基因的定位克隆精选PPT.ppt
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1、关于基因的定位克隆第1页,讲稿共44张,创作于星期日千奇百怪的突变体这些突变体是怎么产生的呢?突变体突变体:是某个性状发生可遗传变异的材料,或某个基因发生突变的材料。水水稻稻第2页,讲稿共44张,创作于星期日 基因定位基因定位(mapping):是用一定的方法将基是用一定的方法将基因确定到染色体上的实际位置。因确定到染色体上的实际位置。第3页,讲稿共44张,创作于星期日一、连锁分析(一、连锁分析(Linkage analysisLinkage analysis)1 1)概念:)概念:基因定位的连锁分析是根据基因在染色体上呈直基因定位的连锁分析是根据基因在染色体上呈直线排列,不同基因相互连锁成连
2、锁群的原理,即应用线排列,不同基因相互连锁成连锁群的原理,即应用被定位的基因与同一染色体上另一基因或遗传标记相被定位的基因与同一染色体上另一基因或遗传标记相连锁的特点进行定位。连锁的特点进行定位。第4页,讲稿共44张,创作于星期日2 2)重组值()重组值(recombination fractionrecombination fraction)是基因定位时两个基因间遗传图距的量度,即基因间的遗传距离。如果两个基因间有1%的重组值,其遗传图的距离为1厘摩。(centimorgancentimorgan,cMcM)交换值交换值(RF)(%)=重组型的配子数重组型的配子数/总配总配子数子数100%重
3、组值越大,说明两基因间的距离越远,基因间的连锁强度越重组值越大,说明两基因间的距离越远,基因间的连锁强度越小;重组值越小,说明基因间的距离越近,基因间的连锁强度越小;重组值越小,说明基因间的距离越近,基因间的连锁强度越大。大。第5页,讲稿共44张,创作于星期日 3)遗传标记()遗传标记(genetic marker)用连锁分析发法进行基因定位需要已知的用连锁分析发法进行基因定位需要已知的DNA序列作为遗传标记,序列作为遗传标记,这些标记按孟德尔方式遗传,标记位点应是多态的。这些标记按孟德尔方式遗传,标记位点应是多态的。4)遗传多态性:)遗传多态性:是指在一个遗传座位上具有一个以上的等位基因,是
4、指在一个遗传座位上具有一个以上的等位基因,且各个等位基因在群体中出现的频率皆高于且各个等位基因在群体中出现的频率皆高于1%。第6页,讲稿共44张,创作于星期日二、三点测交(three-point testcross)与染色体作图 为了进行基因定位,摩尔根和他的学生Sturtevant创造了三点测交方法,即将3个基因包括在同一次交配中。进行这种测交,一次实验就等于3次两点试验。已知在果蝇中棘眼(ec)、截翅(ct)和横脉缺失(cv)这3个隐性突变基因都是X连锁的。把棘眼、截翅个体与横脉缺失个体交配,得到3个基因的杂合体ec ct+/+cv(ec、ct、cv的排列不代表它们在X染色体的真实顺序),
5、取其中3杂合体雌蝇再与3隐性体ec ct cv/Y雄蝇测交,测交后代如下表。第7页,讲稿共44张,创作于星期日ec ct+/+cv ec ct cv/Y测交后代数据第8页,讲稿共44张,创作于星期日结果分析1、归类2、确定正确的基因顺序 用双交换型与亲本类型相比较,发现改变了位置的那个基因一定是处于中央的位置,因为双交换的特点是旁侧基因的相对位置不变,仅中间的基因发生变动。于是可以断定这3 个基因正确排列顺序是ec cv ct。亲本型ec ct +cv双交换型+ec ct cv第9页,讲稿共44张,创作于星期日ec ct +cvec +ct+cv +ct ec +cvec +ct cvec c
6、v ct+ct +ec cv第10页,讲稿共44张,创作于星期日3、计算重组值,确定图距(1)、计算ctcv的重组值 忽视表中第一列(ec/+)的存在,将它们放在括弧中,比较第二、三列:ctcv间重组率=(217+223+5+3)/5318=0.084=8.4%=8.4cM第11页,讲稿共44张,创作于星期日(3)、计算ecct的重组值 忽视表中第三列(+/cv)的存在,将它们放在括弧中,比较第一、二列:ecct间重组率=(273+265+217+223)/5318=18.4%=18.4cM第12页,讲稿共44张,创作于星期日(2)、计算eccv的重组值 忽视表中第二列(ct/+)的存在,将它
7、们放在括弧中,比较第一、三列:eccv间重组率=(273+265+5+3)/5318=10.2%=10.2cM第13页,讲稿共44张,创作于星期日4、绘染色体图eccvct10.28.418.418.6在计算eccv和cvct的重组值时都利用了双交换值,可是计算ecct时没把它计在内,因为它们间双交换的结果并不出现重组。所以ecct之间的实际双交换值应当是重组值加2倍双交换值。即18.4%+20.1%=18.6%。当三点测交后代出现8种表型时,表明有双交换发生,此时需用2倍双交换值来作校正。若3个基因相距较近,往往不出现双交换类型,后代只有6种表型,无需校正。标记1标记2目标基因第14页,讲稿
8、共44张,创作于星期日 三、图位克隆 图位克隆(map-based cloning)又称定位克隆,该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行基因克隆的一种方法,其原理是根据功能基因在基因组中都有相对稳定的基因座,在利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上,使用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA文库,从而构建的基因区域的物理图谱,再利用此物理图谱通过染色体步行(chromosome walking)逼近目的基因或通过染色体登陆(chromosome landing)(Tanksley et al.,1995)的方法最终找到包含目的基因的克隆,最后通过遗传转化和功能互补验证最终确定
9、目的基因的碱基序列。第15页,讲稿共44张,创作于星期日 图位克隆的特点是无需预先知道基因的DNA顺序,也无需预先知道其表达产物的有关信息,但应有以下两方面两方面的基本情况。一是一是有一个根据目的基因的有无建立起来的遗传分离群体,即定位群体,如:F2、DH、BC、RI等。第16页,讲稿共44张,创作于星期日 二是二是开展以下几项工作:(1)首先找到与目的基因紧密连锁的分子标记;(2)用遗传作图和物理作图将目标基因定位在染色体上的特定位置;(3)构建含有大插入片段的基因组文库;(BAC或YAC);(4)以与目的基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库;(5)用获得阳性克隆构建目的基因区域的重叠群;
10、(6)通过染色体步行、登陆或跳跃获得带有目的基因的大片段克隆;(7)通过亚克隆获得带有目的基因的小片段克隆;(8)通过遗传转化和功能互补验证最终确定目标基因的碱基序列第17页,讲稿共44张,创作于星期日M1M2构建遗传图谱构建物理图谱染色体步移:Chromosome Walking 筛选基因组文库序列分析与功能鉴定对于基因组还未测序的物种可通过染色体步移的方法进行定位,但是比较费时费力,而对于水稻、拟南芥等基因组测序工作已经完成的物种,则不在利用染色体步移的方法进行定位,直接从构建遗传图谱到构建物理图谱,最后确定目标基因的候选基因,再通过互补实验进行验证。第18页,讲稿共44张,创作于星期日四
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