单克隆抗体和基因工程抗体的制备讲稿.ppt

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1、关于单克隆抗体和基因工程抗体的制备第一页，讲稿共六十八页哦目的要求目的要求1.掌握杂交瘤技术的基本原理掌握杂交瘤技术的基本原理2.熟悉单克隆抗体的制备技术熟悉单克隆抗体的制备技术3.熟悉基因工程抗体技术熟悉基因工程抗体技术第二页，讲稿共六十八页哦 大多数抗原分子具有多个抗原决定大多数抗原分子具有多个抗原决定簇（表位，簇（表位，epitope）。一个抗原决定簇）。一个抗原决定簇刺激一个刺激一个B细胞克隆产生一种特异性抗体，细胞克隆产生一种特异性抗体，一种抗原刺激机体产生多种抗体称为多克一种抗原刺激机体产生多种抗体称为多克隆抗体（隆抗体（polyclonal antibody,PcAb）如）如免疫

2、血清。由一个只识别一种抗原表位免疫血清。由一个只识别一种抗原表位的的B细胞克隆产生的同源抗体称为单克隆抗细胞克隆产生的同源抗体称为单克隆抗体体(monoclonal antibody,McAb)。概概 述述第三页，讲稿共六十八页哦 单克隆抗体理化性状高度均一，其抗原结合部单克隆抗体理化性状高度均一，其抗原结合部位完全相同，生物活性专一，特异性强，纯度高，位完全相同，生物活性专一，特异性强，纯度高，效价高，易于实验标准化及大量制备，是研究抗体效价高，易于实验标准化及大量制备，是研究抗体的一重大突破。应用比较广，如试剂诊断盒、治疗的一重大突破。应用比较广，如试剂诊断盒、治疗肿瘤、器官移植及自身免疫

3、病等。肿瘤、器官移植及自身免疫病等。第四页，讲稿共六十八页哦 第一节第一节 杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术的基本原理 基基本本原原理理是是融融合合的的两两种种细细胞胞保保持持自自身身的的特特性性，产产生生具具有有原原来来两两个个细细胞胞基基因因信信息息的的单单个个核核细细胞胞称称为为杂杂交交细细胞胞。包包括括B细细胞胞、T细胞，前者产生细胞，前者产生Ig，后者产生，后者产生CK。第五页，讲稿共六十八页哦 一、B 淋巴细胞杂交瘤技术 细细胞胞是是经经抗抗原原免免疫疫的的小小鼠鼠脾脾细细胞胞和和小小鼠鼠骨骨髓髓瘤瘤细细胞胞。B B细细胞胞能能产产生生抗抗体体，但但不不能能在在体体外外长长期期生生长

4、长，而而骨骨髓髓瘤瘤细细胞胞不不产产生生抗抗体体但但在在体体外外能能长长期期生生长长，二二者者融融合合，各各保保持持其其本性，既产生抗体又长期生长。本性，既产生抗体又长期生长。其原理分为几个步骤其原理分为几个步骤第六页，讲稿共六十八页哦 目目的的是是制制备备抗抗原原特特异异的的 McAbMcAb，所所以以融融合合的的细细胞胞必必须须经经抗抗原原免免疫疫的的B B细细胞胞，通通常常取取脾脾，另另一一是是在在体体外外长长期期生生长长又又不不产产生生抗抗体体，所所以以选选肿肿瘤瘤细细胞胞即即多多发发性性骨骨髓髓瘤瘤细胞，具备以下特点：细胞，具备以下特点：（一）细胞的选择与融合第七页，讲稿共六十八页哦

5、 1.1.稳定、易培养稳定、易培养 2.2.自身不分泌自身不分泌IgIg或或CKCK 3.3.融合率高融合率高 4.4.是是HGPRTHGPRT缺陷株缺陷株 第八页，讲稿共六十八页哦 目目前前常常用用的的BALB/cBALB/c小小鼠鼠B B细细胞胞瘤瘤株株有有P3-X63-P3-X63-Ag8.653CAg8.653C（P3.653P3.653）、Sp2Sp2/0 0等等。为为HATHAT敏敏感感株株，易易培培养养,融融合合率率高高，最最常常选选用用聚聚乙乙二二醇醇(PEG)(PEG)使细胞膜轻度损伤，细胞容易融合。使细胞膜轻度损伤，细胞容易融合。第九页，讲稿共六十八页哦（二）选择培养基的应

6、用（二）选择培养基的应用 细胞融合是一个随机的物理过程。融合后可能细胞融合是一个随机的物理过程。融合后可能出现以下情况出现以下情况:1 1）脾细胞与瘤细胞）脾细胞与瘤细胞 2 2）瘤细胞与瘤细胞）瘤细胞与瘤细胞 3 3）脾细胞与脾细胞）脾细胞与脾细胞 4 4）未融合的脾细胞）未融合的脾细胞 5 5）未融合的瘤细胞）未融合的瘤细胞 6 6）多聚体形式。）多聚体形式。3 3）、）、4 4）、）、6 6）在体外易死去，不需筛选。）在体外易死去，不需筛选。第十页，讲稿共六十八页哦第十一页，讲稿共六十八页哦细胞的细胞的 DNA 合成一般有两条途径合成一般有两条途径 一是糖和氨基酸及其他小分子化合物合一是

