转基因动物制备的方法的.ppt

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1、转基因动物制备的方法的现在学习的是第1页，共42页现在学习的是第2页，共42页现在学习的是第3页，共42页现在学习的是第4页，共42页现在学习的是第5页，共42页现在学习的是第6页，共42页 1 转基因动物的概念 转基因动物就是指用试验的方法将人们所需要的外源基因导入到动物体内,使这种外源基因与动物本身的染色体整合在一起,这样外源基因就能随着细胞的分裂而增殖,在动物体内得到表达,并且能够稳定遗传给后代的动物。现在学习的是第7页，共42页 转基因动物自产生以来,随着研究的不断深入,近些年来得到了迅速的发展。由于它打破了自然繁殖中的种间隔离,使基因能在种系关系很远的机体间流动,实现了动物种间遗传物

2、质的交换与重组,这不仅为遗传物质的研究提供了新的手段,丰富了物种的基因库,而且扩大了生命科学的视野。现在学习的是第8页，共42页 转基因动物是动物基因工程在医学生物学研究中的突出成果。近十年来，为分子遗传学、发育生物学、医学遗传学、肿瘤研究及优良经济动物的开发研究等多方面做出了很大的贡献。现在学习的是第9页，共42页 Gordon 等人首次成功地将含有HSV 和SV40DNA 片段的重组质粒DNA 以显微注射法导入小鼠受精卵的雄原核内，得到了带有这种外源DNA 顺序的TGM。1982 年Palmiter 等运用此法得到的所谓“超级巨鼠”,曾引起整个生物学界的轰动。现在学习的是第10页，共42页

3、 到目前为止，人类已获得转基因鱼、鼠、羊、猪、兔、牛等大小动物。从转基因动物所获得的资料几乎涉及医学遗传学、肿瘤学、免疫学等的基因研 究，还涉及生物药物的研究，基因治疗的开发研究等。现在学习的是第11页，共42页2 转基因动物的制备方法现在学习的是第12页，共42页2.1 显微注射法也称原核显微注射法，是发展最早、使用最为广泛的转基因方法之一。利用显微操作技术将外源基因直接注射到试验动 物的受精卵中，注射的外源基因与胚胎基因组融合，再通过胚胎移植技术将整合有外源基因的受精卵移植到受体子宫内发育，这样分娩的动物体内的每一个细胞都含有外源 DNA 片段。现在学习的是第13页，共42页现在学习的是第

4、14页，共42页现在学习的是第15页，共42页 以使用较多的小鼠为例，这一方法的实验程以使用较多的小鼠为例，这一方法的实验程序如下：序如下：准备假孕母鼠（养母）准备假孕母鼠（养母）受精卵的准备受精卵的准备 基因导入基因导入 胚胎移植胚胎移植 对幼鼠的鉴定对幼鼠的鉴定现在学习的是第16页，共42页现在学习的是第17页，共42页优点：优点：外源外源DNA大小基本不受限制大小基本不受限制(1-50kb)导入过程直观导入过程直观 整合率高整合率高现在学习的是第18页，共42页 缺点：缺点：设备昂贵、环节较多设备昂贵、环节较多 对操作人员有较高的技术要求对操作人员有较高的技术要求 低效率（尤其是大家畜）

5、低效率（尤其是大家畜）对卵子伤害大，胚胎存活率低对卵子伤害大，胚胎存活率低 基因整合随机性基因整合随机性 转基因沉默转基因沉默现在学习的是第19页，共42页2.2 精子载体介导法 将精子反复冷冻或经过化学物质处理后与外源 DNA 共同孵育,从而使外源DNA 与精子结合,然后通过人工授精得到转基因个体 目前国际上极少成功模型，国内也很少目前国际上极少成功模型，国内也很少有相关报道，精子载体法很少被应用。有相关报道，精子载体法很少被应用。现在学习的是第20页，共42页体外受精法&胞质内显微注射法 体外受精法是一种直接用精子作为外源 DNA 载体的转基因方法,其过程是将成熟的精子与外源 DNA 进行

6、预培养,因为在一定条件下,精子核后帽区有自发结合 DNA 的能力,因此,精子能够携带外源 DNA进入受精卵,并使之受精,从而使外源 DNA 整合到受体染色体中而得到转基因动物。现在学习的是第21页，共42页2.3 胚胎干细胞介导法 干细胞（干细胞（stem cells）：是细胞谱系分化中最原）：是细胞谱系分化中最原始的细胞，能终身自我更新，并具有多分化潜能，能始的细胞，能终身自我更新，并具有多分化潜能，能增殖分化为特定的组织细胞。增殖分化为特定的组织细胞。胚胎干细胞（胚胎干细胞（embryonic stem cells,ES）：从）：从着床前的哺乳类胚胎中分离的多能干细胞，具有在体着床前的哺乳

