基因工程技术精选PPT.ppt

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1、关于基因工程技术第1页，讲稿共172张，创作于星期日 一一 概述概述 基因工程技术使很多自然界很难或不能获得的蛋白得以大规基因工程技术使很多自然界很难或不能获得的蛋白得以大规模合成模合成.80年代以来年代以来,表达真核表达真核cDNA,细菌毒素和病毒抗原基因等细菌毒素和病毒抗原基因等,为人类获取大量医用价值的多肽蛋白开辟了新途径为人类获取大量医用价值的多肽蛋白开辟了新途径.基因工程技术生产药品的优点基因工程技术生产药品的优点:生产过去难以获得的生理活生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽性蛋白和多肽,胰岛素胰岛素,干扰素等干扰素等,细胞因子等细胞因子等;可以提供足够数量的生理活性物质可以提供足够

2、数量的生理活性物质;发现更多内源生理活发现更多内源生理活性物质性物质;定向改变内源生理活性物质定向改变内源生理活性物质;获得新化合物获得新化合物,扩大药物来源扩大药物来源.第2页，讲稿共172张，创作于星期日 重组重组DNA技术技术也称为分子克隆技术。也称为分子克隆技术。供体、受体、载体是其三大基本元件。供体、受体、载体是其三大基本元件。基因工程基因工程:利用重组技术，在体外通过人工利用重组技术，在体外通过人工“剪切剪切”和和“拼接拼接”等方法，对各种生物的核酸（基因）进行改造和重新组合，然等方法，对各种生物的核酸（基因）进行改造和重新组合，然后导入微生物或真核细胞内进行无性繁殖，使重组基因在

3、细胞内后导入微生物或真核细胞内进行无性繁殖，使重组基因在细胞内表达，产生出人类需要的基因产物，或者改造、创造新的生物类表达，产生出人类需要的基因产物，或者改造、创造新的生物类型。型。是指重组是指重组DNA技术的产业化设计与应用技术的产业化设计与应用.包括上游技术和下游技术两大组成部分。包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组（即重组DNA技术）技术）；下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。产物的分离纯化过程。第3页

4、，讲稿共172张，创作于星期日 从从实质上讲实质上讲，基因工程的定义强调了外源，基因工程的定义强调了外源DNA分子的新组分子的新组合被引入到一种新的寄主生物中进行繁殖。合被引入到一种新的寄主生物中进行繁殖。这种这种DNA分子的新组合是按工程学的方法进行设计和操作的，分子的新组合是按工程学的方法进行设计和操作的，这就赋予基因工程跨越天然物种屏障的能力，克服了固有的生物种间这就赋予基因工程跨越天然物种屏障的能力，克服了固有的生物种间限制，扩大和带来了定向创造生物的可能性，这是基因工程的最大特限制，扩大和带来了定向创造生物的可能性，这是基因工程的最大特点。点。基因工程要素：基因工程要素：包括外源包括

5、外源DNA，载体分子，工具酶和受体，载体分子，工具酶和受体细胞等。细胞等。第4页，讲稿共172张，创作于星期日 一个完整的、用于生产目的的基因工程技术程序包括的一个完整的、用于生产目的的基因工程技术程序包括的基本内容有：基本内容有：（1）外源目标基因的分离、克隆以及目标基因的结）外源目标基因的分离、克隆以及目标基因的结构与功能研究。此工作是整个基因工程的基础，又称为基因工程的上构与功能研究。此工作是整个基因工程的基础，又称为基因工程的上游部分；（游部分；（2）适合转移、表达载体的构建或目标基因的表达）适合转移、表达载体的构建或目标基因的表达调控结构重组；（调控结构重组；（3）外源基因的导入；（

6、）外源基因的导入；（4）外源基因在宿主基）外源基因在宿主基因组上的整合、表达及检测与转基因生物的筛选；（因组上的整合、表达及检测与转基因生物的筛选；（5）外源基因）外源基因表达产物的生理功能的核实；（表达产物的生理功能的核实；（6）转基因新品系的选育和建）转基因新品系的选育和建立，以及转基因新品系的效益分析；（立，以及转基因新品系的效益分析；（7）生态与进化安全保障）生态与进化安全保障机制的建立；（机制的建立；（8）消费安全评价。）消费安全评价。第5页，讲稿共172张，创作于星期日二二 基因工程诞生的理论依据基因工程诞生的理论依据 （1 1）DNADNA是遗传物质是遗传物质 不同基因具有相同的

