细胞工程单克隆抗体与抗体工程课件.ppt

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1、细胞工程单克隆抗体与抗体工程第1页，此课件共29页哦一：细胞融合一：细胞融合1：细胞融合技术定义与应用价值：细胞融合技术定义与应用价值n细细胞胞融融合合（cell cell fusionfusion）又又称称体体细细胞胞杂杂交交（somatic somatic hybridizationhybridization）或或细细胞胞杂杂交交（cell cell hybridizationhybridization），是是指指在在离离体体条条件件下下用用人人工工方方法法将将不不同同种种生生物物或或同同种种生生物物不不同同类类型型的的单单细细胞胞通通过过无无性性方方式式融融合合成成一一个个杂杂合合细细胞

2、胞的的技技术术。利利用用细细胞胞融融合合技技术术使使不不同同的的细细胞胞融融合合成成一一个个新新的的杂杂合合细细胞胞，这这个个新新的的细细胞胞就就获获得得了了两两个个亲亲本本细细胞胞的的遗遗传信息和细胞质，从而具备有两个亲本细胞的优点。传信息和细胞质，从而具备有两个亲本细胞的优点。第2页，此课件共29页哦细胞融合技术的应用价值细胞融合技术的应用价值 n细胞融合能重新组合两个亲本细胞的优细胞融合能重新组合两个亲本细胞的优良遗传信息，是研究细胞间遗传信息传良遗传信息，是研究细胞间遗传信息传递、基因在染色体上定位、改良动物遗递、基因在染色体上定位、改良动物遗传特性、及创造新的符合人类需要的新传特性、

3、及创造新的符合人类需要的新的细胞系的极为有效的手段。的细胞系的极为有效的手段。第3页，此课件共29页哦植物细胞融合与人造小鼠培育过程植物细胞融合与人造小鼠培育过程第4页，此课件共29页哦细胞融合过程细胞融合过程三个阶段三个阶段n融合前准备融合前准备n细胞融合细胞融合n及融合后的细胞管理及融合后的细胞管理第5页，此课件共29页哦融合前准备融合前准备 n主要包括细胞培养材料准备、选择免主要包括细胞培养材料准备、选择免疫动物、抗原及免疫方案设计等；疫动物、抗原及免疫方案设计等；第6页，此课件共29页哦细胞融合细胞融合 n一个相对简单的过程，包括骨髓瘤细胞一个相对简单的过程，包括骨髓瘤细胞准备、脾细胞

4、分离、融合操作等。准备、脾细胞分离、融合操作等。n用用于于细细胞胞融融合合的的融融合合剂剂可可以以是是病病毒毒、化化学试剂，或采用电融合技术进行融合。学试剂，或采用电融合技术进行融合。n在在最最近近的的二二十十多多年年来来，细细胞胞融融合合技技术术有有了了长长足足的的发发展展，其其本本身身也也已已成成为为一一们们专专门门的的技技术术在在生生命命科科学学领领域域中中发发挥挥巨巨大大作作用。用。第7页，此课件共29页哦融合后的管理融合后的管理 n对融合细胞进行筛选与克隆、优良细胞对融合细胞进行筛选与克隆、优良细胞传代与保存等；传代与保存等；第8页，此课件共29页哦细胞融合的关键技术方法细胞融合的关

5、键技术方法n1）动动物物选选择择、免免疫疫方方案案设设计计、免免疫疫途途径确定径确定n2）亲亲本本细细胞胞准准备备、融融合合技技术术（条条件件、物质手段、融合管理）电融合技术物质手段、融合管理）电融合技术细细 胞胞 克克 隆隆：有有 限限 稀稀 释释 法法（limited limited dilution dilution technologytechnology）和和 软软 琼琼 脂脂 法法（soft agar cloning technologysoft agar cloning technology）n3）融合后细胞管理融合后细胞管理第9页，此课件共29页哦细胞融合技术最有意义的成果之一

