高效液相色谱 (5)精选PPT讲稿.ppt

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1、关于高效液相色谱(5)第一页，讲稿共四十四页哦一、液固吸附色谱法一、液固吸附色谱法 固定相：固定相：硅胶：硅胶：YWG(YWG(无定形无定形无定形无定形)56 um YQG()56 um YQG(球形球形球形球形)34 um)34 um 原理：吸附原理：吸附原理：吸附原理：吸附 特点：峰易拖尾特点：峰易拖尾特点：峰易拖尾特点：峰易拖尾 适用：分离极性化合物适用：分离极性化合物适用：分离极性化合物适用：分离极性化合物采用来固体吸附剂作为固定相采用来固体吸附剂作为固定相高分子多孔微球：高分子多孔微球：YSGYSG 原理：吸附原理：吸附原理：吸附原理：吸附+分配兼小孔凝胶作用分配兼小孔凝胶作用分配兼

2、小孔凝胶作用分配兼小孔凝胶作用 特点：柱选择性好，峰形好，柱效低特点：柱选择性好，峰形好，柱效低特点：柱选择性好，峰形好，柱效低特点：柱选择性好，峰形好，柱效低 适用：分离弱极性化合物适用：分离弱极性化合物适用：分离弱极性化合物适用：分离弱极性化合物第二页，讲稿共四十四页哦一、液固吸附色谱法一、液固吸附色谱法流动相：流动相：底剂（烷烃）底剂（烷烃）+有机极性调节剂有机极性调节剂 例：例：正己烷或庚烷正己烷或庚烷+氯仿氯仿-分离机理分离机理:利用溶质分子占据固定相表面吸附活性利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异中心能力的差异p溶质分子极性溶质分子极性，洗脱能力，洗脱能力，k，tR 溶

3、剂系统极性溶剂系统极性，洗脱能力，洗脱能力，k，tRp出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱p硅胶吸水量硅胶吸水量，LSCLLC第三页，讲稿共四十四页哦二、液液分配色谱法二、液液分配色谱法 固定相：固定相：固定液固定液固定液固定液极性极性极性极性NLLCNLLC固定液固定液固定液固定液非极性非极性非极性非极性RLLCRLLC载体载体+固定液（物理或机械涂渍法）固定液（物理或机械涂渍法）缺点：缺点：系统内部压力大，易流失，不实用系统内部压力大，易流失，不实用正相色谱正相色谱固定液极性固定液极性 流动相极性（流动相极性（NLLC）反相色谱反相色谱固

4、定液极性固定液极性 8.0 破坏键合相与载体的结合破坏键合相与载体的结合 pH3.0 腐蚀柱子腐蚀柱子离子抑制剂：离子抑制剂：弱酸、弱碱性物质弱酸、弱碱性物质、一定、一定pH缓冲液缓冲液用途：用途：主要用来分离极弱酸碱、两性化合物主要用来分离极弱酸碱、两性化合物第十四页，讲稿共四十四页哦八、亲和色谱法（八、亲和色谱法（AC）原理：原理：利用生物大分子和固定相表面的生化特异性亲和利用生物大分子和固定相表面的生化特异性亲和力进行选择性分离力进行选择性分离固定相：固定相：生物专一性配基生物专一性配基+载体载体流动相：流动相：一定一定pH的缓冲液的缓冲液用途：用途：蛋白、酶、抗体分离蛋白、酶、抗体分离

5、 生物和医药分析生物和医药分析第十五页，讲稿共四十四页哦第四节第四节 HPLC分离条件的选择分离条件的选择1、涡流扩散项、涡流扩散项 A：A A=2 2 d dp p d dp p填充物平均直径；填充物平均直径；填充不规则因子填充不规则因子p使用细颗粒固定相使用细颗粒固定相p球形固定相并填充均匀球形固定相并填充均匀第十六页，讲稿共四十四页哦2、分子扩散项、分子扩散项 B/u：B=2 Dm 弯曲因子弯曲因子 DmDm流动相中的扩散系数流动相中的扩散系数 流动相是液体，室温操作，流动相是液体，室温操作，Dm 小小 流速在最佳流速以上，流速在最佳流速以上，u较大较大 在在HPLC中中,B/u较小，可