7、糖和氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，进一步合成成核苷酸，进一步合成 DNA，叶酸是重要，叶酸是重要辅酶。辅酶。一是辅助途径，是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶存一是辅助途径，是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶存在下，经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶在下，经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶（hypoxanthine guanine phospheribosyl hypoxanthine guanine phospheribosyl transferase,HGPRTtransferase,HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶）和胸腺嘧啶核苷激酶（thymidine kinase,TKthymidine kinase,TK）的催化作用）的催

8、化作用合成合成 DNA。第十二页，讲稿共六十八页哦 氨基蝶呤是叶酸的拮抗剂，当氨基蝶呤氨基蝶呤是叶酸的拮抗剂，当氨基蝶呤存在时，能阻断第一条途径。细胞融合的选存在时，能阻断第一条途径。细胞融合的选择培养基中有三种关键成分，次黄嘌呤择培养基中有三种关键成分，次黄嘌呤(hypoxanthine,H)(hypoxanthine,H)、氨基蝶呤、氨基蝶呤(aminopoterin,A)(aminopoterin,A)、胸腺嘧啶核苷、胸腺嘧啶核苷(thymidine,T)(thymidine,T)，三者取前缀缩写为，三者取前缀缩写为 HAT HAT 培养培养基，其融合细胞所用的瘤细胞是经毒性培养基，其融

9、合细胞所用的瘤细胞是经毒性培养基选择出来的基选择出来的 HGPRT HGPRT 阴性细胞株。阴性细胞株。第十三页，讲稿共六十八页哦 所以，前面提到的所以，前面提到的 2）瘤细胞与瘤细胞及）瘤细胞与瘤细胞及 5)未融合的瘤细胞不能生长，只有未融合的瘤细胞不能生长，只有 1）脾细胞与）脾细胞与瘤细胞才能生长，因为脾细胞为瘤细胞才能生长，因为脾细胞为 HGPRT 阳性，阳性，通过补偿途径代替氨基蝶呤阻断的主要途径。通过补偿途径代替氨基蝶呤阻断的主要途径。第十四页，讲稿共六十八页哦 （三）有限稀释与抗原特异性选择（三）有限稀释与抗原特异性选择 在在免免疫疫动动物物时时，一一种种抗抗原原往往往往有有多多

10、个个表表位位 ，一一个个B B细细胞胞克克隆隆接接受受一一个个表表位位，故故在在免免疫疫动动物物时时是是众众多多 B B 细细胞胞克克隆隆的的抗抗体体的的分分泌泌，而而针针对对目目的的抗抗原原的的B B细细胞胞只只占占很很少少部部分分，在在细细胞胞融融合合后后，有有相相当当一一部部分分是是无无关关的的细细胞胞融融合合体体，即即融融合合细细胞胞分泌的不是目的抗体，要进行筛选，分二步稀释。分泌的不是目的抗体，要进行筛选，分二步稀释。第十五页，讲稿共六十八页哦 计计数数，每每个个孔孔只只放放一一个个细细胞胞，实实际际是是0至至数数个个，整整个个过过程程为为克克隆隆化化，将将阳阳性性细细胞胞株株重重复

11、复一一次次，尽尽量量使使抗抗体体更更纯纯，将将阳阳性性细细胞胞进进行行增增殖殖，部分冻存，部分进行体外培养或动物接种。部分冻存，部分进行体外培养或动物接种。第十六页，讲稿共六十八页哦 另外还有其他杂交瘤技术，如人另外还有其他杂交瘤技术，如人-人人 B B 淋巴细胞杂交瘤和鼠淋巴细胞杂交瘤和鼠-人人 B B 淋巴细胞杂交瘤，淋巴细胞杂交瘤，人骨髓瘤细胞系体外建株比较困难，生长不稳人骨髓瘤细胞系体外建株比较困难，生长不稳定，有的分泌定，有的分泌 IgEIgE，有的分泌，有的分泌 Ig Ig 的的、链。链。B B细胞取外周血淋巴细胞、脾细胞、淋细胞取外周血淋巴细胞、脾细胞、淋巴结细胞、病灶浸润性淋巴

12、细胞。从理论巴结细胞、病灶浸润性淋巴细胞。从理论上讲很好，但实际比较困难，在于缺乏好上讲很好，但实际比较困难，在于缺乏好的亲体骨髓瘤细胞株，较难获得抗原特异的亲体骨髓瘤细胞株，较难获得抗原特异性性B B淋巴细胞；人杂交瘤细胞不能在小鼠或淋巴细胞；人杂交瘤细胞不能在小鼠或其他动物体内生长。其他动物体内生长。第十七页，讲稿共六十八页哦 小鼠骨髓瘤与人的小鼠骨髓瘤与人的B细胞杂交瘤，该技术优细胞杂交瘤，该技术优点是易获得小鼠骨髓瘤细胞，融合率较高，但最点是易获得小鼠骨髓瘤细胞，融合率较高，但最大的缺点是不同种杂交后不稳定，杂交瘤传代后，大的缺点是不同种杂交后不稳定，杂交瘤传代后，很快丧失分泌抗体的染