6、就是单细胞融合技术最有意义的成果之一就是单克隆抗体的制备。克隆抗体的制备。n单克隆抗体在生物、农业、医疗、单克隆抗体在生物、农业、医疗、制药等众多领域得到极为广泛的制药等众多领域得到极为广泛的应用；尤其是人源性单克隆抗体应用；尤其是人源性单克隆抗体制备技术的发展，使单克隆抗体制备技术的发展，使单克隆抗体具有更高的实用价值。具有更高的实用价值。第10页，此课件共29页哦单克隆抗体技术1：抗体的结构与功能：抗体的结构与功能第11页，此课件共29页哦抗体的结构抗体的结构第12页，此课件共29页哦抗体的功能抗体的功能抗原结合活性和特异性（抗原结合活性和特异性（Fab）激活肌体免疫反应（激活肌体免疫反应

7、（Fc）激活补体系统激活补体系统 介导介导ADCC、K、NK毒性反应毒性反应 与激活与激活Fc-R结合结合 第13页，此课件共29页哦杂交瘤技术原理与过程杂交瘤技术原理与过程 第14页，此课件共29页哦杂交瘤技术原理杂交瘤技术原理n利利用用两两种种细细胞胞突突变变株株，一一株株为为TK-TK-、HGPRT+HGPRT+，另另一一株株为为HGPRT-HGPRT-、TK+TK+。在在一一般般培培养养条条件件下下，细细胞胞可可利利用用主主要要途途径径合合成成DNADNA，这这些些突突变变细细胞胞能能正正常常生生长长。当当主主要要途途径径被被氨氨基基碟碟呤呤阻阻断断时时，这这两两株株细细胞胞不不能能增

8、增殖殖；如如将将这这两两株株细细胞胞融融合合，则则只只有有异异核核体体杂杂交交瘤瘤细细胞胞能能在在HATHAT培培养养基基上上存存活活，因因为为两两种种细细胞胞相相互互补补充充了了另另一一种种细细胞胞缺缺失失的的酶酶；而而未未融融合合的的细细胞胞或或自自身身融融合合的同核体细胞仍然是而的同核体细胞仍然是而TK-TK-或或HGPRT-HGPRT-而被淘汰。而被淘汰。第15页，此课件共29页哦杂交瘤技术过程杂交瘤技术过程第16页，此课件共29页哦 单克隆抗体的改造与应用单克隆抗体的改造与应用第17页，此课件共29页哦1：单克隆抗体靶向技术与：单克隆抗体靶向技术与 靶向单抗应用靶向单抗应用 n单克隆

9、抗体靶向制剂单克隆抗体靶向制剂利用抗体的特利用抗体的特异性，将药物连接到抗体上，在特定的异性，将药物连接到抗体上，在特定的部位发挥作用的制剂。部位发挥作用的制剂。n制备方法制备方法：与药物直接连接与药物直接连接McAb 小分子小分子 药物药物 大分子大分子 药物药物第18页，此课件共29页哦应用：应用：特异性溶解血栓药物特异性溶解血栓药物抗肿瘤药物抗肿瘤药物其它药物其它药物第19页，此课件共29页哦2：人源性单抗的制备方法：人源性单抗的制备方法 EBV转化技术转化技术 EBV转化转化-融合技术融合技术 嵌合抗体技术嵌合抗体技术 改型抗体技术改型抗体技术 噬菌体抗体库技术噬菌体抗体库技术 第20

10、页，此课件共29页哦EBV转化技术转化技术第21页，此课件共29页哦EBV转化转化-融合技术融合技术第22页，此课件共29页哦嵌合抗体技术嵌合抗体技术n人人-鼠嵌合抗体就是用人源性抗体的一鼠嵌合抗体就是用人源性抗体的一部分代替鼠源性抗体的一部分，使之保部分代替鼠源性抗体的一部分，使之保留对抗原的特异性，又具备与补体和细留对抗原的特异性，又具备与补体和细胞结合的功能，并减少异源性蛋白的抗胞结合的功能，并减少异源性蛋白的抗原性。研究人员设想，用人源性基因代原性。研究人员设想，用人源性基因代替鼠源性抗体基因中的替鼠源性抗体基因中的FcFc区。因为区。因为FcFc区区的主要功能是激活机体免疫反应，也是

