转基因动物课件.ppt

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1、转基因动物第1页，此课件共84页哦第一节实验动物的胚胎工程胚胎工程是指运用人工方法对动物的胚胎及配子进行操作和改造，是改良动物品种品系，保存动物种子资源及转基因动物制备的重要手段。第2页，此课件共84页哦主要包括四大类技术体系：胚胎移植相关技术；动物克隆技术；胚胎干细胞技术；转基因动物技术等。第3页，此课件共84页哦一、胚胎移植相关技术（一）胚胎移植胚胎移植（embryotransfer）是一项难度较高的显微操作过程，是胚胎工程的重要基础。根据胚胎发育阶段不同，胚胎移植可分为输卵管移植和子宫移植。原核胚胎到桑葚胚期的胚胎进行输卵管移植，囊胚期后的胚胎进行子宫移植。第4页，此课件共84页哦按照操

2、作方法,胚胎移植又可分为手术法和非手术法。小型实验动物常采用手术法，大动物常采用非手术法。第5页，此课件共84页哦v（二）排卵控制排卵控制是通过对雌性动物采用外源激素处理，改变其性周期和排卵数来实现的。目前常用到的激素有促卵泡激素（FSH），促黄体激素（LH），孕马血清促性腺激素（PMSG），人绒毛膜促性腺激素（HCG）。第6页，此课件共84页哦v其中FSH的生物功能是刺激卵巢中卵泡的成熟并分泌雌激素；LH也称促间质细胞激素（ICSH），其生物功能是激发排卵，促使黄体从萎缩破裂的卵泡中形成并分泌雌激素和孕激素；PMSG可以促进雌性动物卵泡的发育、排卵及黄体的形成；HCG也可促进卵泡发育和排卵。

3、实际应用中，常把常把FSH和和LH，HCG和和PMSG配合使用，可取得较好效果。配合使用，可取得较好效果。第7页，此课件共84页哦v(三)体外受精和显微受精v体外受精（invitrofertilization，IVF）是成熟卵细胞与经过处理的精子在体外结合而发育成合子的过程。体外受精的合子经过体外或者异种动物体内培养，再移到同种动物体内妊娠产子，由此得到的动物称为试管动物。第8页，此课件共84页哦v体外受精所用的精子在大、中型动物可采用人工按摩或电刺激法获得,小型动物需用手术法从附睾获得。卵子来源有两种方法,小型动物系采用超数排卵处理,从输卵管采集体内成熟卵子;或采用手术方法,从卵巢上采集未成

4、熟卵子进行体外成熟。牛、羊等大、中型动物可进行活体采卵或从屠宰后动物的卵巢获得。第9页，此课件共84页哦制约体外受精技术发展的主要因素有：在体外培养的卵母细胞的细胞质是否真正成熟不仅影响到受精，而且对卵裂及胚胎发育甚至着床和出生后也有较大影响，应在培养条件上进行研究；多精子受精难以控制，导致正常发育率低，可通过调整精子浓度或受精时间来控制；体外受精的胚胎在体外发育至一定阶段时会发生退行性变化，即发育阻滞(block)。第10页，此课件共84页哦v显微受精（microfertilization）技术是通过对动物配子进行显微操作以使其受精的技术。它是在体外受精的基础上，随着显微操作技术和设备的不断

5、发展和完善而出现的。这一技术目前有透明带下注射、透明带钻孔、透明带部分切口和卵细胞质内注射等方法。第11页，此课件共84页哦v（四）胚胎培养v胚胎培养（embryoculture）是指在人工创造的类似于体内条件的环境中，对获取的早期胚胎进行体外培养，以便观察其发育或人工干预某一发育过程的技术。第12页，此课件共84页哦v目前胚胎培养一般有两种方法。一种是共培养系统，这种系统首先要求在培养皿上贴壁培养输卵管上皮细胞、颗粒细胞等，然后将受精卵和贴壁培养的上皮细胞一起培养，直至生产出可用胚胎。另一种是简单化学限定培养法。相对而言，简单化学限定培养法使用方便、培养液配制简单，而且成分明确便于研究特定物

