血红蛋白的提取与分离 课件.ppt

《血红蛋白的提取与分离 课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《血红蛋白的提取与分离 课件.ppt（57页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、血红蛋白的提取与分离第1页，此课件共57页哦思考思考1分离生物大分子的基本思路是什么？分离生物大分子的基本思路是什么？选用一定的物理或化学的方法分离具有不选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。同物理或化学性质的生物大分子。思考思考2蛋白质的分离和提取的原理是什么？蛋白质的分离和提取的原理是什么？根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。以用来分离不同蛋白质。第2

2、页，此课件共57页哦思考思考3高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？的何种作用，作用结果是什么被破坏？变性、变性、空间结构变性、变性、空间结构思考思考4人们用鸡的红细胞提取人们用鸡的红细胞提取DNA，用人，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便，便于进行于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。提取血红蛋白。第3页，此课件共57页哦一、基础知

3、识：一、基础知识：凝胶色谱法（分配色谱法）：凝胶色谱法（分配色谱法）：1、凝胶：、凝胶：一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，具道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛）多孔的凝胶就叫分子筛）2、概念：、概念：根据被根据被分离物质的蛋白质相对分离物质的蛋白质相对分子质量的大小分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。的分子筛作用，来进行分离。第4页，此课件共57页哦3、原理：、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（）的蛋白质容易进入凝

4、胶内部的通道，路程（）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（），移动速度（），移动速度（），而（），而（）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（）移动，路程（）移动，路程（），移动速），移动速度（度（），相对分子质量不同的蛋白质因），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。此得以分离。相对分子质量较小相对分子质量较小较长较长较慢较慢相对分子质量较大相对分子质量较大凝胶外部凝胶外部较短较短较快较快大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，

5、路程长，流动慢第5页，此课件共57页哦洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。促使蛋白质分子的差速流动。混合物混合物上上 柱柱洗洗脱脱大分子流动快大分子流动快小分子流动慢小分子流动慢收收 集集大分子大分子收收 集集小分子小分子第6页，此课件共57页哦第7页，此课件共57页哦第8页，此课件共57页哦1、概念：在一定的范围内，能对抗外来、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。作

6、用的溶液叫做缓冲溶液。缓冲溶液：缓冲溶液：2、作用：、作用：能够抵制（能够抵制（）的对溶液的（）的对溶液的（）的影响，维持）的影响，维持PH基本不变。基本不变。外界的酸或碱外界的酸或碱PH值值第9页，此课件共57页哦3、缓冲溶液的配制、缓冲溶液的配制通常由（通常由（）种缓冲剂溶解于水中配）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（制而成。调节缓冲剂的（）就可以）就可以制得（制得（）使用的缓冲液。）使用的缓冲液。12使用比例使用比例在不同在不同PH范围内范围内思考：说出人体血液中缓冲对。思考：说出人体血液中缓冲对。NaH2PO4/Na2HPO4H2CO3/NaHCO3第10页，此课件共57页哦思

7、考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？什么？它的目的是什么？使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）研究（活性）第11页，此课件共57页哦1）原理：）原理：不同蛋白质的不同蛋白质的带电性质带电性质（正电荷或负电荷）（正电荷或负电荷）、电量、电量、形状和大小形状和大小不同，在电场中受到的作用力不同，在电场中受到的作用力大小、大小、方向、阻

8、力方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的不同，导致不同蛋白质在电场中的运运动方向动方向和和运动速度运动速度不同不同。2）影响蛋白质分子运动速度的因素）影响蛋白质分子运动速度的因素电泳：电泳：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程思考思考：蛋白质为什么带有电荷？蛋白质为什么带有电荷？在一定的在一定的PH下下，蛋白质可解离的基团会带上电荷，蛋白质可解离的基团会带上电荷电泳：电泳：第12页，此课件共57页哦影响蛋白质分子运动速度的因素影响蛋白质分子运动速度的因素决定决定运动方向运动方向电场电场作用力作用力形成形成阻力阻力决定决定运动速率运动速率电荷性质电荷性质电荷