13、色体。很快丧失分泌抗体的染色体。第十八页，讲稿共六十八页哦二、二、T 细胞杂交瘤细胞杂交瘤 自自 B B 细胞杂交瘤技术后，细胞杂交瘤技术后，T T 淋巴细胞杂交瘤淋巴细胞杂交瘤成为热门，为获得淋巴因子，更深入地研究成为热门，为获得淋巴因子，更深入地研究T T细胞细胞的各种功能，虽然有一些小鼠的各种功能，虽然有一些小鼠T T细胞杂交瘤成功细胞杂交瘤成功的报道，但结果不满意，该细胞很不稳定，的报道，但结果不满意，该细胞很不稳定，分泌淋巴因子无特异性，一种分泌淋巴因子无特异性，一种T T细胞杂交瘤可细胞杂交瘤可同时分泌几种淋巴因子，到目前仍无突破性进同时分泌几种淋巴因子，到目前仍无突破性进展。展。

14、第十九页，讲稿共六十八页哦 T T 淋淋巴巴细细胞胞杂杂交交瘤瘤分分为为小小鼠鼠及及人人，由由于于 T T 细细胞胞功功能能的的多多样样化化，制制备备出出的的 T T 细细胞胞杂杂交交瘤瘤也也各各有有其其特特性性，如如分分泌泌淋淋巴巴因因子子，特特异异性性杀杀伤伤功功能能，分分泌泌抑抑制制因因子子，自自身身反反应应性性等等。其其基基本本过过程程是是将将激激活活的的T T细细胞胞与与酶酶缺缺陷陷型型T T淋淋巴巴细细胞胞瘤瘤细细胞胞融融合合，可可表表达达特特异异性性 TCR TCR 或或其其他他功功能能的的杂杂交交瘤瘤T T细细胞胞，与与 B B 细细胞胞相相以以，但但细细胞胞激激活活和和阳阳性

15、性克克隆筛选较为杂交，不稳定，简介主要步骤隆筛选较为杂交，不稳定，简介主要步骤 。第二十页，讲稿共六十八页哦1.1.淋巴瘤细胞系的选择淋巴瘤细胞系的选择1 1）体外无限制快速生长）体外无限制快速生长2 2）融合率高）融合率高3 3）不分泌淋巴因子和杀伤功能）不分泌淋巴因子和杀伤功能4 4）缺乏某一特异性表面抗原或受体）缺乏某一特异性表面抗原或受体5 5）HGPRT HGPRT 酶缺陷型酶缺陷型第二十一页，讲稿共六十八页哦 2.2.特特异异性性T T细细胞胞的的制制备备与与纯纯化化主主要要有有可可溶溶性性抗抗原原诱诱导导激激活活的的 T T 细细胞胞、同同种种反反应应性性T T 细细胞、人的特异

16、性胞、人的特异性 T T 细胞。细胞。第二十二页，讲稿共六十八页哦 3.T 3.T 细胞杂交瘤的筛选细胞杂交瘤的筛选 通通常常在在含含有有HATHAT选选择择培培养养基基上上，用用特特异异性性抗抗体体筛筛选选产产生生淋淋巴巴因因子子的的杂杂交交瘤瘤细细胞胞，用用抗抗 CD3-TCR CD3-TCR 抗抗体体筛筛选选阳阳性细胞。性细胞。第二十三页，讲稿共六十八页哦 三、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养三、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养 杂杂交交瘤瘤细细胞胞形形成成的的初初期期很很不不稳稳定定，鼠鼠的的二二倍倍体体细细胞胞有有4040对对染染色色体体，杂杂交交后后8080对对，易易丢丢失失，丢丢失失后后仍仍

17、生生长长，要要检检测测上上清清液液中中是是否有目的抗体及淋巴因子。否有目的抗体及淋巴因子。第二十四页，讲稿共六十八页哦 将阳性细胞进行单细胞培养，反复将阳性细胞进行单细胞培养，反复23次，确保为一单细胞阳性杂交瘤细胞应及时冻次，确保为一单细胞阳性杂交瘤细胞应及时冻存，以防止细胞染色体丢失，发生变异或污染，存，以防止细胞染色体丢失，发生变异或污染，冻存于液氮（冻存于液氮（-196）,冻存时加小牛血清至冻存时加小牛血清至20%,加几滴加几滴10%二甲亚砜。二甲亚砜。杂交瘤细胞培养可用液体、半固体、接种杂交瘤细胞培养可用液体、半固体、接种动物腹腔。动物腹腔。第二十五页，讲稿共六十八页哦第二节第二节

18、单克隆抗体的制备技术单克隆抗体的制备技术 McAb McAb 单单一一、特特异异、纯纯化化，利利用用杂杂交交瘤瘤技技术制备术制备McAbMcAb的基本原理是三个原则：的基本原理是三个原则：1 1）一种单克隆产生一种抗体）一种单克隆产生一种抗体 2 2）杂交瘤细胞保持双亲细胞特性）杂交瘤细胞保持双亲细胞特性 3 3）筛选培养基）筛选培养基第二十六页，讲稿共六十八页哦 一、单克隆抗体的产生一、单克隆抗体的产生 1.1.动物体内生长动物体内生长 杂杂交交瘤瘤细细胞胞注注射射同同系系小小鼠鼠腹腹腔腔，先先注注射射石石蜡蜡或或不不完完全全佐佐剂剂，使使腹腹腔腔渗渗出出液液增增多多，1 12 2周周后后无