7、物质基础。地球上的一切生物，它们的基不同基因具有相同的物质基础。地球上的一切生物，它们的基因都是一个具有遗传功能的特定核苷酸序列的因都是一个具有遗传功能的特定核苷酸序列的DNADNA片段。而所有生片段。而所有生物的物的DNADNA的基本结构都是一样的。因此，不同生物的基因的基本结构都是一样的。因此，不同生物的基因（DNADNA片段）片段）原原则上是可以重组互换的。则上是可以重组互换的。（2 2）DNADNA双螺旋结构双螺旋结构 19531953年年James D.WatsonJames D.Watson和和Francis H.C.CrickFrancis H.C.Crick揭示了揭示了DNAD

8、NA分子的双螺旋结构和半保留复制机制。分子的双螺旋结构和半保留复制机制。（3 3）中心法则和遗传密码）中心法则和遗传密码 遗传密码是通用的。一系列三联密码子遗传密码是通用的。一系列三联密码子（除极少数的几个以外）（除极少数的几个以外）同氨基酸同氨基酸之间的对应关系，在所有生物中都是相同的。现在，基因是之间的对应关系，在所有生物中都是相同的。现在，基因是可以人工会成的。可以人工会成的。第6页，讲稿共172张，创作于星期日（4 4）基因是可切割的）基因是可切割的 基因直线排列基因直线排列在DNA分子上。作为作为DNA分子上一个特定核苷酸序分子上一个特定核苷酸序列的基因，允许一个一个完整地被切割下来

9、。列的基因，允许一个一个完整地被切割下来。（5）基因是可以转移的）基因是可以转移的 发现有的基因可以在染色体发现有的基因可以在染色体DNA上移动，甚至可以在不同染上移动，甚至可以在不同染色体间进行跳跃，插入到靶色体间进行跳跃，插入到靶DNA分子之中。分子之中。（6）多肽与基因之间存在对应关系）多肽与基因之间存在对应关系普遍认为，一种多肽就有一种相对应的基因。因此，基因普遍认为，一种多肽就有一种相对应的基因。因此，基因的转移或重组可以根据其表达产物多肽的性质来检查。的转移或重组可以根据其表达产物多肽的性质来检查。（7）基因可以通过复制把遗传信息传递）基因可以通过复制把遗传信息传递经重组的基因一般

10、来说是能传代的，可以获得相对稳定的转基因生经重组的基因一般来说是能传代的，可以获得相对稳定的转基因生物。物。第7页，讲稿共172张，创作于星期日三三基因工程的研究内容基因工程的研究内容四 1 1、基础研究、基础研究 五五 基因工程问世以来，科技工作者始终十分重视基基因工程问世以来，科技工作者始终十分重视基础研究，包括构建一系列克隆载体和相应的表达系统，建础研究，包括构建一系列克隆载体和相应的表达系统，建立不同物种的基因组文库和立不同物种的基因组文库和cDNAcDNA文库，开发新的工具酶，探索文库，开发新的工具酶，探索新的操作方法等，各方面取得了丰硕的研究成果，使基因工程技新的操作方法等，各方面

11、取得了丰硕的研究成果，使基因工程技术不断趋向成熟。术不断趋向成熟。第8页，讲稿共172张，创作于星期日(1)(1)、基因工程克隆载体的研究、基因工程克隆载体的研究 基因工程的发展是与克隆载体构建密切相关的，由于最早构建和基因工程的发展是与克隆载体构建密切相关的，由于最早构建和发展了用于原核生物的克隆载体，所以以原核生物为对象的基因工程发展了用于原核生物的克隆载体，所以以原核生物为对象的基因工程研究首先得以迅速发展。研究首先得以迅速发展。TiTi质粒的发现以及成功地构建了质粒的发现以及成功地构建了TiTi质粒衍生的克隆载体后，质粒衍生的克隆载体后，植物基因工程研究随之就迅速发展起来。植物基因工程

12、研究随之就迅速发展起来。动物病毒克隆载体的构建成功，使动物基因工程研究也有动物病毒克隆载体的构建成功，使动物基因工程研究也有一定的进展。可以认为构建克隆载体是基因工程技术路线中的一定的进展。可以认为构建克隆载体是基因工程技术路线中的核心环节。核心环节。至今已构建了数以千计的克隆载体。但是构建新的克隆载体仍是至今已构建了数以千计的克隆载体。但是构建新的克隆载体仍是今后研究的重要内容之一。尤其是适合用于高等动植物转基因的表达今后研究的重要内容之一。尤其是适合用于高等动植物转基因的表达载体和定位整合载体还须大力发展。载体和定位整合载体还须大力发展。第9页，讲稿共172张，创作于星期日 (2)基因工程