9、量电荷量分子形状分子形状分子大小分子大小第13页，此课件共57页哦电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动带电荷相反的电极移动许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的有可解离的基团，在一定的PHPH下，这些基团会

10、带下，这些基团会带上正电或负电上正电或负电1、原理：、原理：第14页，此课件共57页哦聚丙稀酰胺凝胶：聚丙稀酰胺凝胶：是由单体丙烯酰胺和交联是由单体丙烯酰胺和交联剂剂N,N-N,N-甲基双丙烯酰胺在引发剂甲基双丙烯酰胺在引发剂(过硫酸铵过硫酸铵和催化剂（四甲基已二胺）的作用下和催化剂（四甲基已二胺）的作用下聚合交联聚合交联成三维网状结构的凝胶成三维网状结构的凝胶测定（测定（）通常用十）通常用十二烷基硫酸钠（二烷基硫酸钠（SDS）聚丙稀酰胺凝胶电聚丙稀酰胺凝胶电泳泳蛋白质相对分子质量蛋白质相对分子质量2、常见方法、常见方法琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳第15

11、页，此课件共57页哦蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带带净电荷的多少净电荷的多少以及以及分子的大小分子的大小等因素等因素原理原理SDSSDS作用作用为了消除为了消除净电荷对迁移率的影响净电荷对迁移率的影响可以在凝胶中可以在凝胶中加入加入SDS,SDS,SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种电荷间的电分子原有电荷量。因而掩盖了不同种电荷间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小十二烷基磺酸钠（十二烷基磺酸钠（SDS）聚丙稀酰胺凝聚丙稀酰胺凝胶

12、电泳测定蛋白质分子量胶电泳测定蛋白质分子量应用应用第16页，此课件共57页哦为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入入()。SDS能使蛋白质发生完全变性。由能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下的作用下会解聚成单条肽链，会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是因此测定的结果只是()。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，复合物，SDS所所带负电荷带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差因而掩盖了

13、不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于别，使电泳迁移率完全取决于()。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。SDS单条肽链的分子量单条肽链的分子量分子的大小分子的大小第17页，此课件共57页哦电泳检测电泳检测PCR结果结果琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳第18页，此课件共57页哦二二 实验操作实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理样品处理粗分离粗分离纯纯化化纯度鉴定纯度鉴定第19页，此课件共57页哦血液组成成分血液组成成分阅读思考

14、：阅读思考：1.血液由血液由_和和_两部分组成。两部分组成。2.血细胞中血细胞中_细胞数量最多，细胞的含量最高细胞数量最多，细胞的含量最高的的有机有机化合物是化合物是_。3.该化合物是由该化合物是由_和和_构成的，构成的，其中每个亚基中都含有一个能与其中每个亚基中都含有一个能与O2和和CO2结合的结合的_基团。基团。血浆血浆血细胞血细胞红细胞红细胞血红蛋白血红蛋白2条条-肽链肽链2条条-肽链肽链亚铁血红素亚铁血红素第20页，此课件共57页哦第21页，此课件共57页哦1.洗洗涤涤红红细细胞胞阅读思考：洗涤的阅读思考：洗涤的目的目的是什么？洗涤的是什么？洗涤的方法方法是什么？是什么？洗洗涤干净涤干

15、净的标志是什么？的标志是什么？血液血液100mL3g柠檬酸钠柠檬酸钠低速离心低速离心2min红细胞红细胞血血浆浆吸出血浆吸出血浆红细胞红细胞5倍体积生理盐水倍体积生理盐水搅拌搅拌10min重复洗涤重复洗涤3次，次，直至上清液没有黄色直至上清液没有黄色其他血细胞第22页，此课件共57页哦2.释放血红蛋白释放血红蛋白阅读思考：阅读思考：1.释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？2.为了加速释放过程，采取了什么措施？为了加速释放过程，采取了什么措施？目的分析：目的分析：1.蒸馏水蒸馏水的作用是的作用是_。2.加入加入甲苯甲苯的作用是的作