6、质对胚胎发育影响的特点，因此在早期胚胎体外培养中得到广泛使用。第13页，此课件共84页哦v（五）胚胎保存v胚胎保存（embryopreservation）是指应用超低温冷冻技术将胚胎保存起来而不丧失活力。1971年，whittingham首次报道冷冻小鼠胚胎获得成功。随后，对大鼠、兔胚胎的冷冻保存也取得了成功。到目前为止，已有十多种哺乳动物胚胎冷冻获得成功。超低温长期保存胚胎对生命科学的发展具有重要实际意义。第14页，此课件共84页哦v冷冻保存实验动物胚胎的方法有多种，主要有常规冷冻法、玻璃化冷冻法等。一般包括抗冻保护剂的添加、植冰和降温、胚胎解冻、抗冻保护剂的去除等步骤。第15页，此课件共8

7、4页哦v常规冷冻法是将经冷冻保护剂处理的胚胎以较慢速度（1/分钟）降温至-7，平衡10分钟后，在此温度诱发结晶，再平衡10分钟，以0.10.3/分钟的速度降温至-36以下，投入液氮中保存。按这种方法冻存的胚胎解冻时需要慢速升温。脱去冷冻保护剂的浓度方向与冷冻时相反，按相同浓度梯度，从高浓度向低浓度进行。v常规冷冻法的优点是细胞脱水完全，细胞内不易形成冰晶；缺点是很费时，冷冻保护剂处理胚胎的时间过长，同时设备昂贵，花费高。第16页，此课件共84页哦v玻璃化冷冻法（vitrification）是Rall和Fahy于1985年建立的一种快速，简捷有效的超低温冷冻方法。这种方法采用的高浓度冷冻保护剂组

8、成的玻璃化液(渗透和非渗透性保护剂相结合)，在低温下变粘稠，不发生结晶即可固化，此固体物质能保持分子和离子正常的液态分布，是一种超快速冷冻模式。第17页，此课件共84页哦v玻璃化液中主要的冷冻保护剂是二甲基亚砜（dimethylsulfoxide,DMSO）和乙二醇（ethyleneglycol,EG）。将胚胎在这种玻璃化液中处理以后，可直接投入液氮中保存。玻璃化冷冻保存的胚胎，解冻时需要快速复温。v玻璃化冷冻法简化了冷冻过程，冻存效果好，而且这种方法不需要冷冻仪器，设备简单，费用少。第18页，此课件共84页哦v二、动物克隆技术v三、胚胎干细胞技术v干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，其

9、发育受多种内在机制和微环境因素的影响。根据其发育阶段，干细胞分为胚胎干细胞（embryonicstemcell）和成体干细胞（AdultStemCell）。第19页，此课件共84页哦v胚胎干细胞是一种存在于早期胚胎的具有发育全能性的细胞，它可以自我更新并分化为体内所有类型的组织细胞，包括生殖细胞。胚胎干细胞的分化和增殖是动物发育的基础。目前，胚胎干细胞的来源主要有两个，胚胎内细胞团细胞（innercellmass）和胚胎原始生殖嵴细胞。第20页，此课件共84页哦第二节转基因动物第21页，此课件共84页哦v 转基因动物是当今生物医学研究的一个转基因动物是当今生物医学研究的一个热点，也是实验动物科

10、学史上又一突破性进热点，也是实验动物科学史上又一突破性进展。转基因技术是本世纪展。转基因技术是本世纪8080年代初发展起来年代初发展起来的，是在动物整体水平研究目的基因的生物的，是在动物整体水平研究目的基因的生物技术，具有技术，具有“分子及细胞水平操作，组织及分子及细胞水平操作，组织及动物整体水平表达动物整体水平表达”的特点，是常规分子生的特点，是常规分子生物学的拓展和延伸。它克服了物种之间的生物学的拓展和延伸。它克服了物种之间的生殖隔离状态，实现了动物种与种之间的遗传殖隔离状态，实现了动物种与种之间的遗传物质交换和重组，不仅为遗传物质的研究提物质交换和重组，不仅为遗传物质的研究提供了新的手段

