产物因分子较大，原位进行扩增。而扩增产物因分子较大，或互相交织，不宜透过细胞膜而保留在原或互相交织，不宜透过细胞膜而保留在原位

33、。在应用原位杂交技术将其检出。位。在应用原位杂交技术将其检出。现在学习的是第28页，共46页细胞因子受体检测技术 细胞因子的生物学活性是通过其相应的受体发细胞因子的生物学活性是通过其相应的受体发挥作用的，细胞因子受体检测已成为基础和临挥作用的，细胞因子受体检测已成为基础和临床免疫学研究的重要内容。本节主要介绍细胞床免疫学研究的重要内容。本节主要介绍细胞因子受体检测的基本方法。因子受体检测的基本方法。活细胞吸收试验活细胞吸收试验将过量的待测细胞与有限将过量的待测细胞与有限的细胞因子共育，若细胞膜表面存在相应的的细胞因子共育，若细胞膜表面存在相应的受体即可吸收细胞因子，通过测定回收后细受体即可吸收

34、细胞因子，通过测定回收后细胞因子生物活性丧失情况可确定受体是否存胞因子生物活性丧失情况可确定受体是否存在。此法简便，适用于定性。在。此法简便，适用于定性。现在学习的是第29页，共46页细胞因子受体检测技术放射性核素标记重组配体的放射受体分析放射性核素标记重组配体的放射受体分析本方法是确定细胞受体分布及其特性的主要本方法是确定细胞受体分布及其特性的主要方法，可测定受体的数量及亲和力。通常采用放方法，可测定受体的数量及亲和力。通常采用放射性核素示踪，如体外射性核素示踪，如体外标记重组细胞因子标记重组细胞因子，通，通过生物合成的标记重组细胞因子的功能不受过生物合成的标记重组细胞因子的功能不受影响，影

35、响，受体单克隆抗体标记分析技术受体单克隆抗体标记分析技术 抗细胞因子受体抗细胞因子受体的的McAbMcAb既可封闭受体抑制相应细胞因子的生物既可封闭受体抑制相应细胞因子的生物活性，也可用标记的活性，也可用标记的McAbMcAb直接做免疫放射受体直接做免疫放射受体分析或免疫共沉淀。分析或免疫共沉淀。现在学习的是第30页，共46页细胞因子受体检测技术受体受体cDNAcDNAcDNAcDNA分析分析分析分析 酶免疫技术检测法酶免疫技术检测法酶免疫技术检测法酶免疫技术检测法 某些细胞因子受体除存在于细某些细胞因子受体除存在于细某些细胞因子受体除存在于细某些细胞因子受体除存在于细胞膜外，尚可分泌进入体液

36、，称为可溶性细胞因子胞膜外，尚可分泌进入体液，称为可溶性细胞因子胞膜外，尚可分泌进入体液，称为可溶性细胞因子胞膜外，尚可分泌进入体液，称为可溶性细胞因子受体（受体（受体（受体（soluble cytokine receptorsoluble cytokine receptorsoluble cytokine receptorsoluble cytokine receptor）,如如如如sIL-2RsIL-2RsIL-2RsIL-2R、sIL-4RsIL-4RsIL-4RsIL-4R和和和和sIFN-RsIFN-RsIFN-RsIFN-R。这类受体多采用。这类受体多采用。这类受体多采用。这类受体

37、多采用ELISAELISA法检测。法检测。重组细胞因子与受体的交联分析重组细胞因子与受体的交联分析 利用化学交利用化学交联剂将标记的重组细胞因子与膜受体交联，细胞联剂将标记的重组细胞因子与膜受体交联，细胞裂解物经裂解物经PAGEPAGEPAGEPAGE电泳后作放射自显影分析，通过带型电泳后作放射自显影分析，通过带型电泳后作放射自显影分析，通过带型电泳后作放射自显影分析，通过带型分析可确定受体的分子量及亚单位。分析可确定受体的分子量及亚单位。分析可确定受体的分子量及亚单位。分析可确定受体的分子量及亚单位。现在学习的是第31页，共46页三种细胞因子测定方法的比较三种细胞因子测定方法的比较 生物学检

38、测法：比较敏感，直接测定生物学功能，生物学检测法：比较敏感，直接测定生物学功能，可靠，但需培养依赖性细胞株、耗时长、步骤繁，可靠，但需培养依赖性细胞株、耗时长、步骤繁，影响因素多，不易掌握。影响因素多，不易掌握。免疫学检测法：操作较简便、快速、重复性好、尚可免疫学检测法：操作较简便、快速、重复性好、尚可免疫学检测法：操作较简便、快速、重复性好、尚可免疫学检测法：操作较简便、快速、重复性好、尚可测定特定细胞或亚群产生细胞因子的含量，但敏感度测定特定细胞或亚群产生细胞因子的含量，但敏感度测定特定细胞或亚群产生细胞因子的含量，但敏感度测定特定细胞或亚群产生细胞因子的含量，但敏感度比生物学法低比生物学

