蛋白质的分离和纯化讲稿.ppt
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1、关于蛋白质的分离和纯化第一页,讲稿共四十三页哦一、蛋白质的分离一、蛋白质的分离 2.2.2.2.根据蛋白质根据蛋白质各种特性各种特性的差异,如的差异,如分子的形状和大小、分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力的亲和力等等,可以用来分离等等,可以用来分离不同种类不同种类的蛋白质。的蛋白质。Q:Q:下列蛋白质如何提取?下列蛋白质如何提取?酸性蛋白质;酸性蛋白质;水溶性蛋白质;水溶性蛋白质;脂溶性蛋白质;脂溶性蛋白质;偏偏碱性溶液碱性溶液 透析液(中性缓冲液)透析液(中性缓冲液)有机溶剂有机溶剂原理原理 1.1.
2、根据细胞的结构特点,选择不同的破碎细胞的根据细胞的结构特点,选择不同的破碎细胞的方法(方法(如研磨法、超声波法、酶解法等如研磨法、超声波法、酶解法等),使各种蛋白),使各种蛋白质释放出来。质释放出来。第二页,讲稿共四十三页哦一、蛋白质的分离一、蛋白质的分离1.1.抽提方法:抽提方法:(1 1)酸性蛋白质)酸性蛋白质:(2 2)水溶性蛋白质)水溶性蛋白质:(3 3)脂溶性蛋白质)脂溶性蛋白质:偏偏碱性溶液碱性溶液 透析液(中性缓冲液)透析液(中性缓冲液)有机溶剂有机溶剂第三页,讲稿共四十三页哦二、常用的分离方法二、常用的分离方法1.离心沉离心沉降降法法2.薄膜薄膜透析法透析法3.凝胶色谱法凝胶色
3、谱法4.电泳法电泳法第四页,讲稿共四十三页哦 1 1.离心沉降法离心沉降法 原理:通过控制原理:通过控制离心速离心速率率,使得,使得分子大小、密分子大小、密度不同度不同的的物质物质发生分层发生分层沉降,从而沉降,从而分离出不同分离出不同种类蛋白质种类蛋白质。离心时相对分子质量离心时相对分子质量大大的物的物质先沉淀。质先沉淀。第五页,讲稿共四十三页哦2 2.薄膜薄膜透析法透析法 (1 1)原理:)原理:利用利用蛋白质分子不能透过半透蛋白质分子不能透过半透膜的特性,膜的特性,可可将蛋白质与其他小分子化合物将蛋白质与其他小分子化合物分离开。分离开。(2 2)方法:)方法:将待分离的蛋白质溶液装入用将
4、待分离的蛋白质溶液装入用半透膜半透膜制成的透析袋内,再将透析袋放入透制成的透析袋内,再将透析袋放入透析液中便可进行透析。析液中便可进行透析。半透膜半透膜能使小分子自由进出,而大分子保能使小分子自由进出,而大分子保留在袋内。留在袋内。第六页,讲稿共四十三页哦 小分子杂质(无机盐、单糖、二糖及氨小分子杂质(无机盐、单糖、二糖及氨基酸等)从透析袋中出来,而蛋白质留在基酸等)从透析袋中出来,而蛋白质留在袋内。袋内。第七页,讲稿共四十三页哦3.3.蛋白质分离的方法:蛋白质分离的方法:(1 1)透析法)透析法第八页,讲稿共四十三页哦3.3.凝胶色谱法凝胶色谱法(1)(1)凝胶:凝胶:由多糖类由多糖类化合物
5、(如葡聚糖、琼脂糖)化合物(如葡聚糖、琼脂糖)构成构成的的多孔多孔球体球体,内含许多贯穿的通道内含许多贯穿的通道(2)原理:原理:大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙,大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙,路程短,流动快;小分子穿过多孔凝胶颗路程短,流动快;小分子穿过多孔凝胶颗粒内部,路程长,流动慢。粒内部,路程长,流动慢。(3 3)作用作用:使样品中使样品中分子大小不同分子大小不同的蛋白质的蛋白质按顺序分离出来按顺序分离出来第九页,讲稿共四十三页哦下图中最早洗脱下来的是什么?为什么?下图中最早洗脱下来的是什么?为什么?第十页,讲稿共四十三页哦第十一页,讲稿共四十三页哦第十二页,讲稿共四十三页哦用凝胶色谱法分