13、受体系统的研究基因工程受体系统的研究 基因工程的受体与载体是一个系统的两个方面。前者是克隆基因工程的受体与载体是一个系统的两个方面。前者是克隆载体的宿主，是外源目的基因表达的场所。受体可以是单个细胞，载体的宿主，是外源目的基因表达的场所。受体可以是单个细胞，也可以是组织、器官、甚至是个体。用作基因工程的受体可分为也可以是组织、器官、甚至是个体。用作基因工程的受体可分为两类，即原核生物和真核生物。两类，即原核生物和真核生物。原核生物大肠杆菌原核生物大肠杆菌是早期被采用的最好受体系统，应用技术成是早期被采用的最好受体系统，应用技术成熟，几乎是现有一切克隆载体的宿主；熟，几乎是现有一切克隆载体的宿主

14、；酵母菌酵母菌是较早被用作基因工程受体的真核生物。有人把酵母是较早被用作基因工程受体的真核生物。有人把酵母菌同大肠杆菌一起看作是第一代基因工程受体系统。菌同大肠杆菌一起看作是第一代基因工程受体系统。高等植物高等植物也已用作基因工程的受体，一般用其愈伤组织、也已用作基因工程的受体，一般用其愈伤组织、细胞和原生质体，也用部分组织和器官。细胞和原生质体，也用部分组织和器官。第10页，讲稿共172张，创作于星期日 高等植物高等植物也已用作基因工程的受体，一般用其愈伤组织、也已用作基因工程的受体，一般用其愈伤组织、细胞和原生质体，也用部分组织和器官。目前用作基因工程细胞和原生质体，也用部分组织和器官。目

15、前用作基因工程受体的植物有双子叶植物拟南芥、烟草、番茄、棉花等，单受体的植物有双子叶植物拟南芥、烟草、番茄、棉花等，单子叶植物水稻、玉米、小麦等，获得了相应的转基因植物。子叶植物水稻、玉米、小麦等，获得了相应的转基因植物。动物动物鉴于体细胞再分化能力差，目前主要以生殖细胞或胚细鉴于体细胞再分化能力差，目前主要以生殖细胞或胚细胞作为基因工程受体，获得了转基因鼠、鱼、鸡等动物。胞作为基因工程受体，获得了转基因鼠、鱼、鸡等动物。第11页，讲稿共172张，创作于星期日 (3)目的基因研究目的基因研究 基因是一种有限的基因是一种有限的战略性资源。战略性资源。因此开发基因资源已成为因此开发基因资源已成为发

16、达国家之间激烈竞争的焦点之一，谁拥有基因专利多，谁就在发达国家之间激烈竞争的焦点之一，谁拥有基因专利多，谁就在基因工程领域占主导地位。基因工程领域占主导地位。基因工程就是开发人们特殊需要的基因产物，这样的基因工程就是开发人们特殊需要的基因产物，这样的基因统称为基因统称为目的基因目的基因。具有优良性状的基因理所当然是目的基。具有优良性状的基因理所当然是目的基因。而致病基因在特定情况下也具有很大的开发价值。即使那因。而致病基因在特定情况下也具有很大的开发价值。即使那些尚不清楚功能的基因，随着研究的深入，也许以后成为具有些尚不清楚功能的基因，随着研究的深入，也许以后成为具有很大开发价值的目的基因。很

17、大开发价值的目的基因。第12页，讲稿共172张，创作于星期日 获得目的基因的途径很多，获得目的基因的途径很多，主要是通过构建基因组文库或主要是通过构建基因组文库或cDNA文库，从中筛选出特殊需要的基因。文库，从中筛选出特殊需要的基因。近年来也广泛使用近年来也广泛使用PCR技术直接从某生物基因组中扩增出需技术直接从某生物基因组中扩增出需要的基因。要的基因。对于较小的目的基因也可用人工化学合成。对于较小的目的基因也可用人工化学合成。现在已获得的目的基因大致可分为三大类：现在已获得的目的基因大致可分为三大类：第一类是与医药相关的基因；第一类是与医药相关的基因；第二类是抗病、虫害和恶劣生境的基因；第二

18、类是抗病、虫害和恶劣生境的基因；第三类是编码具特殊营养价值的蛋白或多肽的基因。第三类是编码具特殊营养价值的蛋白或多肽的基因。第13页，讲稿共172张，创作于星期日 (4)(4)基因工程工具酶的研究基因工程工具酶的研究 基因工程工具酶指体外进行基因工程工具酶指体外进行DNADNA合成、切割、修饰和连接合成、切割、修饰和连接等系列过程中所需要的酶，包括等系列过程中所需要的酶，包括DNADNA聚合酶、限制性核酸内切酶、聚合酶、限制性核酸内切酶、修饰酶和连接酶等。修饰酶和连接酶等。限制性核酸内切酶用于有规律地切割限制性核酸内切酶用于有规律地切割DNADNA把提供的把提供的DNADNA原材料原材料切割成