39、法低比生物学法低比生物学法低1010010100倍。免疫学检测法检测的是倍。免疫学检测法检测的是细胞因子蛋白质的抗原性，可能是无活性的变性细胞因子蛋白质的抗原性，可能是无活性的变性分子或细胞因子的裂解片断分子或细胞因子的裂解片断 。分分分分子子子子生生生生物物物物学学学学检检检检测测测测法法法法：只只只只能能能能代代代代表表表表基基基基因因因因表表表表达达达达情情情情况况况况，不不不不能能能能提提提提供细胞因子的浓度及活性等资料。供细胞因子的浓度及活性等资料。供细胞因子的浓度及活性等资料。供细胞因子的浓度及活性等资料。现在学习的是第32页，共46页生物学活性法生物学活性法免疫学检测法免疫学检测

40、法原理原理生物学活性水平生物学活性水平特异性结合反应特异性结合反应敏感性敏感性一般较高一般较高(受体受体)一般较低一般较低(加放大系统加放大系统可明显升高可明显升高)特异性特异性低低高高(识别类型、亚型识别类型、亚型)(不能不能)(有可能有可能)周期周期较长较长短短培养条件培养条件大大小小指示细胞敏感性差异指示细胞敏感性差异大大/指示细胞突变指示细胞突变可发生可发生/生物学作用相同因子扰生物学作用相同因子扰大大小小样品中特异性或非特异性样品中特异性或非特异性抑制物干扰抑制物干扰大大小小重复性重复性较差较差较好较好标准化、大量检测标准化、大量检测困难困难容易容易现在学习的是第33页，共46页细胞

41、因子测定的临床应用原则细胞因子测定的临床应用原则应使用多种方法测定应使用多种方法测定测定标本选择适当（血液、局部炎症分泌测定标本选择适当（血液、局部炎症分泌物、细胞、疾病的动态观察）物、细胞、疾病的动态观察）同时测定多种细胞因子（了解同时测定多种细胞因子（了解T细胞、巨细胞、巨噬细胞、和上皮样细胞分泌细胞因子的功噬细胞、和上皮样细胞分泌细胞因子的功能）能）现在学习的是第34页，共46页细胞因子测定的临床应用细胞因子测定的临床应用特定疾病的辅助诊断特定疾病的辅助诊断评估机体的免疫状态评估机体的免疫状态临床疾病的治疗应用临床疾病的治疗应用临床疾病的预防应用临床疾病的预防应用现在学习的是第35页，共

42、46页细胞因子测定的临床应用现状细胞因子测定的临床应用现状虽然已知较多的细胞因子，但仅仅少数用于临床常规检查，虽然已知较多的细胞因子，但仅仅少数用于临床常规检查，虽然已知较多的细胞因子，但仅仅少数用于临床常规检查，虽然已知较多的细胞因子，但仅仅少数用于临床常规检查，如如如如IL-6IL-6IL-6IL-6、IL-8IL-8IL-8IL-8、TNF-TNF-TNF-TNF-。由由由由于于于于细细细细胞胞胞胞因因因因子子子子的的的的基基基基因因因因多多多多效效效效性性性性和和和和复复复复杂杂杂杂性性性性，并并并并无无无无哪哪哪哪一一一一种种种种细细细细胞胞胞胞因因因因子子子子能能能能作作作作为为为

43、为某一特定疾病的标志。某一特定疾病的标志。某一特定疾病的标志。某一特定疾病的标志。由于某一细胞因子稳态的漂移和疾病的特异性损伤有关，因此对于由于某一细胞因子稳态的漂移和疾病的特异性损伤有关，因此对于由于某一细胞因子稳态的漂移和疾病的特异性损伤有关，因此对于由于某一细胞因子稳态的漂移和疾病的特异性损伤有关，因此对于评价一种疾病的活动状况是非常重要的评价一种疾病的活动状况是非常重要的评价一种疾病的活动状况是非常重要的评价一种疾病的活动状况是非常重要的 新新新新生生生生儿儿儿儿败败败败血血血血症症症症患患患患者者者者出出出出生生生生后后后后几几几几小小小小时时时时，IL-6IL-6IL-6IL-6和

44、和和和IL-8IL-8IL-8IL-8升升升升高高高高，这这这这项项项项检检检检查查查查具具具具有有有有较较较较高高高高的的的的临临临临床床床床灵灵灵灵敏敏敏敏度度度度和和和和特特特特异异异异性性性性，而而而而使使使使用用用用传传传传统统统统的的的的急急急急性性性性相相相相蛋蛋蛋蛋白白白白如如如如CRPCRPCRPCRP则要在则要在则要在则要在2448244824482448小时才升高。小时才升高。小时才升高。小时才升高。测定体液中炎症相关的细胞因子也具有临床意义。测定体液中炎症相关的细胞因子也具有临床意义。测定体液中炎症相关的细胞因子也具有临床意义。测定体液中炎症相关的细胞因子也具有临床意义