16、用是_。3.充分搅拌的目的是充分搅拌的目的是_。使红细胞大量吸水胀裂使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂加速红细胞的破裂第23页，此课件共57页哦第第1层（最上层）：层（最上层）：（）甲苯层）甲苯层第第2层（中上层）：层（中上层）：（）的沉淀层，的沉淀层，（）色薄层固体）色薄层固体第第3层（中下层）：层（中下层）：（）的水溶液层的水溶液层（）的液体）的液体第第4层（最下层）：层（最下层）：其它杂质（其它杂质（）的沉淀层）的沉淀层无色透明无色透明脂溶性物质脂溶性物质白白血红蛋白血红蛋白红色透明红色透明暗红色暗红色第27页，此课件共57页哦滤纸滤纸过滤过滤脂类物

17、质脂类物质3.3.分离血红蛋白分离血红蛋白分离过程分离过程红细胞红细胞混合液混合液高速离心高速离心10min离心离心管管烧杯烧杯有机溶剂有机溶剂血红蛋白血红蛋白第28页，此课件共57页哦取取()ml的血红蛋白溶液装入（的血红蛋白溶液装入（）中，）中，将透析袋放入盛有将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为的物质的量浓度为20mmol/L的（的（）中，）中，pH为（为（），透析），透析12小时，目的是（小时，目的是（）或用于更换样品中的（）或用于更换样品中的（）。透析袋）。透析袋一般用一般用硝酸纤维素硝酸纤维素制成，又称玻璃纸。制成，又称玻璃纸。除去样品中分子量较小的杂质除去样品中分子量较小的

18、杂质透析袋透析袋磷酸缓冲液磷酸缓冲液7.0缓冲液缓冲液4 4 透析透析(粗分离粗分离)1第29页，此课件共57页哦第30页，此课件共57页哦纯化方法本实验采用纯化方法本实验采用凝胶色谱法凝胶色谱法1.凝胶色谱柱的制作：凝胶色谱柱的制作：2.凝胶色谱柱的装填：凝胶色谱柱的装填：3.样品的加入和洗脱样品的加入和洗脱第31页，此课件共57页哦步骤步骤操作要求操作要求立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h12h洗涤平衡洗涤平衡一次性缓慢倒入；轻轻敲打一次性缓慢倒入；轻轻敲打装填悬浮液装填悬浮液凝胶颗粒蒸馏水凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀充分溶胀根据色谱柱体积计算凝胶用量根据色谱柱体积计算凝胶用

19、量色谱柱垂直固定在支架上色谱柱垂直固定在支架上配制悬浮液配制悬浮液计算称量凝胶计算称量凝胶固定色谱柱固定色谱柱材料：材料：交联葡聚糖凝胶交联葡聚糖凝胶G-75G-75 20mmol/L20mmol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液“G”“G”表示什么？表示什么？7575代表什么？代表什么？2、凝胶色谱柱的装填、凝胶色谱柱的装填第32页，此课件共57页哦2.凝胶色谱制作凝胶色谱制作1）凝胶色谱柱的制作）凝胶色谱柱的制作取长取长4040厘米，内径厘米，内径1.61.6厘米的玻璃管，厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。两端需用砂纸磨平。底塞的制作：底塞的制作：打孔打孔 挖出凹穴挖出凹穴 安装移液管头部安装移液管头

20、部 覆盖尼龙网覆盖尼龙网，再用，再用100100目尼龙纱包好。目尼龙纱包好。a a、选择合适的的橡皮塞，中间、选择合适的的橡皮塞，中间打孔；打孔；b b、在橡皮塞顶部切出锅底状的（、在橡皮塞顶部切出锅底状的（），），在在0.5ml0.5ml的（的（）头部切下（）头部切下（）长的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超过橡长的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。皮塞的凹穴底面。凹穴凹穴移液管移液管5cm5cm第33页，此课件共57页哦底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液