11、，也扩大了生命科学研究的视供了新的手段，也扩大了生命科学研究的视野。野。第22页，此课件共84页哦 转基因动物是动物基因工程在医学生物学转基因动物是动物基因工程在医学生物学研究中的突出成果。研究中的突出成果。近十年来，为分子遗传学、发育生物近十年来，为分子遗传学、发育生物学、医学遗传学、肿瘤研究及优良经济动学、医学遗传学、肿瘤研究及优良经济动物的开发研究等多方面做出了很大的贡献。物的开发研究等多方面做出了很大的贡献。第23页，此课件共84页哦Gordon 等人首次成功地将含有等人首次成功地将含有HSV 和和SV40DNA 片段的重组质粒片段的重组质粒DNA 以显微注射以显微注射法导入小鼠受精卵

12、的雄原核内，得到了带有这法导入小鼠受精卵的雄原核内，得到了带有这种外源种外源DNA 顺序的顺序的TGM。1982 年年Palmiter 等运用此法得到的所谓等运用此法得到的所谓 “超级巨鼠超级巨鼠”,曾引起整个生物学界的轰动。曾引起整个生物学界的轰动。第24页，此课件共84页哦 到目前为止，人类已获得转基因鱼、鼠、到目前为止，人类已获得转基因鱼、鼠、羊、猪、兔、牛等大小动物。羊、猪、兔、牛等大小动物。从转基因动物所获得的资料几乎涉及从转基因动物所获得的资料几乎涉及医学遗传学、肿瘤学、免疫学等的基因研医学遗传学、肿瘤学、免疫学等的基因研究，还涉及生物药物的研究，基因治疗的究，还涉及生物药物的研究

13、，基因治疗的开发研究等。开发研究等。第25页，此课件共84页哦v转基因动物研究在我国开展得并不算太迟，我国1984年就有报道，与世界上第一批转基因动物的诞生仅两年之差。我国也是从转基因小鼠做起，主要是建立疾病的转基因小鼠模型和进行一些基础研究。选用最多的动物是小鼠、大鼠、兔等。疾病模型的种类主要有传染病、遗传病、和肿瘤三大类。迄今真正获得成功并通过鉴定的只有乙肝小鼠模型。在目的基因的选择上，除了选用建立动物疾病模型的基因外，使用最多的是生长激素基因。在育种方面，多是通过转入生长素基因来提高畜禽生长速度。在转基因鱼研究方面我国处于领先水平。利用转基因动物技术还可能生产出适于人类器官移植所需的器官

14、。我国已有学者开始这一领域的探索。第26页，此课件共84页哦一、转基因动物的概念一、转基因动物的概念 转基因动物转基因动物(transgenic animal)是指染色体是指染色体基因组中整合有外源基因并能遗传给后代的一类基因组中整合有外源基因并能遗传给后代的一类动物。动物。整合到动物染色体基因组的基因称为转基整合到动物染色体基因组的基因称为转基因。因。第27页，此课件共84页哦 只只有有部部分分组组织织细细胞胞的的基基因因组组中中整整合合有有外外源源基基因因的的动动物物称称为为嵌嵌合合体体动动物物(chimera animal)。逆转录病毒感染法、胚胎干细胞介导逆转录病毒感染法、胚胎干细胞介

15、导法制备的法制备的 动物第一代为嵌合体动物。动物第一代为嵌合体动物。第28页，此课件共84页哦转基因动物与转基因动物与嵌合体动物的区别嵌合体动物的区别:相同点：它们染色体基因组内都整合有外源基因。相同点：它们染色体基因组内都整合有外源基因。不同点：不同点：1.转基因动物所有组织细胞基因组中均整合有转基因动物所有组织细胞基因组中均整合有外源基因，嵌合体只是部分组织细胞有。外源基因，嵌合体只是部分组织细胞有。2.转基因动物能将外源基因遗传给子代，嵌合体只有当转基因动物能将外源基因遗传给子代，嵌合体只有当外源基因整合入生殖细胞时才能遗传。外源基因整合入生殖细胞时才能遗传。3.外源基因的整合发生在第一

16、次卵裂以前则动物所有组织细外源基因的整合发生在第一次卵裂以前则动物所有组织细胞中都整合有外源基因，若发生在第一次卵裂后则得到嵌胞中都整合有外源基因，若发生在第一次卵裂后则得到嵌合体动物。合体动物。第29页，此课件共84页哦v二转基因动物的基本原理转基因动物构建的基本原理是将改建后的目的基因（或基因组片段）用显微注射等方法注入实验动物的受精卵（或着床前胚胎细胞），然后将此受精卵或（着床前胚胎细胞）再植入受体动物的输卵管（或子宫）中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物。人们可以通过分析转基因和动物表型的关系，从而揭示外源基因的功能，也可以通过转入目的基因培育品种优良的工程动物。第30页，此课件共