45、。现在学习的是第36页，共46页粘附分子粘附分子的检测及应用的检测及应用尹向飞尹向飞现在学习的是第37页，共46页细胞粘附分子（细胞粘附分子（细胞粘附分子（细胞粘附分子（cell adhesioncell adhesionmolecules,CAMmolecules,CAMmolecules,CAMmolecules,CAM）是众多介导细胞间或细胞与细）是众多介导细胞间或细胞与细）是众多介导细胞间或细胞与细）是众多介导细胞间或细胞与细胞外基质（胞外基质（胞外基质（胞外基质（extracellular matrix,ECMextracellular matrix,ECMextracellular

46、 matrix,ECMextracellular matrix,ECM）间相）间相）间相）间相互接触和结合分子的统称。互接触和结合分子的统称。互接触和结合分子的统称。互接触和结合分子的统称。粘附分子以受体配体结合的形式发挥作用，粘附分子以受体配体结合的形式发挥作用，是细胞与细胞间，细胞与基质间，或细胞是细胞与细胞间，细胞与基质间，或细胞基质细胞间发生粘附，参与细胞的识基质细胞间发生粘附，参与细胞的识别，细胞的活化和信号转导，细胞的增值别，细胞的活化和信号转导，细胞的增值与分化，细胞的伸展与移动，是免疫应答、与分化，细胞的伸展与移动，是免疫应答、免疫发生、凝血、肿瘤转移以及创伤愈合免疫发生、凝血

47、、肿瘤转移以及创伤愈合等一系列重要生理和病理过程的分子基础。等一系列重要生理和病理过程的分子基础。现在学习的是第38页，共46页分类：据结构特征可分为整合素家族、选择素分类：据结构特征可分为整合素家族、选择素家族、免疫球蛋白超家（家族、免疫球蛋白超家（IgSFIgSF）、钙粘蛋）、钙粘蛋白家族等。白家族等。存在形式：细胞膜表面表达和可溶性两种存在形式：细胞膜表面表达和可溶性两种形式。形式。含量：正常情况下可溶性粘附分子含量很含量：正常情况下可溶性粘附分子含量很低，在病理情况下由于细胞因子、内毒低，在病理情况下由于细胞因子、内毒素或凝血酶的参与，细胞膜表面的素或凝血酶的参与，细胞膜表面的释放或合

48、成无跨膜区和胞质区的小分子释放或合成无跨膜区和胞质区的小分子量。量。现在学习的是第39页，共46页手术切片、细胞（淋巴、手术切片、细胞（淋巴、内皮细胞等）、组织细内皮细胞等）、组织细胞提取物、血液或其他胞提取物、血液或其他体液等。体液等。测定测定标本标本检测现状检测现状目前的检测方法，大多限于用目前的检测方法，大多限于用免疫学技术检测其数量，而有免疫学技术检测其数量，而有关分子的亲和力及扩散速率的关分子的亲和力及扩散速率的检测方法正在建立中。检测方法正在建立中。现在学习的是第40页，共46页细胞表面粘附分子的检测 1放射免疫测定法 2免疫荧光测定法 3酶免疫测定法主要为双抗体夹心ELISA，本

49、法应用最广，但仅能检出一群细胞的表面粘附分子数量，而不能反映单个细胞粘附分子数量的变化。可溶性粘附分子的检测 多采用双抗体夹心ELISA，研究最多的是选 择素家族和免疫球蛋白超家族。现在学习的是第41页，共46页分子生物学方法PCR-SSCP方法PCR-RFLP方法实时荧光PCR方法现在学习的是第42页，共46页PCR-RFLP方法原理：特定的限制性核酸内切酶在DNA中有特定的识别位点，所以DNA被水解后的片断长度变化可反映DNA种特定区域的结构改变。限制性核酸内切酶琼脂糖或PEGA电泳southernsouthern转移转移标记探针杂交，测定标记探针杂交，测定现在学习的是第43页，共46页细

50、胞粘附分子测定的应用细胞粘附分子测定的应用对疾病发生发展机制的探讨疾病的临床诊断及预后指标炎症肿瘤转移同种器官移植排斥 现在学习的是第44页，共46页可溶性粘附分子测定的应用：可溶性粘附分子测定的应用：选择素家族有选择素家族有E E、L L、P P三型，均可见血液中。溶血三型，均可见血液中。溶血性尿毒症和血小板减少性紫癜患者血液中，性尿毒症和血小板减少性紫癜患者血液中，P P选选择素比正常人高择素比正常人高-倍，而败血症、倍，而败血症、HIVHIV感染感染和艾滋病患者血液中和艾滋病患者血液中L L选择素明显增高。血液中选择素明显增高。血液中存在可溶性存在可溶性E E选择素是内皮细胞激活的的证据