11、的主要功能是激活机体免疫反应，也是产生人抗鼠反应的部分。研究人员利用产生人抗鼠反应的部分。研究人员利用编码人抗体编码人抗体FcFc区的区的DNADNA片段替换鼠源性的片段替换鼠源性的FcFc段段DNADNA。第23页，此课件共29页哦嵌合抗体技术嵌合抗体技术n嵌合改型抗体嵌合改型抗体 鼠源性抗原决定簇鼠源性抗原决定簇 鼠源性可变区鼠源性可变区n人鼠源性抗体高变区人抗体人鼠源性抗体高变区人抗体第24页，此课件共29页哦改型抗体技术改型抗体技术n嵌合抗体由鼠可变区与人稳定区组合而成，因而仍嵌合抗体由鼠可变区与人稳定区组合而成，因而仍有一定的免疫原性。为降低来自小鼠可变区中骨架有一定的免疫原性。为降

12、低来自小鼠可变区中骨架区的免疫原性，区的免疫原性，WinterWinter等克隆出鼠源抗体中与抗原等克隆出鼠源抗体中与抗原结合的三个互补决定区（结合的三个互补决定区（CDRCDR）基因用以置换人抗）基因用以置换人抗体中相应序列。由于这种抗体绝大部分为人源性，体中相应序列。由于这种抗体绝大部分为人源性，只有只有CDRCDR区来自小鼠，因而称为区来自小鼠，因而称为CDRCDR移植抗体（移植抗体（CDR CDR grafted antibodygrafted antibody）。这种抗体在人体内免疫性。这种抗体在人体内免疫性大为降低大为降低 第25页，此课件共29页哦改型抗体技术改型抗体技术 鼠源性

13、基因 人源性基因第26页，此课件共29页哦噬菌体抗体库技术噬菌体抗体库技术n将从人或小鼠将从人或小鼠B B淋巴细胞中分离的淋巴细胞中分离的mRNAmRNA逆转录成逆转录成cDNAcDNA，用，用PCRPCR扩增编码轻链和重链的扩增编码轻链和重链的cDNAcDNA；然后用限制；然后用限制性内切酶酶解扩增的性内切酶酶解扩增的cDNAcDNA片段，克隆到丝状噬菌体片段，克隆到丝状噬菌体质粒载体中，与丝状噬菌体蛋白质粒载体中，与丝状噬菌体蛋白基因连接成融合基因连接成融合基因，经辅助噬菌体感染大肠杆菌后，携带有表达基因，经辅助噬菌体感染大肠杆菌后，携带有表达载体的大肠杆菌就会释放外壳上带有抗体片段的噬载

14、体的大肠杆菌就会释放外壳上带有抗体片段的噬菌体；再用菌体；再用ELISAELISA或免疫亲和层析法即可筛选出特异或免疫亲和层析法即可筛选出特异性抗体性抗体。第27页，此课件共29页哦噬噬菌菌体体抗抗体体库库技技术术B B淋巴细胞淋巴细胞分离的分离的mRNAmRNA逆转录成逆转录成cDNAcDNAPCRPCR扩增编码轻链扩增编码轻链和重链的和重链的cDNAcDNA限制性内切酶酶解限制性内切酶酶解克隆到丝状噬菌体克隆到丝状噬菌体质粒载体中质粒载体中感染大肠杆菌感染大肠杆菌释放外壳上带有抗释放外壳上带有抗体片段的噬菌体体片段的噬菌体筛选出特异性抗体筛选出特异性抗体第28页，此课件共29页哦3：免疫学研究中应用：免疫学研究中应用第29页，此课件共29页哦