17、84页哦三、转基因动物的构建三、转基因动物的构建v（一）、供体DNA的准备 待转移的外源基因可以是1、预先分离的某一基因；2、逆转录法得到的cDNA；3、人工合成的DNA片段；4、含有目的基因的供体细胞基因组DNA。通常将拟导入的目的基因在载体质粒上制成克隆，然后转化至大肠杆菌，扩增质粒；分离纯化重组质粒，用适当的限制性内切酶消化，制备成线状基因片段，最后将线状或环状重组DNA分别溶入无菌生理盐水，浓度为50100g/ml C贮存备用。第31页，此课件共84页哦（二）实验动物的准备（以小鼠为例）1、供体动物:转基因研究中提供受精卵的母鼠。由超排处理的母鼠和正常雄鼠交配后得到。若无遗传背景的特殊

18、要求，可选用F1动物，46周龄的雌鼠用孕马血清（PMS）和人绒毛膜促性腺激素（hCG）作超排卵处理。PMS与hCG注射间隔为4248小时，第二次注射后让雌鼠与68周龄的雄鼠合笼。次日选择有阴道栓的雌鼠，颈椎脱臼法处死，取输卵管，解剖镜下用注射器冲出受精卵，待用。第32页，此课件共84页哦2、受体动物（假孕雌鼠）：转基因研究中接受受精卵的假孕雌鼠。由健康雌鼠（6周龄-5月龄）与结扎雄鼠交配（时间应于供体动物同时进行），次日选择有阴栓的动物待用。3、不育雄性动物（结扎雄鼠）：结扎输精管的雄鼠，其具有正常的交配能力，但精液中无精子，和母鼠交配后，母鼠呈假孕态。4、种鼠：有生殖能力的正常雄鼠。第33页

19、，此课件共84页哦（三）、基因导入方法（三）、基因导入方法1、受精卵雄原核显微注射法、受精卵雄原核显微注射法2、胚胎干细胞（、胚胎干细胞（ES细胞）法细胞）法3、逆转录病毒感染法、逆转录病毒感染法4、体细胞核移植法、体细胞核移植法5、精子载体法、精子载体法6、YAC法法第34页，此课件共84页哦1、显微注射法显微注射法 以单细胞受精卵为靶细胞，利用显微注射技术以单细胞受精卵为靶细胞，利用显微注射技术将构建好的载体将构建好的载体DNA直接注射入受精卵的原核，直接注射入受精卵的原核，再将接受注射的受精卵移入受体输卵管继续发育获再将接受注射的受精卵移入受体输卵管继续发育获得转基因动物个体。得转基因动

20、物个体。目前应用较广泛目前应用较广泛,最早最经典的方法。最早最经典的方法。第35页，此课件共84页哦这一方法的这一方法的实验程序实验程序如下：如下：v准备假孕母鼠（养母）准备假孕母鼠（养母）v受精卵的准备受精卵的准备v基因导入基因导入v胚胎移植胚胎移植v对幼鼠的鉴定对幼鼠的鉴定第36页，此课件共84页哦 原核显微注射的方法建立转基因小鼠流程示意图原核显微注射的方法建立转基因小鼠流程示意图第37页，此课件共84页哦纤维原核显微注射的方法建立转基因小鼠流程示意图纤维原核显微注射的方法建立转基因小鼠流程示意图图图a a 原核显微注射的方法建立转基因小鼠流程示意图原核显微注射的方法建立转基因小鼠流程示

21、意图图图a a 原核显微注射的方法建立转基因小鼠流程示意图原核显微注射的方法建立转基因小鼠流程示意图雄原核显微注射第38页，此课件共84页哦OviductTransfers第39页，此课件共84页哦其成功率的高低主要取决于受精卵和胚胎发其成功率的高低主要取决于受精卵和胚胎发育的时间。育的时间。基因的整合是随机的，多数插入单一染色体基因的整合是随机的，多数插入单一染色体位点中。外源基因的插入会引起宿主基因的位点中。外源基因的插入会引起宿主基因的DNADNA序列重排，缺失，重复或易位。序列重排，缺失，重复或易位。第40页，此课件共84页哦优点：优点：外源外源DNA大小基本不受限制大小基本不受限制(

