酶法分析生科院.ppt

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1、酶法分析生科院现在学习的是第1页，共35页酶法分析与酶活力测定的异同酶法分析与酶活力测定的异同 相同点：二者均使用了酶促反应相同点：二者均使用了酶促反应不同点：不同点：测定的目的物不同，实验设计不同测定的目的物不同，实验设计不同 酶活力测定中待测物为酶，因而酶必须酶活力测定中待测物为酶，因而酶必须酶活力测定中待测物为酶，因而酶必须酶活力测定中待测物为酶，因而酶必须 是限速因素，而底物和辅酶是限速因素，而底物和辅酶是限速因素，而底物和辅酶是限速因素，而底物和辅酶等必须过量；等必须过量；等必须过量；等必须过量；酶法分析中待测物不是酶，而是底物或辅酶或抑制剂或激动剂等等。酶法分析中待测物不是酶，而是

2、底物或辅酶或抑制剂或激动剂等等。酶法分析中待测物不是酶，而是底物或辅酶或抑制剂或激动剂等等。酶法分析中待测物不是酶，而是底物或辅酶或抑制剂或激动剂等等。因而必须使待测物成为该反应的限速因素。因而必须使待测物成为该反应的限速因素。因而必须使待测物成为该反应的限速因素。因而必须使待测物成为该反应的限速因素。因此二者是不相同的，不能混为一谈因此二者是不相同的，不能混为一谈。现在学习的是第2页，共35页现在学习的是第3页，共35页终点法终点法(总变量法总变量法 )终点法是以下述原理为基础的：终点法是以下述原理为基础的：先借助酶反应（单个酶反应或者几种酶构成的偶先借助酶反应（单个酶反应或者几种酶构成的偶

3、联酶反应）使被测物质定量地进行转变，然后在转联酶反应）使被测物质定量地进行转变，然后在转变完成后，测定底物、产物或辅酶物质（第二底物）变完成后，测定底物、产物或辅酶物质（第二底物）等的变化量，因此称为终点测定法。终点法是酶法等的变化量，因此称为终点测定法。终点法是酶法分析中最普遍，最广泛的定量法分析中最普遍，最广泛的定量法。现在学习的是第4页，共35页终点法的条件终点法的条件必须有专一地作用该被测物质的酶，并能得到它的必须有专一地作用该被测物质的酶，并能得到它的制品。制品。能够确定使这种酶反应接近进行完全的条件。能够确定使这种酶反应接近进行完全的条件。能够确定使这种酶反应接近进行完全的条件。能

4、够确定使这种酶反应接近进行完全的条件。反应中底物的减少或产物的增加或辅酶物质的改变等反应中底物的减少或产物的增加或辅酶物质的改变等反应中底物的减少或产物的增加或辅酶物质的改变等反应中底物的减少或产物的增加或辅酶物质的改变等可以借助某种简单的方法进行测定。可以借助某种简单的方法进行测定。可以借助某种简单的方法进行测定。可以借助某种简单的方法进行测定。在能满足这些条件的情况下，最好是采用单一酶反应在能满足这些条件的情况下，最好是采用单一酶反应在能满足这些条件的情况下，最好是采用单一酶反应在能满足这些条件的情况下，最好是采用单一酶反应就能进行定量检测。就能进行定量检测。就能进行定量检测。就能进行定量

5、检测。现在学习的是第5页，共35页使用终点法应注意的问题使用终点法应注意的问题1酶的底物专一性：酶的底物专一性：绝对专一性绝对专一性相对专一性相对专一性立体异构专一性立体异构专一性 对于酶法分析来说，最理想的酶是具有绝对对于酶法分析来说，最理想的酶是具有绝对专一性的酶。专一性的酶。现在学习的是第6页，共35页2反应的平衡反应的平衡 对于终点法来说，要求反应接近进行完全，故对不同的对于终点法来说，要求反应接近进行完全，故对不同的对于终点法来说，要求反应接近进行完全，故对不同的对于终点法来说，要求反应接近进行完全，故对不同的酶反应须采取不同的措施使反应进行到接近完全。酶反应须采取不同的措施使反应进