6、忽略较小，可忽略 即：即：H=A+C u第十七页，讲稿共四十四页哦3、传质阻力项传质阻力项 (Cu)使用细颗粒固定相并填充均匀使用细颗粒固定相并填充均匀使用低黏度的流动相使用低黏度的流动相流速不宜过快流速不宜过快:HPLC一般流量为一般流量为1ml/min左右左右第十八页，讲稿共四十四页哦dP 变小，变小，A、C均变小均变小塔板高度受塔板高度受u的影响也较小的影响也较小4、固定相颗粒、固定相颗粒dP对柱效的影响对柱效的影响影响影响HPLC柱效的最主要因素柱效的最主要因素 固定相颗粒粒度固定相颗粒粒度小的小的dP是保证是保证HPLC高柱效的主要措施高柱效的主要措施第十九页，讲稿共四十四页哦1、小

7、粒度，均匀的球形固定相、小粒度，均匀的球形固定相2、低粘度的流动相；流速不宜过快、低粘度的流动相；流速不宜过快3、适当的柱温、适当的柱温第四节第四节 HPLC分离条件的选择分离条件的选择HPLC分离条件：分离条件：第二十页，讲稿共四十四页哦第五节第五节 HPLC的建立与应用的建立与应用一、建立一、建立HPLC分析方法的一般步骤分析方法的一般步骤 1、根根据据被被分分析析样样品品的的特特性性选选择择适适用用于于样样品品分分析的一种析的一种HPLC分离方式。分离方式。p材料来源、材料来源、浓浓度范度范围围p组组分特性、分特性、结结构、分子量、溶解性等构、分子量、溶解性等第二十一页，讲稿共四十四页哦

8、第二十二页，讲稿共四十四页哦一、建立一、建立HPLC分析方法的一般步骤分析方法的一般步骤 分离模式选择分离模式选择p反相键合相色谱反相键合相色谱p离子抑制色谱离子抑制色谱p离子对色谱离子对色谱p液液-固吸附色谱固吸附色谱2、选择色谱分离模式和色谱柱、选择色谱分离模式和色谱柱色谱柱选择色谱柱选择 固定相类型、粒度、柱长、柱内径固定相类型、粒度、柱长、柱内径第二十三页，讲稿共四十四页哦一、建立一、建立HPLC分析方法的一般步骤分析方法的一般步骤 3、根据样品性质和分析目的选择检测器、根据样品性质和分析目的选择检测器p 样品具有紫外吸收特性样品具有紫外吸收特性 紫外吸收检测器紫外吸收检测器p 样品具

9、有发射荧光特性样品具有发射荧光特性 荧光检测器荧光检测器p 样品无紫外吸收或弱紫外吸收样品无紫外吸收或弱紫外吸收 蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器p 分析目的：定性分析分析目的：定性分析 质谱检测器质谱检测器 HPLC-MSHPLC-MS第二十四页，讲稿共四十四页哦一、建立一、建立HPLC分析方法的一般步骤分析方法的一般步骤 p 合适的保留时间和分析速度合适的保留时间和分析速度p 最佳的柱效和适当的分离度最佳的柱效和适当的分离度 根据分析目的不同，要求的分离度也不同。根据分析目的不同，要求的分离度也不同。p 等度洗脱和梯度洗脱等度洗脱和梯度洗脱 简单样品、单一成分定量：等度洗脱简单样品、单一成

10、分定量：等度洗脱 复杂样品、多成分分析或指纹图谱：梯度洗脱复杂样品、多成分分析或指纹图谱：梯度洗脱4、流动相的选择和优化、流动相的选择和优化第二十五页，讲稿共四十四页哦一、建立一、建立HPLC分析方法的一般步骤分析方法的一般步骤 4.分析条件的优化分析条件的优化p温度温度p流速流速p检测条件检测条件p进样量进样量第二十六页，讲稿共四十四页哦一、建立一、建立HPLC分析方法的一般步骤分析方法的一般步骤 6、由由获获得得的的色色谱谱图图进进行行定定性性分分析析和和定定量量分析。分析。p制备标准工作曲线制备标准工作曲线p精密度试验精密度试验p重复性试验重复性试验p加标回收率试验加标回收率试验p样品稳