22、1-50kb)导入过程直观导入过程直观 整合率高整合率高第41页，此课件共84页哦缺点：缺点：设备昂贵、环节较多设备昂贵、环节较多 对操作人员有较高的技术要求对操作人员有较高的技术要求 低效率（尤其是大家畜）低效率（尤其是大家畜）对卵子伤害大，胚胎存活率低对卵子伤害大，胚胎存活率低 基因整合随机性基因整合随机性 转基因沉默转基因沉默第42页，此课件共84页哦2、胚胎干细胞（、胚胎干细胞（ES细胞）法细胞）法ES细胞是早期胚胎的内细胞团经过体外培养建细胞是早期胚胎的内细胞团经过体外培养建立起来的多潜能细胞系。立起来的多潜能细胞系。将携带有外源基因的将携带有外源基因的ES细胞注入到动物的早期细胞注

23、入到动物的早期胚胎内，可产生嵌合体及转基因动物。胚胎内，可产生嵌合体及转基因动物。第43页，此课件共84页哦 它本身是二倍体，能在体外培养，具有高度它本身是二倍体，能在体外培养，具有高度的全能性，可以形成包括生殖细胞在内的所的全能性，可以形成包括生殖细胞在内的所有组织，并且在不同的培养条件下表现出不有组织，并且在不同的培养条件下表现出不同的功能状态。同的功能状态。第44页，此课件共84页哦在在ES细胞细胞上的基因操作：上的基因操作：可以通过逆转录病毒感染、脂质体介导、电可以通过逆转录病毒感染、脂质体介导、电穿孔、磷酸钙共沉淀等方法将外源基因导入穿孔、磷酸钙共沉淀等方法将外源基因导入ES细胞。细

24、胞。第45页，此课件共84页哦GeneratingESCells第46页，此课件共84页哦RetrievalofBlastocysts第47页，此课件共84页哦Injection of ES cells into blastocysts第48页，此课件共84页哦第49页，此课件共84页哦优点：优点：外源基因整合情况的可控性高。外源基因整合情况的可控性高。可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表达的水平及插入的稳定性。定位、表达的水平及插入的稳定性。外源基因导入外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴定细胞的方法多样，细胞鉴定及筛选方便及筛选方便。第50

25、页，此课件共84页哦缺点：缺点：ES细胞系建立及培养困难细胞系建立及培养困难维持维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易细胞的未分化及多向分化潜能不易所得个体为嵌合体所得个体为嵌合体第51页，此课件共84页哦目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较成熟，在大动物上应用较晚。较成熟，在大动物上应用较晚。第52页，此课件共84页哦将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成高将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成高滴度病毒颗粒，人为感染着床前后的胚胎（也滴度病毒颗粒，人为感染着床前后的胚胎（也可直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养可直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养

26、细胞共同培养以达到感染目的细胞共同培养以达到感染目的),获得转基因获得转基因动物的方法。动物的方法。3、逆转录病毒感染法、逆转录病毒感染法第53页，此课件共84页哦 优点：优点：受精卵携带外源基因的阳性率高受精卵携带外源基因的阳性率高 外源基因多单拷贝整合外源基因多单拷贝整合 操作简单，避免注射法对卵子的损害操作简单，避免注射法对卵子的损害 宿主范围广宿主范围广 可同时感染大量胚胎，感染率及胚胎存活率高可同时感染大量胚胎，感染率及胚胎存活率高第54页，此课件共84页哦 缺点：缺点：容纳大小有限容纳大小有限 重组逆转录病毒的长末端容易甲基化，影响重组逆转录病毒的长末端容易甲基化，影响 外源基因的