19、无菌菌方方法法抽抽取取腹腹水水，离离心取上清。心取上清。第二十七页，讲稿共六十八页哦 2.2.体外培养体外培养 较常做，用普通培养瓶培养，根据培养较常做，用普通培养瓶培养，根据培养时间、细胞生长情况收取上清液。另有高密时间、细胞生长情况收取上清液。另有高密度培养，在单位体积内增加细胞的培养数量。度培养，在单位体积内增加细胞的培养数量。第二十八页，讲稿共六十八页哦 二、单克隆抗体的纯化二、单克隆抗体的纯化 腹水或细胞上清液，均含有脂蛋白、脂质及腹水或细胞上清液，均含有脂蛋白、脂质及细胞碎片等杂质，用滤纸去掉脂质和大颗粒，细胞碎片等杂质，用滤纸去掉脂质和大颗粒，离心去除细胞碎片和蛋白聚合物。离心去

20、除细胞碎片和蛋白聚合物。第二十九页，讲稿共六十八页哦 目前纯化方法有十几种，一般采用盐析、目前纯化方法有十几种，一般采用盐析、凝胶过滤、离子交换层析和辛酸提取等，现凝胶过滤、离子交换层析和辛酸提取等，现在最有效的方法是亲和纯化法，常用在最有效的方法是亲和纯化法，常用 SPA 或或抗小鼠免疫球蛋白抗体与载体交联。称为抗小鼠免疫球蛋白抗体与载体交联。称为 Sepharose 柱，抗体结合上去，然后洗脱。柱，抗体结合上去，然后洗脱。第三十页，讲稿共六十八页哦 三、单克隆抗体的性质鉴定三、单克隆抗体的性质鉴定 鉴定的方法很多，用已知抗原测定抗鉴定的方法很多，用已知抗原测定抗体，几乎所有的抗原抗体反应试

21、验都可体，几乎所有的抗原抗体反应试验都可以作，如阳性，再定量，确定工作浓度。以作，如阳性，再定量，确定工作浓度。第三十一页，讲稿共六十八页哦第三节第三节 基因工程抗体技术基因工程抗体技术 杂交瘤单克隆抗体在诊断、治疗、杂交瘤单克隆抗体在诊断、治疗、预防和蛋白质提纯应用中非常广泛，但预防和蛋白质提纯应用中非常广泛，但对人是异源性，人抗小鼠抗体，应用基对人是异源性，人抗小鼠抗体，应用基因工程技术减少小鼠源成分，保留原有因工程技术减少小鼠源成分，保留原有的抗体特异性。的抗体特异性。第三十二页，讲稿共六十八页哦一、人源化抗体一、人源化抗体 人源化抗体主要指鼠源性单克隆抗体的人源化抗体主要指鼠源性单克隆

22、抗体的基因克隆及基因克隆及 DNA DNA 重组技术改造，重新表达重组技术改造，重新表达的抗体。其大部分氨基酸序列为人源序列所的抗体。其大部分氨基酸序列为人源序列所取代，既基本保留亲代鼠单克隆抗体的亲和取代，既基本保留亲代鼠单克隆抗体的亲和力和特异性，又降低了鼠异源性。力和特异性，又降低了鼠异源性。第三十三页，讲稿共六十八页哦 （一）人（一）人-鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体 通过基因工程技术将人通过基因工程技术将人 IgG C IgG C 区与区与鼠鼠IgG IgG V V 区连接，导入细胞内表达制备的抗体称为嵌合区连接，导入细胞内表达制备的抗体称为嵌合抗体，因抗体，因 IgG IgG 的抗原性在的抗

23、原性在 C C 区，来自人，故抗区，来自人，故抗原性降低，且半衰期明显延长，在介导原性降低，且半衰期明显延长，在介导 CDC CDC 及及 ADCC ADCC 亦明显增强。亦明显增强。第三十四页，讲稿共六十八页哦 1.1.鼠单克隆抗体可变区基因克隆鼠单克隆抗体可变区基因克隆 用用探探针针从从该该杂杂交交瘤瘤细细胞胞的的基基因因组组文文库库中中调调取取。用用 PCR PCR 方方法法从从该该细细胞胞的的 RNA RNA 中中扩增扩增 V VH H 及及 V VL L 基因。基因。第三十五页，讲稿共六十八页哦 2.2.表达载体的构建表达载体的构建 人人-鼠鼠嵌嵌合合抗抗体体的的表表达达载载体体基基

24、因因依依可可变变区区基基因因克克隆隆的的表表达达方方式式不不同同而而分分为为两两类类，从从基基因因文文库库所所克克隆隆的的可可变变区区基基因因带带有有上上游游的的转转录录调调控控组组件件及及内内含含子子剪剪接接信信号号，因因此此载载体体只只需需要要包包括括细细胞胞内内增增殖殖所所必必须须的的抗抗生生素素抗抗性性基基因因和和质质粒粒复复制制的的起起始始序序列以及在真核细胞进行选择的显性标记基因。列以及在真核细胞进行选择的显性标记基因。第三十六页，讲稿共六十八页哦 将将载载体体 DNA DNA 导导入入真真核核细细胞胞称称为为转转染染。导导入入的的 DNA DNA 整整合合至至细细胞胞基基因因组组