21、体残留，蛋白质分离不彻底。致液体残留，蛋白质分离不彻底。c.c.剪尼龙网小圆片覆盖在（剪尼龙网小圆片覆盖在（）上，用（上，用（）的尼龙纱将橡皮塞（）的尼龙纱将橡皮塞（）包好，插到玻璃管一端。）包好，插到玻璃管一端。d d、色谱柱下端用移液头部做（、色谱柱下端用移液头部做（），），连接一细的（连接一细的（），并用螺旋夹控），并用螺旋夹控制尼龙管的（制尼龙管的（），另一端放入），另一端放入收集（收集（）的收集器内）的收集器内橡皮塞的凹面橡皮塞的凹面100100目目上部上部出口部位出口部位尼龙管尼龙管打开与关闭打开与关闭色谱流出液色谱流出液第34页，此课件共57页哦安装其他附属结构。安装其他附属结构

22、。顶塞的制作：顶塞的制作：插入安装了玻璃管的橡皮塞插入安装了玻璃管的橡皮塞组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。第35页，此课件共57页哦2）凝胶色谱柱填料的处理）凝胶色谱柱填料的处理（1 1）凝胶的选择：）凝胶的选择：（）（）（G-75G-75）“G G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度表示凝胶的交联程度，膨胀程度 及分离范围。及分离范围。7575表示凝胶的得水值，即每克凝胶表示凝胶的得水值，即每克凝胶 膨胀时吸水膨胀时吸水7.57.5克。克。（2 2）方法：）方法：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于（凝胶浸

23、泡于（）中充分溶胀后，配）中充分溶胀后，配成（成（）。）。蒸馏水蒸馏水凝胶悬浮液凝胶悬浮液交联葡聚糖凝胶交联葡聚糖凝胶第36页，此课件共57页哦固定：将色谱柱处置固定在支架上固定：将色谱柱处置固定在支架上装填：装填：将（将（）一次性的缓慢倒一次性的缓慢倒入（入（）内，装填时轻轻敲动色谱）内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。柱，使凝胶填装均匀。（3）凝胶色谱柱的装填方法）凝胶色谱柱的装填方法凝胶悬浮液凝胶悬浮液色谱柱色谱柱注意：注意：凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。装填凝胶柱时不能有气泡存在：之间的空隙。装填凝胶柱时不能有气泡存在：因为气泡会

24、搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。降低分离效果。第37页，此课件共57页哦洗涤平衡洗涤平衡 装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在()()高高的操作压下，用的操作压下，用300ml300ml的的20mmol/l的的磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pHpH为为7.07.0）充分（）充分（）1212小时。小时。洗涤平衡洗涤平衡注意液面不要低于凝胶表面，否则可能有气注意液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。不能发生洗脱液流大分子物质的分

25、离效果。不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象，否则重新填装。干，露出凝胶颗粒的现象，否则重新填装。50cm50cm第38页，此课件共57页哦3 3）样品加入与洗脱）样品加入与洗脱加样前加样前打开下端出口，使柱内凝胶面打开下端出口，使柱内凝胶面上的（上的（）缓慢下降到）缓慢下降到与（与（）平齐，关闭出）平齐，关闭出口口缓冲液缓冲液凝胶面凝胶面第39页，此课件共57页哦加加透析透析样样品品第40页，此课件共57页哦调整缓冲液面：与凝胶面平齐调整缓冲液面：与凝胶面平齐滴加透析样品：用（滴加透析样品：用（）将）将1ml（）的样品）的样品加到色谱柱的（加到色谱柱的（）样品渗入凝胶床：样品渗入凝胶床：（

26、）洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱收集：收集：待（待（）接近色谱柱底端时，接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每（用试管收集流出液，每（）收集一试管）收集一试管连续收集连续收集注意正确的加样操作：注意正确的加样操作：不要触及破坏凝胶面不要触及破坏凝胶面 贴壁加样贴壁加样 使吸管管口沿管壁环绕移动使吸管管口沿管壁环绕移动吸管吸管透析液透析液顶端顶端样品完全进凝胶层样品完全进凝胶层5ml红色的蛋白质红色的蛋白质第41页，此课件共57页哦3、样品的加入和洗脱、样品的加入和洗脱1.调液面调液面 2.加样加样 3.再调液面再调液面 4.洗脱洗脱 5.收集收集缓冲液缓冲液凝