27、表达外源基因的表达第55页，此课件共84页哦 方式方式 显微注射法显微注射法 逆转录病毒法逆转录病毒法DNA长度长度 50kb,10-15kb,与时相与时相 单细胞卵单细胞卵 4-6细胞卵细胞卵移卵部位移卵部位 输卵管输卵管 子宫子宫整合方式随机，多拷贝随机，单拷贝整合方式随机，多拷贝随机，单拷贝表达受宿主旁侧表达受宿主旁侧 受受LTR影响影响 的的DNA影响影响 易缺失易缺失 传代传代 可以可以 有时不可以有时不可以 子代嵌合体机率高子代嵌合体机率高 第56页，此课件共84页哦4、体细胞核移植法、体细胞核移植法 将外源基因导入到体细胞中将外源基因导入到体细胞中，再将该细胞进行再将该细胞进行培

28、养培养，选择其中带有外源基因的细胞进行扩增选择其中带有外源基因的细胞进行扩增，用这种细胞的细胞核进行核移植用这种细胞的细胞核进行核移植（把体细胞核把体细胞核植入一个去了核的卵母细胞中植入一个去了核的卵母细胞中，融合并激活融合并激活），），将重组胚进行体外培养或者植入同步化的假孕将重组胚进行体外培养或者植入同步化的假孕动物的输卵管。动物的输卵管。第57页，此课件共84页哦 在理论上应该全部为阳性转基因动物，在理论上应该全部为阳性转基因动物，而且外源基因的整合率可达而且外源基因的整合率可达100%。第58页，此课件共84页哦v1997年，英国：克隆羊年，英国：克隆羊Dollyv1999年年,中国：

29、陈大元中国：陈大元 利用兔的卵母细胞获得种间核移植的大利用兔的卵母细胞获得种间核移植的大熊猫胚胎熊猫胚胎v2000年，美国：转基因牛年，美国：转基因牛第59页，此课件共84页哦 优点：优点：对体细胞进行基因改造后，用于核移植可以对体细胞进行基因改造后，用于核移植可以提高转基因的效率，不仅具有提高转基因的效率，不仅具有“ES细胞途径细胞途径”的全部优点，且物种适用面广，无需经过嵌合的全部优点，且物种适用面广，无需经过嵌合体育种就可获得纯合个体，周期短，效率高。体育种就可获得纯合个体，周期短，效率高。第60页，此课件共84页哦缺点：缺点：技术上难度大，技术上难度大，成功率极低，成功率极低，胚胎死亡

30、率高，胚胎死亡率高，非一般实验室可以开展。非一般实验室可以开展。第61页，此课件共84页哦5、精子载体法、精子载体法 直接以精子为载体的转基因方法。直接以精子为载体的转基因方法。将成熟精子与外源共培养，成熟精子将成熟精子与外源共培养，成熟精子 与外源与外源DNA预培养之后，使精子有能力携带预培养之后，使精子有能力携带 外源外源DNA进入卵子中，使之受精，并使外源进入卵子中，使之受精，并使外源DNA 整合到染色体中。整合到染色体中。第62页，此课件共84页哦 目前国际上只有目前国际上只有1例成功模型，国内例成功模型，国内 也很少有相关报道，精子载体法很少被应用。也很少有相关报道，精子载体法很少被

31、应用。第63页，此课件共84页哦6、法、法 利用酵母人工染色体利用酵母人工染色体()作为载体作为载体制作转基因动物的方法。制作转基因动物的方法。酵母人工染色体（）载体是近年来酵母人工染色体（）载体是近年来发展起来的新型载体发展起来的新型载体,能克隆百万对碱基能克隆百万对碱基的大片段。的大片段。第64页，此课件共84页哦 优点：优点：保证大片段的完整性保证大片段的完整性。保证较长外源片段在转基因动物研究中的保证较长外源片段在转基因动物研究中的 整合率提高整合率提高。保证了目的基因上下游的侧翼序列的完整性，保证了目的基因上下游的侧翼序列的完整性，因而可以消除或减弱基因整合后的位置效应。因而可以消除

32、或减弱基因整合后的位置效应。第65页，此课件共84页哦 因此因此介导法介导法制备转基因动物具有广阔制备转基因动物具有广阔的应用前景。的应用前景。除上述几种常用的转基因方法外，人们为了除上述几种常用的转基因方法外，人们为了适应于一些特殊需要也探索了一些其他的方适应于一些特殊需要也探索了一些其他的方法。例如诱变技术法。例如诱变技术(P265)等，这些方法都不等，这些方法都不太成熟，其应用也正被人们验证。太成熟，其应用也正被人们验证。第66页，此课件共84页哦（四）、注射后卵（胚胎)的移植v 注射后单细胞至桑椹胚的卵移植到受孕后05天的假孕鼠输卵管内，输卵管移植要求用透明带包裹的卵。注射后35天的囊