25、 DNA DNA 中中得得到到转转染染子子，要要得得到到稳稳定定的的转转染染子子需需利利用用真真核核细细胞胞的的显显性性选选择择标标记记基基因因，这这些些标标记记基基因因使使细细胞胞获获得得对对某某些些细细胞胞毒毒物物质质的的抗抗体体，在在培培养养液液中中加加入入相相应应的的细细胞胞毒毒物物质质可可杀杀死死转转染染不不成成功功的的细细胞胞，达达到到选择的目的。选择的目的。第三十七页，讲稿共六十八页哦 3.3.表达表达 用用哺哺乳乳动动物物细细胞胞或或大大肠肠杆杆菌菌表表达达量量较较少少，而而应应用用二二氢氢叶叶酸酸还还原原酶酶（dhfrdhfr）扩扩增增系系统统使使抗抗体体表表达达增增强强。d

26、hfr dhfr 是是正正常常核核酸酸代代谢谢必必须须的的酶酶，缺缺乏乏该该酶酶的的中中华华仓仓鼠鼠卵卵细细胞胞（CHOCHO）需需在在有有次次黄黄嘌嘌呤呤和和胸胸腺腺嘧嘧啶啶核核苷苷条条件件下下利利用用 DNA DNA 合合成成，因因此此,dhfr dhfr 作作 CHO CHO 的的显显性性选选择择标标记记基基因因，在在无无次次黄黄嘌嘌呤呤、胸胸腺腺嘧嘧啶啶核核苷苷的的情情况况下下，只只有有导导入入 dhfr dhfr 基基因因，细细胞胞才才能能存存活活。该该糸糸统可用来扩增导入的目的基因。统可用来扩增导入的目的基因。第三十八页，讲稿共六十八页哦 (二二)改改 形形 抗抗 体体（resha

27、ped reshaped antibody,RABantibody,RAB）应应用用基基因因工工程程技技术术在在嵌嵌合合抗抗体体基基础础上上用用人人抗抗体体可可变变区区序序列列取取代代鼠鼠源源单单抗抗CDRCDR以以外外的的骨骨架架序序列列，重重新新构构成成既既有有鼠鼠源源单单抗抗的的特特异异性性又又保保持持抗抗体体亲亲和和力力的的人人源源化化抗抗体体，该该抗抗体对人无免疫原性。体对人无免疫原性。第三十九页，讲稿共六十八页哦 （三）抗体的表面修饰（三）抗体的表面修饰 人人和和鼠鼠 IgVIgV区区来来自自不不同同的的种种属属，轻轻链链不不同同型型别别，互互补补 性性 决决 定定 区区(comp

28、lementarity(complementarity determining determining region,CDR)region,CDR)的的长长度度可可不不一一致致，但但暴暴露露于于表表面面的的AAAA残残基基的的位位置置数数量量都都很很保保守守，通通过过改改变变表表面面残残基基使使其其人人源源化化，降降低低鼠鼠可可变变区区的的异异源源性性，将将FvFv的的表表面面人人源源化化，消消除除其其免免疫疫原原性性而而不不影影响响 FvFv 的的整整体体空空间间构象。构象。第四十页，讲稿共六十八页哦 （四）双特异性抗体（四）双特异性抗体 双特异性抗体（双特异性抗体（bispecific a

29、ntibody,BsAbbispecific antibody,BsAb）又称双功能抗体。两个抗原结合部位具有不）又称双功能抗体。两个抗原结合部位具有不同的特异性，可以同时与两种不同特异性抗原同的特异性，可以同时与两种不同特异性抗原发生结合。发生结合。第四十一页，讲稿共六十八页哦 1.1.化学交联化学交联BsAbBsAb 分别分离纯化两种抗原的单抗，先使分别分离纯化两种抗原的单抗，先使IgIg解解离后，获得单价抗体，再使两种不同抗原特异性离后，获得单价抗体，再使两种不同抗原特异性的单价抗体或其片段交联起来。该方法易致抗体的单价抗体或其片段交联起来。该方法易致抗体失活，其产物也难以保证均质性。失

30、活，其产物也难以保证均质性。第四十二页，讲稿共六十八页哦 2.2.细胞工程细胞工程BsAbBsAb 将二种杂交瘤细胞进行融合产生杂交瘤，将二种杂交瘤细胞进行融合产生杂交瘤，核酸随机组合多种多样。核酸随机组合多种多样。第四十三页，讲稿共六十八页哦 3.3.基因工程基因工程BsAbBsAb 用抗体分子片段如用抗体分子片段如ScFvScFv或或FabFab等，经基因操等，经基因操作修饰后，或体外组装成为作修饰后，或体外组装成为BsAbBsAb，或直接导入，或直接导入受体细胞表达分泌受体细胞表达分泌BsAbBsAb。在免疫检测、肿瘤放射免疫显象、药物刹伤、在免疫检测、肿瘤放射免疫显象、药物刹伤、介导细