27、胶凝胶注注意意事事项项第42页，此课件共57页哦注意事项注意事项1、红细胞的洗涤：、红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少；低速、短时离心。洗涤次数不能过少；低速、短时离心。2、色谱柱的装填：、色谱柱的装填：装完后，立即用缓冲液洗涤、平衡凝胶使装完后，立即用缓冲液洗涤、平衡凝胶使装填尽量紧密，降低颗粒间装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。隙；无气泡；洗脱液不能断流。3、凝胶的预处理凝胶的预处理：沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡4、色谱柱成功标志：、色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。红色区带均匀一致地移动。否则容易使白细胞、否则容易使白细胞、

28、血小板、淋巴细胞等血小板、淋巴细胞等其他其他血细胞血细胞同同红细胞红细胞一块儿沉淀，一块儿沉淀，而无法将红细胞分离！而无法将红细胞分离！第43页，此课件共57页哦血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。观，大大简化了实验操作。思考思考第44页，此课件共57页哦血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。包括：样品处

29、理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即（）；然后通过凝胶色谱法）；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的（的（）；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进）；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行（行（）。）。思考思考样品的粗分离样品的粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定第45页，此课件共57页哦3.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳判断（判断

30、（）的蛋白质是否达到要求，）的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质的鉴定。需要进行蛋白质的鉴定。纯化纯化第46页，此课件共57页哦3.SDS3.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋鉴定血红蛋白纯度白纯度（1 1）试剂的配制）试剂的配制丙烯酰胺和丙烯酰胺和N,N-N,N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺 用去离子水用去离子水配制配制29%29%（29 g/100 mL29 g/100 mL，下同）的丙烯酰胺和，下同）的丙烯酰胺和1%1%的的N,N-N,N-甲叉双丙烯酰胺的贮存液甲叉双丙烯酰胺的贮存液十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDSSDS）用去离子水配成用去离子水配成10%10%的

31、的贮存液，于室温保存。贮存液，于室温保存。用于制备分离胶和浓缩胶的用于制备分离胶和浓缩胶的TrisTris缓冲液缓冲液 TEMED TEMED：作用通过催化过硫酸铵形成自由基而：作用通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。第47页，此课件共57页哦用去离子水配制用去离子水配制10%10%过硫酸铵：作用提供驱动过硫酸铵：作用提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液须配制新鲜液。溶液须配制新鲜液。TrisTris甘氨酸电泳缓冲液甘氨酸电泳缓冲液 25 mmol/L Tris25 mmol/L

32、 Tris，250 mmol/L 250 mmol/L 甘氨酸甘氨酸 (pH 8.3)(pH 8.3)，0.1%0.1%的的SDSSDS。样品处理液样品处理液 50 mmol/L Tris50 mmol/L TrisHCl(pH 6.8)HCl(pH 6.8)，100 mmol/L DTT(100 mmol/L DTT(巯基苏糖醇巯基苏糖醇)或用或用5%5%的巯基乙醇，的巯基乙醇，2%2%的的SDSSDS，0.1%0.1%的溴酚蓝，的溴酚蓝，10%10%的甘油。的甘油。染色液染色液 0.1%0.1%的考马斯亮蓝的考马斯亮蓝R250R250，40%40%的甲醇，的甲醇，10%10%的冰醋酸的冰醋

33、酸脱色液脱色液 10%10%的甲醇和的甲醇和10%10%的冰醋酸。的冰醋酸。第48页，此课件共57页哦由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因此操作必须在通风橱内或通风处进行。此操作必须在通风橱内或通风处进行。TEMEDTEMED和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命。因皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命。因此在进行电泳操作时一定按照实验要求和步此在进行电泳操作时一定按照实验要求和步骤完成。操作时要戴好一次性手套

34、。骤完成。操作时要戴好一次性手套。第49页，此课件共57页哦 SDS-SDS-聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺分离胶制备分离胶制备1)根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板2 2）SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶制备制备用去离子水用去离子水4.6 mL4.6 mL，30%30%的丙烯酰胺的丙烯酰胺2.7 mL2.7 mL，1.5mol1.5mol、pH 8.8pH 8.8的的TrisTris缓冲液缓冲液2.5 mL2.5 mL，10%10%的的SDS SDS 0.1 mL0.1 mL，10%10%的过硫酸胺的过硫酸胺0.1 mL0.1 mL，TEMED 0.006mLTE