33、胚，移植到假孕25天的雌鼠子宫内，子宫移植不需要有透明带。第67页，此课件共84页哦（五）、转基因动物的鉴定v假孕鼠经过胚胎移植后精心饲养，分娩后，取仔鼠尾，剪碎，消化，提取DNA，用PCR、Dot blot等方法鉴定是否含有外源基因，确定转基因动物。第68页，此课件共84页哦（六）、建立转基因鼠系v 首建转基因动物确定后，即用之交配繁殖，以建立转基因鼠系，大部分首建者的下一代50%含外源基因，20%为嵌合体，还有一部分不育。v 若首建者为近交系产生，可用相同种系交配，以维持其遗传背景，首建者来源于非近交系，则可用F1动物与首建者交配繁殖。第69页，此课件共84页哦四、转基因动物的命名四、转基

34、因动物的命名v转基因动物的名称一般包括：构建转基因动物的方法、外源基因的特性、及构建实验室等信息。v 形式如下：TgX(YYYY)Z z z vTg 是Transgene 的宿写vX 代表DNA的插入方式（一般用N表示非同源插入；H代表同源重组；R代表逆转录病毒感染。）vYYYY 是插入序列指示，一般由8个以内字符表示，（如Ins1 鼠胰岛素基因）已命名的基因序列要采用标准基因符号（命名时可查基因数据库）v 实验室指定的序号，转基因动物被证实后，实验室指定的独特号码，至多可用5个字符（数字）第70页，此课件共84页哦vZ z z 实验室密码 指定给每个制备转基因动物实验室的代号。v转基因动物遗

35、传背景为单一品系的，还要在转基因符号前加上动物品系名称。v 如：C57BL/6JTgN(GPDH)23Jwg表示GPDH（人甘油磷酸盐脱氢酶）基因非同源插入C57BL/6J小鼠染色体内，由Jon W.Gordon实验室筛选出的第23号动物。第71页，此课件共84页哦五、转基因动物的特性五、转基因动物的特性v整合拷贝数整合拷贝数1-100左右，多拷贝常以首尾左右，多拷贝常以首尾 相连接的形式存在。相连接的形式存在。v整合是随机的。整合是随机的。v整合是稳定的，可以传给子代。整合是稳定的，可以传给子代。v外源基因可以在一种组织或多种组织中表达。外源基因可以在一种组织或多种组织中表达。v少数外源基因

36、两侧序列有重排现象。少数外源基因两侧序列有重排现象。v基因表达强弱与拷贝数无关，与基因表达强弱与拷贝数无关，与“位置效应位置效应”有关。有关。第72页，此课件共84页哦六、转基因动物的应用六、转基因动物的应用 （一）、（一）、在研究病毒性疾病中的应用在研究病毒性疾病中的应用 1、乙型肝炎的转基因研究乙型肝炎的转基因研究乙乙型型肝肝炎炎是是严严重重危危害害人人类类健健康康的的传传染染性性疾疾病病，HBV一一般般不不易易感感染染培培养养细细胞胞和和常常用用实实验验动动物物，在在一一定定程程度度上上限限制制了了对对其其致致病病机机理理的的研研究究，HBV转转基基因因动动物物的的建建立立为为乙乙肝肝的

37、的研研究究提提供供了了新新的的途途径径。人人们们将将HBV基基因因组组或或其其部部分分片片段段转转入入小小鼠鼠体体内内，研研究究其其在在转转基基因因动动物物体体内内的的表表达达调调控控，肝肝细细胞胞的的损伤，诱癌剂及抗毒剂对转基因鼠的作用等。损伤，诱癌剂及抗毒剂对转基因鼠的作用等。第73页，此课件共84页哦v2、转基因动物在人嗜T淋巴细胞病毒研究中的应用v目前转基因技术已用于人嗜T淋巴细胞病毒（又称人免疫缺陷病毒HIV）的研究，成为人们了解成年T淋巴细胞白血病和艾滋病的工具。整合有HIV前病毒DNA的转基因小鼠子代中的出现综合症。3、在其它病毒性疾病当中的应用v脊髓灰质炎病毒（PVR）受体的转