6、离蛋白质时,分子量大的用凝胶色谱法分离蛋白质时,分子量大的蛋白质蛋白质A A路程较长,移动速度较慢路程较长,移动速度较慢 B B路路程较长,移动速度较快程较长,移动速度较快C C路程较短,移动速度较慢路程较短,移动速度较慢 D D路程较短,移动速度较快路程较短,移动速度较快D第十三页,讲稿共四十三页哦相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个行过程可表示为图中哪一个B第十四页,讲稿共四十三页哦 4.4.电泳电泳(1)(1)概念:概念:带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。方向:向着与其所带电荷相反的电极移动
7、。方向:向着与其所带电荷相反的电极移动。(2)(2)泳动速度和方向:泳动速度和方向:速度:速度:带电分子的迁移速度跟各种带电分子的迁移速度跟各种分子带电性质分子带电性质的差的差异以及分子本身的异以及分子本身的大小大小,形状形状有关。有关。一般来说,一般来说,带电颗粒带电颗粒所带净电荷越多所带净电荷越多,直径越直径越小,越接近于球形,则在电场中的泳动速度越快;小,越接近于球形,则在电场中的泳动速度越快;反之,则越慢。反之,则越慢。电泳分离时,电荷量相差越大的物质相距越远。电泳分离时,电荷量相差越大的物质相距越远。第十五页,讲稿共四十三页哦醋酸纤维醋酸纤维薄膜电泳薄膜电泳琼脂糖琼脂糖凝胶电泳凝胶电
8、泳SDSSDS聚丙稀酰胺聚丙稀酰胺凝胶电泳:测定蛋白质相对分子质量。凝胶电泳:测定蛋白质相对分子质量。SDSSDS能使蛋白质完全变性,能使蛋白质完全变性,SDSSDS所带电荷大大超过了蛋白质所带电荷大大超过了蛋白质原有电荷。原有电荷。迁移率取决于分子大小迁移率取决于分子大小。(3)(3)类型(载体)类型(载体):第十六页,讲稿共四十三页哦使用使用SDS-SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中,不同蛋聚丙烯酰胺电泳过程中,不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于白质的电泳迁移率完全取决于A A 电荷的多少电荷的多少 B B 分子的大小分子的大小C C 肽链的多少肽链的多少 D D 分子形状的差异分子形状的差异第十
9、七页,讲稿共四十三页哦下列有关蛋白质提取和分离的说法,错误的下列有关蛋白质提取和分离的说法,错误的是是 ()A.透析法分离蛋白质的原理是利用蛋白质不透析法分离蛋白质的原理是利用蛋白质不能通过半透膜的特性能通过半透膜的特性B.采用透析法使蛋白质与其他小分子化合物采用透析法使蛋白质与其他小分子化合物分离开来分离开来C.离心沉降法通过控制离心速率使分子大小、离心沉降法通过控制离心速率使分子大小、密度不同的蛋白质分离密度不同的蛋白质分离D.蛋白质在电场中可以向与其自身所带电荷蛋白质在电场中可以向与其自身所带电荷相同的电极方向移动相同的电极方向移动D第十八页,讲稿共四十三页哦三、三、血红蛋白的提取和分离