31、胞刹伤效应起重要作用。介导细胞刹伤效应起重要作用。第四十四页，讲稿共六十八页哦 二、小分子抗体二、小分子抗体 具有结合抗原功能的分子片段称为小分子抗具有结合抗原功能的分子片段称为小分子抗体。其优点：体。其优点：1 1）可在原核细胞表达，生产成）可在原核细胞表达，生产成本低本低;2;2）易于穿透血管或组织到靶细胞部位，）易于穿透血管或组织到靶细胞部位，有利于疾病的治疗；有利于疾病的治疗；3 3）不含）不含Fc Fc 段，副作用小；段，副作用小；4 4）半衰期短，有利于毒素中和及清除。）半衰期短，有利于毒素中和及清除。第四十五页，讲稿共六十八页哦 小分子抗体包括：抗原结合片段小分子抗体包括：抗原结

32、合片段（fragment of antigen binding,Fabfragment of antigen binding,Fab），可），可变区片段（变区片段（fragment of variable region,Fvfragment of variable region,Fv）,单链抗体（单链抗体（single chain Fv,ScFvsingle chain Fv,ScFv），单区抗），单区抗体。另有体。另有V VH H和和V VL。第四十六页，讲稿共六十八页哦 1.Fab 由一条完整的由一条完整的 L L 链和约为链和约为1/21/2的的 H H 链组链组成，是完整抗体的成，是完

33、整抗体的 1/31/3，只有一个，只有一个Ag Ag 结合结合位点，它是将位点，它是将 McAb McAb 重链重链V V区和区和 C CH H1 1 区区cDNA cDNA 与完整轻链与完整轻链 cDNA cDNA 连接，在细胞启动子的连接，在细胞启动子的控制下分泌表达。控制下分泌表达。第四十七页，讲稿共六十八页哦 2.Fv2.Fv和单链抗体（和单链抗体（ScFvScFv）Fv Fv 由由 V VH H 和和 V VL L 构构成成，非非共共价价键键结结合合，为为完完整整抗抗体体的的1/61/6，单单一一抗抗原原结结合合位位点点，V VH H和和V VL L连连接接有有三三种种方方法法：1

34、1）用用戊戊二二醛醛处处理理，使使之之交交联联；2 2）引引入入半半胱胱氨氨酸酸残残基基，使使V VH H和和V VL L之之间间形形成成二二硫硫键键；3 3）把把V VH H和和V VL L用用一一段段适适当当的的寡寡核核苷苷酸酸分分子子连连接接起起来来，表表达达成成一一个个单单链链，称为称为ScFvScFv。第四十八页，讲稿共六十八页哦 3.3.单区抗体及最小识别单位单区抗体及最小识别单位 根据抗体分子的结构，一般将根据抗体分子的结构，一般将 FvFv 称为抗体称为抗体的最小单位，但有些更小亚单位仍结合抗原，如单的最小单位，但有些更小亚单位仍结合抗原，如单独重链独重链 V VH H 仍可保

35、留相当程度抗原结合能力，其作仍可保留相当程度抗原结合能力，其作用比用比 V VL L 大，称为单区抗体（大，称为单区抗体（single domain single domain antibodyantibody），其亲和力低于完整的），其亲和力低于完整的 FvFv，因单区抗，因单区抗体的疏水区的暴露，增加了非特异性吸附，水溶体的疏水区的暴露，增加了非特异性吸附，水溶性减低，其应用受到限制，但分子量小，单位体性减低，其应用受到限制，但分子量小，单位体积浓度高，副作用小，是很有前景的抗体部分。积浓度高，副作用小，是很有前景的抗体部分。第四十九页，讲稿共六十八页哦 将将抗抗体体分分子子片片段段与与其

36、其他他蛋蛋白白融融合合，可可得得到到有有多多样样性性生生物物功功能能的的融融合合蛋蛋白白，有有几几种种构构建方式：建方式：1 1）将将 Fab Fab 或或 ScFvScFv与与其其他他生生物物活活性性蛋蛋白融合，建成生物导弹。白融合，建成生物导弹。三、抗体融合蛋白三、抗体融合蛋白第五十页，讲稿共六十八页哦 2）在融合时可根据某些恒定区，可使某些）在融合时可根据某些恒定区，可使某些生物活性与抗体的生物学效应功能联结在一起。生物活性与抗体的生物学效应功能联结在一起。3）将）将 ScFv 与某些细胞膜蛋白融合，形成嵌与某些细胞膜蛋白融合，形成嵌合受体，使细胞结合抗原合受体，使细胞结合抗原。第五十一

37、页，讲稿共六十八页哦 （一）含（一）含FvFv片段的抗体融合蛋白片段的抗体融合蛋白 将将 FvFv 与某些毒素、酶及细胞因子等与某些毒素、酶及细胞因子等的基因连接，能编码的基因连接，能编码 FvFv 与毒素、酶及细与毒素、酶及细胞因子复合物，即生物导弹，主要在于抗胞因子复合物，即生物导弹，主要在于抗肿瘤。肿瘤。第五十二页，讲稿共六十八页哦 （二）嵌合受体（二）嵌合受体 将将ScFv ScFv 与与某某些些细细胞胞膜膜蛋蛋白白分分子子融融合合，形形成成的的融融合合蛋蛋白白可可表表达达于于细细胞胞表表面面。其其抗抗体体部部分分与与相相应应抗抗原原特特异异性性结结合合。如如将将抗抗体体的的可可变变区