19、具特定末端的切割成具特定末端的DNADNA片段。现已从不同生物中发现和分离出上片段。现已从不同生物中发现和分离出上千种限制性核酸内切酶，基本上可满足按不同目的切割各种千种限制性核酸内切酶，基本上可满足按不同目的切割各种DNADNA分分子的需要。子的需要。耐热性限制性核酸内切酶和长识别序列稀切酶仍是当前研究的热耐热性限制性核酸内切酶和长识别序列稀切酶仍是当前研究的热门课题。门课题。第14页，讲稿共172张，创作于星期日 DNADNA连接酶用于连接各种连接酶用于连接各种DNADNA片段，使不同基因重组。现在常片段，使不同基因重组。现在常用的用的DNADNA连接酶只有两种，即大肠杆菌连接酶只有两种，

20、即大肠杆菌DNADNA连接酶和连接酶和 T4 DNAT4 DNA连接连接酶。酶。DNADNA聚合酶用于人工合成连杆、引物等聚合酶用于人工合成连杆、引物等DNADNA小片段以及含基因小片段以及含基因的较大的的较大的DNADNA片段，还用于制备片段，还用于制备DNADNA探针。多种耐热性探针。多种耐热性DNADNA聚合聚合酶的发现，使使酶的发现，使使PCRPCR技术迅速发展给当今生命科学提供了先进技术迅速发展给当今生命科学提供了先进的研究手段。的研究手段。第15页，讲稿共172张，创作于星期日 (5)基因工程新技术研究基因工程新技术研究 围绕外源基因导人受体细胞，发展了一系列用于不同类型受围绕外源

21、基因导人受体细胞，发展了一系列用于不同类型受体细胞的体细胞的DNA转化方法和病毒转导方法，特别是近年来研制的转化方法和病毒转导方法，特别是近年来研制的基因枪和电激仪克服了某些克隆载体应用的物种局限性，提高基因枪和电激仪克服了某些克隆载体应用的物种局限性，提高了外源了外源DNA转化的效率。转化的效率。围绕基因的检测方法，在放射性同位素标记探针的基础围绕基因的检测方法，在放射性同位素标记探针的基础上，近年来又发展了非放射性标记上，近年来又发展了非放射性标记DNA探针技术和荧光探针技探针技术和荧光探针技术，如生物素标记术，如生物素标记DNA探针、探针、Dig标记标记DNA探针、荧光素标记探针、荧光素

22、标记DNA探针等。探针等。第16页，讲稿共172张，创作于星期日 PCR技术的发展提高了基因检测的灵敏度，为分离基因技术的发展提高了基因检测的灵敏度，为分离基因提供了快速简便的途径。提供了快速简便的途径。PCR技术自从技术自从1985年建立以来，发展年建立以来，发展很快，除一般采用的常规很快，除一般采用的常规PCR技术外还发展了多种特殊的技术外还发展了多种特殊的PCR技技术，如长片段术，如长片段PCR技术、反转录技术、反转录PCR技术、免疫技术、免疫PCR技术、套技术、套式引物式引物PCR技术、反向技术、反向PCR技术、标记技术、标记PCR技术、复合技术、复合PCR技技术、不对称术、不对称PC

23、R技术、定量技术、定量PCR技术、锚定技术、锚定PCR技术、重组技术、重组PCR技术、加端技术、加端PCR技术等等。技术等等。凝胶电泳技术可以在凝胶板上把不同分子大小的凝胶电泳技术可以在凝胶板上把不同分子大小的DNA分分子或子或DNA片段分开，但是只能分辨几万碱基的片段分开，但是只能分辨几万碱基的DNA分子或片段。分子或片段。脉冲电泳技术的问世，不仅能分开上百万碱基的脉冲电泳技术的问世，不仅能分开上百万碱基的DNA分子或片段，分子或片段，而且能够使完整的染色体彼此分开。而且能够使完整的染色体彼此分开。第17页，讲稿共172张，创作于星期日 2 应用研究应用研究 基因工程技术已广泛应用于医、农、