10、血红蛋白的提取和分离 1.1.样品处理样品处理 2.2.粗分离粗分离 3.3.纯化纯化 4.4.纯度鉴定纯度鉴定第十九页,讲稿共四十三页哦1.1.样品处理样品处理(1 1)洗涤洗涤红细胞红细胞(低速短时离心,生理盐水)(低速短时离心,生理盐水)目的:去除杂蛋白目的:去除杂蛋白。血样先血样先低速短时离心低速短时离心分离红细胞,然后吸出上层透分离红细胞,然后吸出上层透明的黄色血浆,将下层暗红色的红细胞液体倒入明的黄色血浆,将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯,再加入烧杯,再加入五倍体积的生理盐水五倍体积的生理盐水,缓慢搅拌缓慢搅拌10min10min,低速短时间离心,如此重复洗涤三次,直至上清液,低速
11、短时间离心,如此重复洗涤三次,直至上清液中没有黄色,表明红细胞已洗涤干净。中没有黄色,表明红细胞已洗涤干净。低速离心:防止白细胞沉淀。低速离心:防止白细胞沉淀。缓慢搅拌:防止红细胞破裂释放出血红蛋白。缓慢搅拌:防止红细胞破裂释放出血红蛋白。柠檬酸钠柠檬酸钠:防止血液凝固。:防止血液凝固。第二十页,讲稿共四十三页哦(2)血红蛋白的释放)血红蛋白的释放 在在蒸馏水和甲苯蒸馏水和甲苯作用下,红细胞破裂释放作用下,红细胞破裂释放出血红蛋白。出血红蛋白。注:加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液注:加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。体积要相同。甲苯甲苯:溶解细胞膜,有利于血红蛋白的释放溶解细胞膜,有
12、利于血红蛋白的释放和分离和分离。蒸馏水作用:使红细胞吸水胀破蒸馏水作用:使红细胞吸水胀破第二十一页,讲稿共四十三页哦1、洗涤红细胞的目的是洗涤红细胞的目的是 A.去除血清去除血清 B.去除杂蛋白去除杂蛋白 C.除去血小板除去血小板 D.除去水除去水B第二十二页,讲稿共四十三页哦2、选用红细胞作为分离蛋白质的实验材料,选用红细胞作为分离蛋白质的实验材料,有何好处有何好处 ()A.血红蛋白是有色蛋白血红蛋白是有色蛋白 B.红细胞无细胞核红细胞无细胞核C.红细胞蛋白质含量高红细胞蛋白质含量高 D.红细胞红细胞DNA含量含量高高A第二十三页,讲稿共四十三页哦3、为了提取血红蛋白,从学校附近的屠宰场为了
13、提取血红蛋白,从学校附近的屠宰场取新鲜的猪血,对猪血处理的正确操作是取新鲜的猪血,对猪血处理的正确操作是 ()A.要在采血容器中预先加入抗凝血剂柠檬酸要在采血容器中预先加入抗凝血剂柠檬酸钠钠 B.重复洗涤直到上清液呈红色为止重复洗涤直到上清液呈红色为止C.将离心后的血细胞加入清水缓慢搅拌将离心后的血细胞加入清水缓慢搅拌 D.取血回来后,马上进行高速长时间离心取血回来后,马上进行高速长时间离心A第二十四页,讲稿共四十三页哦 (3)分离血红蛋白溶液)分离血红蛋白溶液 将搅拌好的混合溶液将搅拌好的混合溶液中速长时中速长时离心离心后,试管中的溶液分为后,试管中的溶液分为4层。层。第一层为无色透明的第一
14、层为无色透明的甲苯层甲苯层,第二层为第二层为脂溶性物质的沉淀层脂溶性物质的沉淀层,第三层是第三层是血红蛋白的水溶液血红蛋白的水溶液,第四层是其他杂质的暗红色沉淀物。第四层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤,除去之溶性沉淀层,将试管中的液体用滤纸过滤,除去之溶性沉淀层,于于分液漏斗分液漏斗中静置片刻后,分出下层的红色中静置片刻后,分出下层的红色透明液体。透明液体。第二十五页,讲稿共四十三页哦 取取1mL1mL的血红蛋白溶液装入的血红蛋白溶液装入透析袋透析袋中,将透析袋放中,将透析袋放入盛有入盛有300mL300mL的物的物质的量的浓度为质的量的浓度为20mmol/L20mmol/
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