7、类胚胎中分离的多能干细胞，具有在体外不分化的增殖能力，经体外长期培养后仍具有分化外不分化的增殖能力，经体外长期培养后仍具有分化成成3种胚层的发育潜能。种胚层的发育潜能。现在学习的是第22页，共42页 通过一定的方法将外源基因导入到 ES,外源基因通过随机插入或者同源重组的方式整合到 ES 基因组中,再以显微注射法把这种转基因胚胎干细胞植入正常发育的囊胚中,然后将囊胚移植到受体动物的子宫内,由于胚胎干细胞参与了胚胎生殖系的发育,所以所产生的嵌合体其生殖细胞中一部分细胞含有目的基因,将嵌合体连续与正常动物进行交配,就会得到转基因动物。现在学习的是第23页，共42页现在学习的是第24页，共42页现在

8、学习的是第25页，共42页ES细胞技术发展历史细胞技术发展历史1956年，年，Whitten培养成功小鼠的受精卵，在体外发育成囊胚；培养成功小鼠的受精卵，在体外发育成囊胚；1958年，年，McLaren经胚胎移植，体外培养的胚胎产生小鼠个体；经胚胎移植，体外培养的胚胎产生小鼠个体；1965年，年，Brinster建立了胚胎的微滴培养技术；建立了胚胎的微滴培养技术；1968年，年，Gardner将分离的细胞注入囊胚，获得嵌合鼠将分离的细胞注入囊胚，获得嵌合鼠;1970年，年，Steven分离成功小鼠的胚胎瘤细胞；分离成功小鼠的胚胎瘤细胞；1981年，年，Martin Evans 从正常的小鼠囊胚

9、中分离成功从正常的小鼠囊胚中分离成功ES细胞；细胞；现在学习的是第26页，共42页1984年年，Bradley证证实实注注射射入入囊囊胚胚的的小小鼠鼠ES细细胞胞可可分分化化为为成成体体的的各种组织，并整合入生殖系。各种组织，并整合入生殖系。意意义义：里里程程碑碑，与与同同源源重重组组技技术术的的结结合合使使得得在在整整体体水水平平定定向向改改变变和修饰哺乳动物的遗传特性成为可能。和修饰哺乳动物的遗传特性成为可能。1995年，年，Thomson从恒河猴中分离了猴的从恒河猴中分离了猴的ES细胞；细胞；1998年，年，Thomson从人的囊胚中分离成功人的从人的囊胚中分离成功人的ES细胞；细胞；2

10、000年，年，Bongso等建立了人的等建立了人的ES细胞株细胞株 现在学习的是第27页，共42页 优点：优点：外源基因整合情况的可控性高。外源基因整合情况的可控性高。可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表达的水平及插入的稳定性。定位、表达的水平及插入的稳定性。外源基因导入外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴细胞的方法多样，细胞鉴定及筛选方便定及筛选方便。现在学习的是第28页，共42页 缺点：缺点：ES细胞系建立及培养困难细胞系建立及培养困难 维持维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易细胞的未分化及多向分化潜能不易 所得个体为嵌合体所得个体为嵌合

11、体现在学习的是第29页，共42页2.4 逆转录病毒感染法 逆转录病毒是第一个用于基因转移的病毒载体。将目的基因整合到逆转录病毒的 RNA 载体上,制成高滴度的病毒颗粒,人为感染着床前或着床后的胚胎,RNA 病毒感染宿主细胞后反转录成相应的DNA,并在整合酶和其末端特殊核酸序列的作用下整合到宿主细胞的基因组中进行表达和遗传得到转基因动物。现在学习的是第30页，共42页 与显微注射法的比较与显微注射法的比较方式方式显微注射法显微注射法逆转录病毒法逆转录病毒法DNA长长度度50kb,10-15kb,与时相与时相单细胞卵4-6细胞卵移卵部位移卵部位输卵管子宫整合方式整合方式随机，多拷贝随机，单拷贝表达