11、定性考察样品稳定性考察5、建立分析方法并验证、建立分析方法并验证第二十七页，讲稿共四十四页哦28二、实验技术二、实验技术（一）样品处理（一）样品处理1.溶剂萃取溶剂萃取pHPLCHPLC分分析析通通常常是是使使用用与与水水不不混混溶溶的的有有机机溶溶剂剂从从水水相相中中萃取待测的有机化合物。萃取待测的有机化合物。p常用有机溶剂：氯仿，乙醚，乙酸乙酯，正丁烷等常用有机溶剂：氯仿，乙醚，乙酸乙酯，正丁烷等p萃取次数：萃取次数：3 35 5次次p萃萃取取液液处处理理：合合并并萃萃取取液液，进进行行蒸蒸发发浓浓缩缩，在在用用适适当当的有机溶剂（如色谱纯甲醇）溶解。的有机溶剂（如色谱纯甲醇）溶解。第二十

12、八页，讲稿共四十四页哦29p利利用用固固体体吸吸附附剂剂将将液液体体样样品品中中的的目目标标化化合合物物吸吸附附，与与基基体体分分离离，然然后后用用洗洗脱脱液液洗洗脱脱，收收集集洗洗脱脱液液，适适当当处处理理（蒸蒸发发浓浓缩缩）后后用用适适当当溶溶剂剂溶溶解，供解，供HPLCHPLC测定。测定。（一）样品处理（一）样品处理2.固相萃取固相萃取二、实验技术二、实验技术第二十九页，讲稿共四十四页哦30（一）样品处理（一）样品处理二、实验技术二、实验技术3.样品过滤样品过滤用用0.45 um的微孔滤膜的微孔滤膜的样品过滤头过滤。的样品过滤头过滤。第三十页，讲稿共四十四页哦311.过滤：流动相用过滤：

13、流动相用0.45m0.45m的微孔滤膜过滤的微孔滤膜过滤2.脱气：离线脱气、在线脱气脱气：离线脱气、在线脱气二、实验技术二、实验技术（二）流动相处理（二）流动相处理p不能使用腐蚀性的溶剂。如强酸。不能使用腐蚀性的溶剂。如强酸。p流动相不能含有任何颗粒。流动相不能含有任何颗粒。p流动相中无机盐的浓度要尽量小流动相中无机盐的浓度要尽量小(一般几十一般几十mmol/L)p分分析析完完成成要要及及时时用用足足量量的的水水将将缓缓冲冲盐盐冲冲走走，然然后后用用甲甲醇醇或或乙乙腈冲洗系统。腈冲洗系统。第三十一页，讲稿共四十四页哦32p避免压力和温度的急剧变化和任何机械震动避免压力和温度的急剧变化和任何机械

14、震动p样品要进行预处理；在分析柱前安装保护柱样品要进行预处理；在分析柱前安装保护柱p流动相要适宜，不能对固定相产生破坏流动相要适宜，不能对固定相产生破坏p注意色谱柱的注意色谱柱的pHpH使用范围、耐压限度使用范围、耐压限度p注意色谱柱的方向性，色谱柱不能反冲。注意色谱柱的方向性，色谱柱不能反冲。p每次色谱分析完成后，要及时对色谱柱进行冲洗每次色谱分析完成后，要及时对色谱柱进行冲洗p保存色谱柱在合适的溶剂中，一般是甲醇或乙睛保存色谱柱在合适的溶剂中，一般是甲醇或乙睛二、实验技术二、实验技术（三）色谱柱使用注意事项（三）色谱柱使用注意事项第三十二页，讲稿共四十四页哦33p紫外检测器：流动相在测定波

15、长处不能有紫外吸收紫外检测器：流动相在测定波长处不能有紫外吸收p荧荧光光检检测测器器：流流动动相相不不能能含含有有荧荧光光物物质质或或使使荧荧光光熄熄灭的物质灭的物质p蒸蒸发发光光散散射射检检测测器器：流流动动相相要要易易挥挥发发，不不含含有有难难挥挥发的无机盐发的无机盐二、实验技术二、实验技术（四）不同检测器对流动相的不同要求（四）不同检测器对流动相的不同要求第三十三页，讲稿共四十四页哦二、二、HPLC定性定量分析方法定性定量分析方法1 1、定性分析、定性分析p色谱鉴定法：色谱鉴定法：保留时间对照保留时间对照p化学鉴定法：化学鉴定法：利用专属化学反应对分离利用专属化学反应对分离 后收集的组分