38、区基基因因与与TCRTCR的的链链和和链链恒恒定定区区融融合合，将将融融合合基基因因导导入入T T细细胞胞，既既表表达达特特异异性性抗抗体体，又又表表达达TCRTCR，该该TCRTCR不不受受MHCMHC分分子子限限制。制。第五十三页，讲稿共六十八页哦 （三）含（三）含 Fc Fc 的抗体融合蛋白的抗体融合蛋白 如将如将CD4CD4分子细胞膜外部分与分子细胞膜外部分与Fc Fc 融合后用真核细胞表融合后用真核细胞表达，由二硫键连接成双体，分泌到细胞外，产生二种功能：达，由二硫键连接成双体，分泌到细胞外，产生二种功能：1 1）延长在血循环中的半衰期；）延长在血循环中的半衰期；2 2）通过功能蛋白

39、与配体）通过功能蛋白与配体分子的作用，将分子的作用，将FcFc的生物学效应引导至特定目的，如的生物学效应引导至特定目的，如CD4CD4与与FcFc融合蛋白，融合蛋白，CD4CD4是是T T辅助细胞表面糖蛋白，是辅助细胞表面糖蛋白，是HIV HIV 的受体，该融合蛋白能竞争结合的受体，该融合蛋白能竞争结合 HIVHIV，可阻断，可阻断 HIV HIV 对对T TH H 的感染，可介导的感染，可介导 ADCCADCC及及CDCCDC，可通过胎盘。，可通过胎盘。第五十四页，讲稿共六十八页哦 小小分分子子抗抗体体都都是是单单价价，不不能能偶偶联联。将将特特异异性性不不同同的的两两个个小小分分子子抗抗体

40、体连连接接在在一一起起可可获获得得双双特特异异性性抗抗体体。（bispecific bispecific antibody,BsAbantibody,BsAb），双双价价ScFvScFv与与抗抗原原结结合合比比单单价价敏敏感感性性高高，亲亲和和力力大大，结结构构和和功功能能上上都都更更接接近近亲亲本本抗抗体体。BsAbBsAb分分子子片片段段可可从从FabFab、FvFv 或或 ScFvScFv 组建，可在体内或体外连接。组建，可在体内或体外连接。四、双特异性抗体四、双特异性抗体第五十五页，讲稿共六十八页哦 在小分子抗体的羧基端设计半胱氨酸残基，如带铰在小分子抗体的羧基端设计半胱氨酸残基，如带

41、铰链区的链区的 Fab 段或带半胱氨酸残基尾巴的段或带半胱氨酸残基尾巴的 ScFv，可在体，可在体外通过化学交联成为双价抗体分子，亮氨酸铰链也可外通过化学交联成为双价抗体分子，亮氨酸铰链也可用来构建，两个不同抗体连接成为功能抗体。如抗体用来构建，两个不同抗体连接成为功能抗体。如抗体 CD3 和抗和抗 IL-2R的的Fab 在体外直接介导在体外直接介导T细胞对表达细胞对表达 IL-2的细胞有杀伤作用。的细胞有杀伤作用。（一）双价抗体分子的构建（一）双价抗体分子的构建1.体外构建体外构建第五十六页，讲稿共六十八页哦 对对小小分分子子抗抗体体基基因因的的改改造造修修饰饰，使使细细胞胞直直接接表表达达

42、双双抗抗体体分分子子，比比体体外外组组建建更更有有效效，现现有以下几种方法有以下几种方法:2.双抗体分子的细胞内组建双抗体分子的细胞内组建第五十七页，讲稿共六十八页哦 （1）设计促进双聚体形成的结构域，半胱氨）设计促进双聚体形成的结构域，半胱氨酸是促进双聚体形成的结构域，使小分子抗体酸是促进双聚体形成的结构域，使小分子抗体在大肠杆菌的分泌型表达过程中形成双体，亮在大肠杆菌的分泌型表达过程中形成双体，亮氨酸拉链和甲基（氨酸拉链和甲基（CH3）亦有螺旋）亦有螺旋转角转角螺旋螺旋结构，使之成为双体。结构，使之成为双体。（2）在基因构建上直接将两个抗体分子片段）在基因构建上直接将两个抗体分子片段融合。

43、融合。（3）双体分子）双体分子 两个两个 ScFv 的的 VH 和和 VL 相互配相互配对，可产生双价的双抗体分子。对，可产生双价的双抗体分子。第五十八页，讲稿共六十八页哦 能能同同时时结结合合两两种种不不同同抗抗原原，因因而而可可介介导导标标记记物物与与靶靶抗抗原原的的结结合合，或或某某些些高高级级分分子子定定位位于靶细胞。在临床上有以下应用：于靶细胞。在临床上有以下应用：（二）双特异性抗体的应用二）双特异性抗体的应用第五十九页，讲稿共六十八页哦 1.在免疫检测中的应用在免疫检测中的应用 一个臂结合靶抗原，一个臂结合靶抗原，另一个臂结合酶，不需用酶标记抗体，避免在标另一个臂结合酶，不需用酶标