12、表达受宿主旁侧的DNA影响受LTR影响易缺失传代传代可以有时不可以子代嵌合体机率高现在学习的是第31页，共42页 优点：优点：受精卵携带外源基因的阳性率高受精卵携带外源基因的阳性率高 外源基因多单拷贝整合外源基因多单拷贝整合 操作简单，避免注射法对卵子的损害操作简单，避免注射法对卵子的损害 宿主范围广宿主范围广 可同时感染大量胚胎，感染率及胚胎存活可同时感染大量胚胎，感染率及胚胎存活率高。率高。现在学习的是第32页，共42页 缺点：缺点：容纳大小有限；容纳大小有限；重组逆转录病毒的长末端容易甲基化，影响重组逆转录病毒的长末端容易甲基化，影响 外源基因的表达。外源基因的表达。现在学习的是第33页

13、，共42页2.5 体细胞核移植转基因法近年来新出现的一种转基因技术。克隆绵羊“多莉(Dolly)”的诞生是转基因动物史上的一个里程碑。先把外源基因与供体细胞在培养基中培养,使外源基因整合到供体细胞上,然后将供体细胞的细胞核转移到去核的卵母细胞组成重构胚胎,再把其移植到假孕母体,待其妊娠、分娩后便可得到转基因的克隆动物。现在学习的是第34页，共42页核移植技术核移植技术 该技术源于用微细玻璃管对阿米巴原虫进行的核注射该技术源于用微细玻璃管对阿米巴原虫进行的核注射1938年年，Spemann提提出出了了细细胞胞核核的的全全能能性性和和将将分分化化的的细细胞胞核核移移植到卵母细胞的设想；植到卵母细胞

14、的设想；1952年年，Briggs和和King将将蛙蛙胚胚胎胎细细胞胞核核注注射射导导卵卵内内，构构建建的的重重组胚胎发育成蝌蚪和蛙；组胚胎发育成蝌蚪和蛙；1962年，年，Gurdon证实已分化的细胞核可恢复其全能性；证实已分化的细胞核可恢复其全能性；1969年，开始哺乳动物的核移植研究；年，开始哺乳动物的核移植研究；现在学习的是第35页，共42页1981年年，Illmenser和和Hoppe将将小小鼠鼠胚胚胎胎内内细细胞胞团团的的细细胞胞核核植植入去核的受精卵中，克隆出入去核的受精卵中，克隆出3只小鼠；只小鼠；1986年年，Willadsen等等用用未未分分化化的的胚胚胎胎细细胞胞克克隆隆出

15、出一一只只核核移移植植绵羊；绵羊；1987年，年，Robl用胚胎细胞克隆出核移植羊；用胚胎细胞克隆出核移植羊；1997年年，Wilmut用用成成年年绵绵羊羊的的乳乳腺腺上上皮皮细细胞胞为为核核供供体体，克克隆隆出出绵绵羊羊Dolly。现在学习的是第36页，共42页 优点：优点：对体细胞进行基因改造后，用于核移植对体细胞进行基因改造后，用于核移植可以提高转基因的效率，不仅具有可以提高转基因的效率，不仅具有“ES细胞细胞途径途径”的全部优点，且物种适用面广，无需的全部优点，且物种适用面广，无需经过嵌合体育种就可获得纯合个体，周期短，经过嵌合体育种就可获得纯合个体，周期短，效率高。效率高。现在学习的

16、是第37页，共42页 缺点：缺点：技术上难度大，技术上难度大，成功率极低，成功率极低，胚胎死亡率高，胚胎死亡率高，非一般实验室可以开展。非一般实验室可以开展。现在学习的是第38页，共42页2.6 人工酵母染色体(YAC)法 近年来发展起来的新型载体,具有克隆百万碱基对的大片段外源 DNA 的能力,可以保证巨大基因的完整性。主要途径有:胚胎干细胞转入 YAC 后体外筛选,阳性胚胎干细胞囊胚腔注射;YAC原核注射。现在学习的是第39页，共42页 优点：优点：保证大片段的完整性保证大片段的完整性。保证较长外源片段在转基因动物研究中的保证较长外源片段在转基因动物研究中的整合率提高整合率提高。保证了目的

17、基因上下游的侧翼序列的完整保证了目的基因上下游的侧翼序列的完整性，因而可以消除或减弱基因整合后的位性，因而可以消除或减弱基因整合后的位 置效应。置效应。现在学习的是第40页，共42页 介导法介导法制备转基因动物具有广阔制备转基因动物具有广阔的应用前景。的应用前景。现在学习的是第41页，共42页 除上述几种常用的转基因方法外，人除上述几种常用的转基因方法外，人们为了适应于一些特殊需要也探索了一些们为了适应于一些特殊需要也探索了一些其他的方法。例如诱变技术其他的方法。例如诱变技术(P265)等，这等，这些方法都不太成熟，其应用也正被人们验些方法都不太成熟，其应用也正被人们验证。证。现在学习的是第42页，共42页