16、定性后收集的组分定性p色谱色谱-光谱联用定性光谱联用定性 非在线色谱光谱联用法：非在线色谱光谱联用法：色谱光谱联用仪色谱光谱联用仪第三十四页，讲稿共四十四页哦二、二、HPLC定性定量分析方法定性定量分析方法2 2、定量分析、定量分析p外标法：外标法：外标工作曲线法、外标一点法、外外标工作曲线法、外标一点法、外标二点法等标二点法等 不需知道校正因子，但需进样量准确不需知道校正因子，但需进样量准确p内标法：内标法：内标工作曲线法、内标一点法、内标工作曲线法、内标一点法、内标二点法、内标对比法内标二点法、内标对比法第三十五页，讲稿共四十四页哦1、在食品分析中的应用、在食品分析中的应用p食品营养成分分

17、析：食品营养成分分析：蛋白质、氨基酸、糖类、色蛋白质、氨基酸、糖类、色素、维生素、香料、矿物质等；素、维生素、香料、矿物质等；p食品添加剂分析：食品添加剂分析：甜味剂、防腐剂、着色剂、抗甜味剂、防腐剂、着色剂、抗氧化剂等；氧化剂等；p食品污染物分析：食品污染物分析：霉菌毒素、微量元素、多环霉菌毒素、微量元素、多环芳烃等。芳烃等。2、在环境分析中的应用、在环境分析中的应用 多环芳烃、农药（如氨基甲酸脂类）残留等。多环芳烃、农药（如氨基甲酸脂类）残留等。三、三、HPLC的应用的应用第三十六页，讲稿共四十四页哦3、在生命科学中的应用、在生命科学中的应用 分子水平上研究生命科学、遗传工程、临分子水平上

18、研究生命科学、遗传工程、临床化学、分子生物学等必不可少的工具床化学、分子生物学等必不可少的工具p低分子量物质：氨基酸、有机酸、有机胺、类固低分子量物质：氨基酸、有机酸、有机胺、类固醇、卟啉、糖类、维生素等分离和测定醇、卟啉、糖类、维生素等分离和测定p高分子量物质：多肽、核糖核酸、蛋白质和酶的高分子量物质：多肽、核糖核酸、蛋白质和酶的纯化、分离和测定纯化、分离和测定三、三、HPLC的应用的应用第三十七页，讲稿共四十四页哦4、在医学检验中的应用、在医学检验中的应用 体液中代谢物测定；药代动力学研究；临床药体液中代谢物测定；药代动力学研究；临床药物监测：物监测：p合成药物：抗生素、抗忧郁药、黄胺类药

19、等合成药物：抗生素、抗忧郁药、黄胺类药等p天然药物：生物碱（吲哚碱、强心甙）等天然药物：生物碱（吲哚碱、强心甙）等5、在无机分析中的应用、在无机分析中的应用 阳、阴离子的分析等。阳、阴离子的分析等。三、三、HPLC的应用的应用第三十八页，讲稿共四十四页哦我国药典收载我国药典收载HPLC法项目和数量比较表法项目和数量比较表项目数 量1985版1990版1995版2000版2010版鉴别934150检查1240160含量测定7601173871385第三十九页，讲稿共四十四页哦色谱柱类型 品种数C18柱1210个C8柱93个氰基柱21个硅胶柱31个苯基柱9个色谱柱类型品种数氨基柱5个丁基柱3个三甲基硅烷柱2个二羟基丙基硅烷键合硅胶柱1个苯乙烯-二乙烯基柱1个20102010版药典二部中色谱柱的使用情况版药典二部中色谱柱的使用情况第四十页，讲稿共四十四页哦缬沙坦a-酸性糖蛋白柱盐酸帕罗西汀瑞格列奈手性色谱柱1酸性蛋白柱瑞格列奈片苯磺酸顺阿曲库铵手性色谱柱chiralcel OD-RH注射用苯磺酸顺阿曲库铵甲氨蝶呤牛血清白蛋白键合硅胶柱甲氨蝶呤片注射用甲氨蝶呤第四十一页，讲稿共四十四页哦第四十二页，讲稿共四十四页哦第四十三页，讲稿共四十四页哦感谢大家观看第四十四页，讲稿共四十四页哦