24、牧、渔等产业，甚至基因工程技术已广泛应用于医、农、牧、渔等产业，甚至与环境保护也有密切的关系。研究成果最显著的是基因工程药与环境保护也有密切的关系。研究成果最显著的是基因工程药物，转基因植物的研究也取得了喜人的成果。物，转基因植物的研究也取得了喜人的成果。第18页，讲稿共172张，创作于星期日 在农业的应用在农业的应用 应用重组应用重组DNA技术培育具有改良性状的粮食作物的工作已初技术培育具有改良性状的粮食作物的工作已初见成效。见成效。现在已经培育成功了一批分别具有抗病、抗虫和抗除草现在已经培育成功了一批分别具有抗病、抗虫和抗除草剂性状的转基因农作物。剂性状的转基因农作物。例如，应用反义例如，

25、应用反义RNA技术培育成功的具有耐贮藏的转基因技术培育成功的具有耐贮藏的转基因西红柿已开始在美国投放市场。西红柿已开始在美国投放市场。利用植物合成微生物甚至哺乳动物的一些特殊蛋白质，例如利用植物合成微生物甚至哺乳动物的一些特殊蛋白质，例如干扰素、人血清蛋白等也已有干扰素、人血清蛋白等也已有些成功的报道。些成功的报道。从理论上讲，在将来还有可能通过转基因植物生产更多的药用蛋从理论上讲，在将来还有可能通过转基因植物生产更多的药用蛋白质。我们有理由相信，重组白质。我们有理由相信，重组DNA技术在农业生产中的应用，技术在农业生产中的应用，是具有光辉的前景的。是具有光辉的前景的。第19页，讲稿共172张

26、，创作于星期日 重组重组DNADNA技术技术显著特点显著特点:可以使一个生物获得与之固有性状完可以使一个生物获得与之固有性状完全无关的新功能，从而引起生物技术学发生革命性的变革，使人全无关的新功能，从而引起生物技术学发生革命性的变革，使人们可以在大虽扩增的细胞中生产哺乳动物的蛋白质，其意义无疑们可以在大虽扩增的细胞中生产哺乳动物的蛋白质，其意义无疑是相当重大的。是相当重大的。将控制这些药物合成的目的基因克隆出来，转移到大肠杆菌将控制这些药物合成的目的基因克隆出来，转移到大肠杆菌或其或其它生物体内进行有效的表达，于是就可以方便地提取到大量的有它生物体内进行有效的表达，于是就可以方便地提取到大量的

27、有用药物。目前在这个领域中已经取得了许多成功的事例，其中最用药物。目前在这个领域中已经取得了许多成功的事例，其中最突出的要数重组胰岛素的生产。突出的要数重组胰岛素的生产。第20页，讲稿共172张，创作于星期日在医药业的应用在医药业的应用 转基因细菌生产激素类药物转基因细菌生产激素类药物 转基因细菌生产抗生素：转基因细菌生产抗生素：转基因微生物生产疫苗：转基因微生物生产疫苗：在工业原料生产上的应用在工业原料生产上的应用 转基因微生物生产高分子多聚物转基因微生物生产高分子多聚物 转基因微生物与环境净化和废料再生转基因微生物与环境净化和废料再生 第21页，讲稿共172张，创作于星期日 四四 基因工程

28、的安全性基因工程的安全性 1 基因工程的安全隐患基因工程的安全隐患 对环境的影响对环境的影响:重新组合一种在自然见尚未发现的的重新组合一种在自然见尚未发现的的 生物性生物性状有可能给现有的生态环境带来不良影响。状有可能给现有的生态环境带来不良影响。新型病毒的出现新型病毒的出现:制造带有抗生素抗性基因或有产生病毒制造带有抗生素抗性基因或有产生病毒能力的基因的新型微生物有可能在人类或其它生物体内传播。能力的基因的新型微生物有可能在人类或其它生物体内传播。癌症扩散癌症扩散:将肿瘤病毒或其它动物病毒的将肿瘤病毒或其它动物病毒的DNA引入细菌有可引入细菌有可能扩大癌症的发生范围。能扩大癌症的发生范围。人

29、造生物扩散人造生物扩散:新组成的重组新组成的重组DNA生物体的意外扩散可能生物体的意外扩散可能会出现不同程度的潜在危险。会出现不同程度的潜在危险。第22页，讲稿共172张，创作于星期日 2 2 控制措施控制措施 对转基因生物的控制措施有物理的方法和生物的方法。对转基因生物的控制措施有物理的方法和生物的方法。物理的方法物理的方法就是通过各种严格的管理措施和物理屏障尽量就是通过各种严格的管理措施和物理屏障尽量使转基因生物不能从实验室逃逸进入到自然环境里去。这种措使转基因生物不能从实验室逃逸进入到自然环境里去。这种措施只能用于控制在实验室里的转基因生物，而且用于控制转基施只能用于控制在实验室里的转基