35、MED 0.006mL，混合均匀，迅速灌注在两玻璃板的间隙中间，混合均匀，迅速灌注在两玻璃板的间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间要留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加梳子的齿长再加0.5 0.5 cm)cm)，再在胶液面上小心注入一层水（约高，再在胶液面上小心注入一层水（约高2 23 3 mmmm），以阻止氧气进入凝胶溶液。），以阻止氧气进入凝胶溶液。（2 2）电泳方法步骤）电泳方法步骤第50页，此课件共57页哦配制配制SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液。用去聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液。用去离子水离子水2.7 mL2.7 mL，30%30%的丙烯酰胺的丙烯酰胺0.67 mL0.67

36、mL，1.0 mol1.0 mol、pH 6.8pH 6.8的的TrisTris缓冲液缓冲液0.5 mL0.5 mL，10%10%的的SDS0.041 mLSDS0.041 mL，10%10%的过硫酸胺的过硫酸胺0.04 mL0.04 mL，TEMED 0.004 mLTEMED 0.004 mL，混合均，混合均匀，直接灌注在聚合的分离胶上，并立即在浓缩胶溶匀，直接灌注在聚合的分离胶上，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。整个操作过程应注意避免气泡液中插入干净的梳子。整个操作过程应注意避免气泡的产生。然后再补加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间的产生。然后再补加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间的空隙，将

37、凝胶垂直放置于室温下聚合。的空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合。分离胶聚合完全后（约分离胶聚合完全后（约30 min30 min），倾出覆盖水层，），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。再用滤纸吸净残留水。3 3）样品处理）样品处理第51页，此课件共57页哦5)5)加样加样在电泳样品中按在电泳样品中按1111体积比加入样品处理液，体积比加入样品处理液，在在100 100 温度下加热温度下加热3 min3 min，以使蛋白质变性。，以使蛋白质变性。按顺序加样，加样量通常为按顺序加样，加样量通常为101025 L25 L。样品可以。样品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后多加几个，例如，血浆样品红

38、细胞破碎后(即进行凝即进行凝胶色谱分离之前胶色谱分离之前)的样品和凝胶色谱分离之后的样的样品和凝胶色谱分离之后的样品品4 4）浓缩胶聚合完全后（）浓缩胶聚合完全后（30 min30 min），小心移出梳子。把），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入TrisTris甘氨酸甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。的气泡。第52页，此课件共57页哦7 7）剥胶）剥胶 从电泳装置上卸下玻璃板，用刮刀撬开玻璃从电泳装置上卸下玻璃板，用刮刀撬开玻璃板。将紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切板。将紧靠

39、最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角，以标注凝胶的方位。去一角，以标注凝胶的方位。8 8）染色）染色 将电泳凝胶片放在考马斯亮蓝染色液中染色将电泳凝胶片放在考马斯亮蓝染色液中染色1-2 h1-2 h。6)6)电泳电泳 将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8 8 V/cmV/cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15 V/cm15 V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约上方约1 cm1 cm处，关闭电源。处，关闭电源。第53页，此课件共57页哦10)10)观察结果：观察结

40、果：SDSSDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，电泳的成功关键之一是电泳过程中，待别是样品制备过程中蛋白质与待别是样品制备过程中蛋白质与SDSSDS的的结合程度。结合程度。9)9)脱色：脱色：染色完毕，倾出染色液染色完毕，倾出染色液,换脱色液脱色换脱色液脱色3-10 3-10 h h，其间需多次更换脱色液至背景清楚。，其间需多次更换脱色液至背景清楚。第54页，此课件共57页哦观察你处理的血液样品离心后是否分层（见观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图教科书图5-185-18），如果分层不明显，可能），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的

41、原因。此外，离心速度过高和时间过长，因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。的提取纯度。三三实验结果分析与评价实验结果分析与评价第55页，此课件共57页哦由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖例如蓝色葡聚糖200020

42、00或红色葡聚糖，观察色带或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。要重新装柱。第56页，此课件共57页哦如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。第57页，此课件共57页哦