38、基因鼠，猴病毒40（SV40）转基因鼠，免疫球旦白启动子调控下的单纯疱疹病毒1型胸苷激酶（HSV-1-tk）转基因鼠等的建立于表达为这些病毒性疾病的研究提供了广阔的前景。第74页，此课件共84页哦（二）、在遗传病研究中的应用v转基因动物在遗传学中具有重要作用，被认为是遗传学研究中继连锁分析、体细胞遗传和基因克隆之后的第四代技术。该技术已成功地应用于遗病的研究，主要用于建立遗传病动物模型，以研究单个基因在遗传病发病中的作用，还可以研究药物干预后动物反应机理等。目前这类转基因动物模型主要有：镰刀状细胞贫血、囊性纤维化、家族性高胆固醇血症和高血压等转基因动物模型。第75页，此课件共84页哦（三）、在

39、免疫学中的应用v1、对免疫机制的研究v有人将重排的Ig基因和其对应的抗原基因转入小鼠的受精卵产生的转基因小鼠为研究自身抗原免疫耐受性产生的机制提供了模型动物。第76页，此课件共84页哦v2、建立免疫性疾病动物模型v用Ig的重链基因和轻链基因分别制备转基因小鼠，前者品系为H3，后者为L1，以雌性H3与雄性L1杂交产生转双基因的H3L1小鼠，H3小鼠和L1小鼠均无自身免疫溶血性贫血，而H3L1小鼠却发生了严重程度不同和自身免疫溶血性贫血。其严重程度和转基因小鼠体内产生的自身抗体的量成正比。目前建立的一系列自身免疫性疾病动物模型，为进一步研究自身免疫性疾病的病因和发病机制及预防和治疗尊定了基础。第7

40、7页，此课件共84页哦（四）、基因治疗v基因治疗是通过改变患者遗传物质而达到治疗疾病的一种方法。改变遗传物质的主要途径有：引入功能正常基因、置换致病基因、修饰致病基因。治疗方式包括：体细胞基因治疗和生殖细胞基因治疗。基因治疗目前主要应用于动物，其中包括生殖系统疾病，心血管疾病，肌营养不良等。第78页，此课件共84页哦（五）、在基因表达调控中的应用v 基因表达的调控研究是当今分子生物学研究中最活跃的领域之一。1、转基因动物作为研究外源基因调控的“反应器”v 一些基因的表达产物如酶蛋白，由于对底物的作用有种属特异性，故可用转基因动物作为一个特殊的“反应器”用于研究外源基因的表达调控。第79页，此课

41、件共84页哦2、基因删除（Gene knock out）v利用同源重组原理，使胎干细胞内的目的基因进行定点突变（基因打靶），然后注入到宿主胚泡中，使其发育成目的基因缺陷的嵌合体动物，自交后选出纯合子基因删除动物，通过分析基因删除动物体内单基因缺陷所产生的表型异常来研究基因调控和功能。第80页，此课件共84页哦3、基因多级调节系统的研究v基因的多级调控系统，是指在转基因动物内，目的基因必须在另一种基因的表达产物激活后才能表达，从而对目的基因的功能和调节进行研究的实验体系。第81页，此课件共84页哦（六）、应用于抗病毒育种研究v人们设想将多重抗病毒基因克隆导入动物体从而筛选出具有抗病毒机能的动物体

42、，以提高经济动物的抗病能力。第82页，此课件共84页哦（七）、基因产品的制备v将具有生物活性的旦白的基因导入动物的受精卵或早期胚胎，培育成转基因动物，使外源基因在动物体内高效表达，然后再分离提取目的基因的产物。把转基因动物当作生产生物学性物质的加工厂。生产一些具有重要医学价值的药品和生物制品如：-干扰素、牛-乳清旦白、-干扰素、尿激酶等。第83页，此课件共84页哦七、转基因动物研究出现的问题七、转基因动物研究出现的问题1、制作转基因动物效率低、制作转基因动物效率低2、外源基因在宿主基因组中的行为难以控制、外源基因在宿主基因组中的行为难以控制 3、转基因表达水平低、转基因表达水平低第84页，此课件共84页哦