30、因生物，而且用于控制转基因微生物和通过花粉进行扩散的植物的效力实际上是非常有限因微生物和通过花粉进行扩散的植物的效力实际上是非常有限的。的。当转基因动、植物必须用于开放的环境里生产时，物理控制的当转基因动、植物必须用于开放的环境里生产时，物理控制的方法便不再有实际的意义。方法便不再有实际的意义。第23页，讲稿共172张，创作于星期日 根本性的措施还是根本性的措施还是生物学的控制方法生物学的控制方法。即造成转基因生物与非转基因生物之间的生殖隔离。如利用三倍即造成转基因生物与非转基因生物之间的生殖隔离。如利用三倍体不育的特性，将用于生产的转基因动物或植物成为三倍体，这样，体不育的特性，将用于生产的

31、转基因动物或植物成为三倍体，这样，转基因生物在进入到自然环境里后就不可能自行繁殖，因此也就不可转基因生物在进入到自然环境里后就不可能自行繁殖，因此也就不可能对生态系统能对生态系统 造成长期的影响。造成长期的影响。也可以利用生理学原理，如激素诱导等方法使转基因生也可以利用生理学原理，如激素诱导等方法使转基因生物不育等。物不育等。第24页，讲稿共172张，创作于星期日1 什么是基因工程技术什么是基因工程技术?2 基因工程基础研究的有哪些内容基因工程基础研究的有哪些内容?第25页，讲稿共172张，创作于星期日第26页，讲稿共172张，创作于星期日PCR的反应原理PCR的类型和应用PCR示例第27页，

32、讲稿共172张，创作于星期日 多聚酶链式反应多聚酶链式反应（PCR：Polymerase Chain Reaction)Kary B.MullisKary B.Mullis PCR是由美国科学家是由美国科学家穆利斯提出的一种穆利斯提出的一种体外简化条件下模拟体外简化条件下模拟DNA体内复制的体内复制的DNADNA快速扩增的方法，此技术获得19931993年诺贝年诺贝尔化学奖。尔化学奖。第28页，讲稿共172张，创作于星期日体内体内DNADNA的复制体系的复制体系DNADNADNADNA聚合酶聚合酶（I II IIII II IIII II IIII II III）拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶

33、拓扑异构酶解旋酶类解旋酶类解旋酶类解旋酶类SSBSSBSSBSSB 引物引物引物引物dNTP MgdNTP MgdNTP MgdNTP Mg2+2+2+2+5 5 33第29页，讲稿共172张，创作于星期日Mullis的的PCR构思构思引物引物引物引物DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段第30页，讲稿共172张，创作于星期日Taq DNA聚合酶（水生栖热菌水生栖热菌(Thurmus aquaticus(Thurmus aquaticus，简称，简称Taq)Taq)酶酶酶酶活活活活性性性性(%)温度温度温度温度()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20耐热耐热

34、DNADNA聚合酶聚合酶Saiki（1988）将耐热）将耐热DNA聚合酶引入聚合酶引入PCR，使利用热变性解链，使利用热变性解链DNA模板可行。模板可行。第31页，讲稿共172张，创作于星期日PCR反应循环反应循环727294945555PCRPCR循环循环循环循环变性变性变性变性退火退火退火退火延伸延伸延伸延伸第32页，讲稿共172张，创作于星期日第33页，讲稿共172张，创作于星期日 PCRPCR的指数扩增（的指数扩增（2 2n n）引物引物引物引物延伸延伸延伸延伸延伸延伸延伸延伸5533变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火第34页，讲稿共172

35、张，创作于星期日TaqP1P1P2P2PCR反应体系dATPdTTPdGTPdCTPMg2+模板：模板：DNA引物：引物：P1 P2DNA聚合酶：聚合酶：Taq原料：原料：dNTP反应缓冲液反应缓冲液辅助因子：辅助因子：Mg2+第35页，讲稿共172张，创作于星期日1 1）PCRPCR反应成分反应成分（1 1）模板）模板）模板）模板 单、双链单、双链DNADNA均可。均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、不能混有蛋白酶、核酸酶、DNADNA聚合酶抑制剂、聚合酶抑制剂、DNADNA结合蛋结合蛋白类。白类。DNADNA模板一般模板一般100ng/100100ng/100 L L。模板浓度过高会导致反应的非

36、特异性增加。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。PCR反应条件第36页，讲稿共172张，创作于星期日（2 2）引物浓度）引物浓度）引物浓度）引物浓度 0.1-0.5 0.1-0.5 mol/Lmol/L 浓度过高易导致模板与引物错配浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。反应特异性下降。（3 3 3 3）TaqTaqTaqTaq DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 0.5-2.5 U/50 0.5-2.5 U/50 l l 酶量增加使反应特异性下降酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。酶量过少影响反应产量。第37页，讲稿共172张，创作于星期日（4 4 4 4）