44、记抗体，避免在标记过程中降低酶及抗体的活性。记过程中降低酶及抗体的活性。2.在肿瘤放射免疫显像中的应用在肿瘤放射免疫显像中的应用 一个臂结合一个臂结合肿瘤细胞，另一个臂结合半抗原螯合剂，半抗原肿瘤细胞，另一个臂结合半抗原螯合剂，半抗原螯合剂能选择与放射性核素结合。放射免疫显像，螯合剂能选择与放射性核素结合。放射免疫显像，清晰度和灵敏度高。清晰度和灵敏度高。第六十页，讲稿共六十八页哦 3.3.双双特特异异性性抗抗体体介介导导的的药药物物杀杀伤伤效效应应 治治疗肿瘤生物导弹如药物、毒素或核素。疗肿瘤生物导弹如药物、毒素或核素。4.4.介介导导的的细细胞胞杀杀伤伤效效应应 一一臂臂结结合合肿肿瘤瘤抗

45、抗原原，一臂结合免疫活性细胞起介导作用并激活免疫细胞。一臂结合免疫活性细胞起介导作用并激活免疫细胞。第六十一页，讲稿共六十八页哦 抗抗体体库库技技术术是是指指应应用用基基因因克克隆隆技技术术将将全全套套抗抗体体重重链链及及轻轻链链可可变变区区基基因因克克隆隆出出来来，重重组组到到质质粒粒表表达达载载体体，通通过过大大肠肠杆杆菌菌直直接接表表达达有有功功能能的的抗抗体体分分子子片片段段，最最后后筛筛选选到到特特异异的的可可变变区区基基因因，取取决决于于两两项项技技术术的的突突破破：一一是是 PCR PCR 技技术术的的发发展展，可可用用一一组组引引物物克克隆隆出出全全套套抗抗体体的的可可变变区区

46、基基因因，一一是是大大肠肠杆杆菌菌表表达分泌型抗体分子片段的成功。达分泌型抗体分子片段的成功。五、抗体库技术及其应用五、抗体库技术及其应用第六十二页，讲稿共六十八页哦 采采用用 RT-PCR 技技术术从从淋淋巴巴细细胞胞克克隆隆出出全全套套抗抗轻轻链链基基因因和和重重链链基基因因，将将二二者者分分别别组组建建到到表表达达载载体体中中，得得到到轻轻链链基基因因库库和和重重链链基基因因 Fd 段段基因库，再通过基因库，再通过 DNA 重重组组技技术术将将轻轻链链基基因因和和 Fd 随随重重组组于于一一个个表表达载体中，即形成组合抗体库。达载体中，即形成组合抗体库。（一）组合抗体库技术（一）组合抗体

47、库技术第六十三页，讲稿共六十八页哦 1.1.噬噬菌菌体体显显示示 指指将将蛋蛋白白分分子子或或肽肽段段基基因因克克隆隆到到丝丝状状噬噬菌菌体体的的基基因因组组 DNA DNA 中中，使使噬噬菌菌体体表表面面表表达达该该异异源源性性分分子子，主主要要特特点点是是在在同同一一病病毒毒颗颗粒粒内内将将特特定定分分子子的的基基因因型型和和表表型型统统一一，在在噬噬菌菌体体表表面面表表达达特特定定蛋蛋白白，在在该该噬噬菌菌体体核核心心DNADNA中中含含有有该该蛋白的基因。蛋白的基因。（二）噬菌体抗体库技术（二）噬菌体抗体库技术第六十四页，讲稿共六十八页哦 2.噬噬菌菌体体抗抗体体 将将抗抗体体分分子子

48、片片段段与与噬噬菌菌体体外外壳壳蛋蛋白白融融合合，使使之之表表达达在在噬噬菌菌体体表表面面，形形成成噬噬菌菌体体抗抗体体，将将全全套套抗抗体体可可变变区区基基因因，组组装装到到表表达达载载体体，其其抗抗体体表表达达到到噬噬菌菌体体表表面面，得到噬菌体抗原。得到噬菌体抗原。第六十五页，讲稿共六十八页哦 在在诊诊断断、治治疗疗中中具具重重要要意意义义，还还有有人人源源性性抗抗体体比比鼠鼠源性抗体的副作用低，很有发展前途。源性抗体的副作用低，很有发展前途。1.1.在在抗抗感感染染中中的的作作用用 对对细细菌菌产产生生的的毒毒素素、病病毒感染。毒感染。2.2.在在肿肿瘤瘤治治疗疗中中的的作作用用 一一是是抗抗体体直直接接作作用用于于肿瘤，一是抗体连接药物、毒素、酶及细胞因子等。肿瘤，一是抗体连接药物、毒素、酶及细胞因子等。3 3抗独特异抗体抗独特异抗体 抗原内影像来代替相应抗原，抗原内影像来代替相应抗原，因为这种抗原量少或难于获得。因为这种抗原量少或难于获得。（三）抗体库的应用（三）抗体库的应用第六十六页，讲稿共六十八页哦 AgId抗抗-Id抗原的内影象抗原的内影象第六十七页，讲稿共六十八页哦感谢大家观看第六十八页，讲稿共六十八页哦