37、dNTPdNTP dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度浓度取决于扩增片段的长度 四种四种dNTPdNTP浓度应相等浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反浓度过低则降低反应产量应产量 dNTPdNTP可与可与Mg2+Mg2+结合结合,使游离的使游离的Mg2+Mg2+浓度下降浓度下降,影响影响DNADNA聚聚合酶的活性。合酶的活性。第38页，讲稿共172张，创作于星期日（5 5 5 5）Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+是是DNADNA聚合酶的激活剂。适宜浓度为聚合酶的激活剂。适宜浓度为0.5-2.5mmol/L0.5-2.5mmo

38、l/L反反应体系。应体系。Mg2+Mg2+浓度过低会使浓度过低会使TaqTaq酶活性丧失、酶活性丧失、PCRPCR产量下降；产量下降；Mg2+Mg2+过高影响反应特异性。过高影响反应特异性。Mg2+Mg2+可与负离子结合可与负离子结合,所以反应体系中所以反应体系中dNTPdNTP、EDTAEDTA等的浓等的浓度影响反应中游离的度影响反应中游离的Mg2+Mg2+浓度。浓度。第39页，讲稿共172张，创作于星期日2 2 2 2）循环参数）循环参数）循环参数）循环参数(1)(1)变性变性 (2)(2)使双链使双链DNADNA解链为单链解链为单链 9494，20-30 20-30秒秒(2)(2)(2)

39、(2)退火退火退火退火 温度由引物长度和温度由引物长度和GCGC含量决定。含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可降低温度可增加反应的灵敏性。增加反应的灵敏性。第40页，讲稿共172张，创作于星期日（3 3 3 3）延伸）延伸 70-75,70-75,一般为一般为7272 延伸时间由扩增片段长度决定延伸时间由扩增片段长度决定（4 4 4 4）循环次数）循环次数）循环次数）循环次数 主要取决于模版主要取决于模版DNADNA的浓度的浓度 一般为一般为25-3525-35次次 次数过多：扩增效率降低次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加错误掺

40、入率增加第41页，讲稿共172张，创作于星期日PCR技术的特点1 1 1 1）高度的灵敏性）高度的灵敏性）高度的灵敏性）高度的灵敏性30303030轮循环轮循环扩增量达扩增量达230230个拷贝（个拷贝（109109拷贝）拷贝）PCRPCR产物每轮循环增加一倍产物每轮循环增加一倍第42页，讲稿共172张，创作于星期日2 2）特异性）特异性引物引物引物引物引物引物 引物的序列及其与模板结合的特异性是决定引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCRPCR反反 应结果的关键。应结果的关键。引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和 特异性；同时尽可能减少

41、非特异性扩增。特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。第43页，讲稿共172张，创作于星期日引物设计：引物设计：（1)序列应位于高度保守区序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源 序列。序列。（2）引物长度以15-40 bp15-40 bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布碱基尽可能随机分布,G+C,G+C占占40-60%40-60%。（4）引物内部避免形成二级结构。（5 5）两引物间避免有互补序列。）两引物间避免有互补序列。（6 6）引物）引物33端为关键碱基；5端无严格限制。端无严格限制。第44页，讲稿共172张，创作于星期日3 3 3 3）操作简便易行）操作简便易行）操作简便易行）操作简便易行 利

42、用利用PCRPCR扩增扩增,只需要数小时只需要数小时,就可以扩增出就可以扩增出 可用电可用电泳法检出的泳法检出的DNADNA，可用于检测基因组中仅含数个拷贝的模，可用于检测基因组中仅含数个拷贝的模板序列。板序列。第45页，讲稿共172张，创作于星期日1 1 1 1）不对称）不对称）不对称）不对称PCRPCRPCRPCR 目的：扩增产生特异长度的单链目的：扩增产生特异长度的单链DNADNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物非限制性引物,其最佳比例一般是其最佳比例一般是0.010.5M,0.010.5M,关键是限制关键

43、是限制性引物的绝对量。性引物的绝对量。用途：制备核酸序列测定的模板；制备杂交探针；用途：制备核酸序列测定的模板；制备杂交探针；基因组基因组DNADNA结构功能的研究结构功能的研究 PCRPCR的类型第46页，讲稿共172张，创作于星期日 高浓度引物高浓度引物低浓度引物低浓度引物第47页，讲稿共172张，创作于星期日2)2)2)2)反向反向反向反向PCR(reverse PCR)PCR(reverse PCR)用反向的互补引物来扩增两引物以外的用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNADNA片段，对某个片段，对某个已知已知DNADNA片段两侧的未知序列进行扩增。片段两侧的未知序列进行扩增。未知序列

44、未知序列未知序列未知序列已知序列已知序列第48页，讲稿共172张，创作于星期日已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶连接酶连接酶第49页，讲稿共172张，创作于星期日3 3 3 3）多重）多重）多重）多重PCRPCRPCRPCR（复合（复合（复合（复合PCRPCRPCRPCR）用于检测特定基因序列的存在或缺失。用于检测特定基因序列的存在或缺失。第50页，讲稿共172张，创作于星期日电电电电泳泳泳泳引物引物12341234第51页，讲稿共172张，创作于星期日4 4 4 4）LP-PCRLP-PCRLP-PCRLP-PCR（Labelle

45、d primers)Labelled primers)Labelled primers)Labelled primers)利用同位素、荧光素等对引物进行标记利用同位素、荧光素等对引物进行标记,用用以直观地检测目的基因。以直观地检测目的基因。特别适合大量临床标本的基因诊断特别适合大量临床标本的基因诊断 可同时检测多种基因成分可同时检测多种基因成分第52页，讲稿共172张，创作于星期日标记引物标记引物标记引物标记引物观察观察PCR产物第53页，讲稿共172张，创作于星期日5 5 5 5）锚定）锚定）锚定）锚定PCRPCRPCRPCR（anchored PCR,A-PCRanchored PCR,A

46、-PCRanchored PCR,A-PCRanchored PCR,A-PCR）锚定锚定PCRPCR首先合成第一链首先合成第一链cDNA,cDNA,然后再添加一同聚物然后再添加一同聚物尾（尾（polydG),polydG),与同聚物尾配对的与同聚物尾配对的33锚定引物（带有限制性锚定引物（带有限制性内切位点内切位点polydC)polydC)一起作一起作PCRPCR扩增扩增第54页，讲稿共172张，创作于星期日cDNAcDNA末端核酸转移酶末端核酸转移酶3GGGG3GGGG55CCCC CCCC 锚定引物锚定引物锚定引物锚定引物3GGGG3GGGG5CCCCCCCC3GGGG3GGGGCCC

47、CCCCC第55页，讲稿共172张，创作于星期日6 6 6 6）PCRPCR固相分析法固相分析法固相分析法固相分析法模板生物素生物素化引物化引物PCRPCR扩增扩增探针亲和固相介质检测探检测探针信号针信号可用于基因芯片的制作可用于基因芯片的制作第56页，讲稿共172张，创作于星期日第57页，讲稿共172张，创作于星期日7 7 7 7）原位）原位）原位）原位 原位聚合酶链式反应（原位聚合酶链式反应（In Still PCR,IsIn Still PCR,IsPCRPCR）是由）是由HaaseHaase等于等于19901990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微年首创。它是利用完整的细胞作为一个微

48、小的反应体系来扩增细胞内的目的片段小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的在不破坏细胞的前提下前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行扩增。可进行细胞内定位和检测病理切片中含行扩增。可进行细胞内定位和检测病理切片中含量较少的靶序列。量较少的靶序列。第58页，讲稿共172张，创作于星期日操作步骤操作步骤1.1.细细胞胞或或组组织织固固定定：细细胞胞经经固固定定和和乙乙醇醇通通透透化化处处理理后后便便适适于一般于一般PCRPCR试剂（包

49、括引物和试剂（包括引物和TaqTaq酶）进入酶）进入2.PCR2.PCR扩增细胞内目的片段扩增细胞内目的片段3.3.原位杂交检测扩增产物原位杂交检测扩增产物A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达第59页，讲稿共172张，创作于星期日8 8 8 8）逆转录酶逆转录酶聚合酶聚合酶mRNAcDNA杂化双链杂化双链PCRPCR扩增扩增第60页，讲稿共172张，创作于星期日9)9)9)9)荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量 PCRPCRPCRPCR（real-time PCR)real-time PCR)real-time PCR)real-time PCR)通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针

50、通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对对PCRPCR产产物进行标物进行标 记跟踪记跟踪,实时在线监控反应过程实时在线监控反应过程,结合相应的软结合相应的软件可以对结果进行分析件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。计算待测样品的初始模板量。内掺式染料内掺式染料SYBR GreenSYBR Green I序列特异性探针序列特异性探针Taqman Taqman Molecular BeaconsMolecular Beacons Dual Probes(FRET)Dual Probes(FRET)引物特异性探针引物特异性探针 Amplifluor(Intergen)Amplifluor(