6、行到接近完全。酶反应须采取不同的措施使反应进行到接近完全。酶反应须采取不同的措施使反应进行到接近完全。若酶反应平衡十分偏向进行方向，则可方便的用终点法进行检测，不需进若酶反应平衡十分偏向进行方向，则可方便的用终点法进行检测，不需进若酶反应平衡十分偏向进行方向，则可方便的用终点法进行检测，不需进若酶反应平衡十分偏向进行方向，则可方便的用终点法进行检测，不需进行任何处理。行任何处理。行任何处理。行任何处理。若反应的平衡并不十分偏向进行方向，或偏向逆方向，那么由于反应不能完若反应的平衡并不十分偏向进行方向，或偏向逆方向，那么由于反应不能完若反应的平衡并不十分偏向进行方向，或偏向逆方向，那么由于反应不

7、能完若反应的平衡并不十分偏向进行方向，或偏向逆方向，那么由于反应不能完全，因而也就不能正常定量。为了解决这一问题，通常采取以下一些措施：全，因而也就不能正常定量。为了解决这一问题，通常采取以下一些措施：全，因而也就不能正常定量。为了解决这一问题，通常采取以下一些措施：全，因而也就不能正常定量。为了解决这一问题，通常采取以下一些措施：对于双底物反应尽可能提高第二底物的浓度对于双底物反应尽可能提高第二底物的浓度对于双底物反应尽可能提高第二底物的浓度对于双底物反应尽可能提高第二底物的浓度 对氧化还原之类与对氧化还原之类与对氧化还原之类与对氧化还原之类与H H H H有关的反应要选择适当的有关的反应要

8、选择适当的有关的反应要选择适当的有关的反应要选择适当的pHpHpHpH 设法除去产物设法除去产物设法除去产物设法除去产物 用具有不同平衡常数的辅酶类似物代替原有的辅酶用具有不同平衡常数的辅酶类似物代替原有的辅酶用具有不同平衡常数的辅酶类似物代替原有的辅酶用具有不同平衡常数的辅酶类似物代替原有的辅酶 和第二底物的再生系统偶联，则第一底物可能完全转化为反应产物和第二底物的再生系统偶联，则第一底物可能完全转化为反应产物和第二底物的再生系统偶联，则第一底物可能完全转化为反应产物和第二底物的再生系统偶联，则第一底物可能完全转化为反应产物现在学习的是第7页，共35页3反应液中的酶量反应液中的酶量 对于一个

9、具体的测定来说不同的酶反应有不对于一个具体的测定来说不同的酶反应有不同的同的Km值，通过米氏方程和均相溶液反应值，通过米氏方程和均相溶液反应的动力学推算和分析，可以大致得到如下的动力学推算和分析，可以大致得到如下的结论：的结论：对于单酶反应的酶法分析：所加入的酶量（对于单酶反应的酶法分析：所加入的酶量（对于单酶反应的酶法分析：所加入的酶量（对于单酶反应的酶法分析：所加入的酶量（u/mlu/mlu/mlu/ml）相当于）相当于）相当于）相当于KmKmKmKm（mmolmmolmmolmmol）对于偶联反应的酶法分析，所加入的酶量如下：对于偶联反应的酶法分析，所加入的酶量如下：对于偶联反应的酶法分

10、析，所加入的酶量如下：对于偶联反应的酶法分析，所加入的酶量如下：第一反应为酶量（第一反应为酶量（第一反应为酶量（第一反应为酶量（u/mlu/mlu/mlu/ml）相当于）相当于）相当于）相当于Km1Km1Km1Km1（mmolmmolmmolmmol）第二反应为酶量（第二反应为酶量（第二反应为酶量（第二反应为酶量（u/mlu/mlu/mlu/ml）相当于（）相当于（）相当于（）相当于（1 1 1 12 2 2 2）Km2Km2Km2Km2（mmolmmolmmolmmol）现在学习的是第8页，共35页4.反应产物抑制反应产物抑制现在学习的是第9页，共35页终点法的种类终点法的种类（一）单酶反应

11、定量法：（一）单酶反应定量法：在这种单酶反应中，不需指示反应，可以在这种单酶反应中，不需指示反应，可以直接测定直接测定S S的减少量或的减少量或P P的增加量和辅酶的增加量和辅酶的变化量。的变化量。1、底物减少量的测定、底物减少量的测定 可定量的物质有：胞嘧啶（可定量的物质有：胞嘧啶（280nm）、腺）、腺嘌呤（嘌呤（280nm）和尿酸（）和尿酸（293nm或或297nm）。）。现在学习的是第10页，共35页尿酸的定量尿酸的定量现在学习的是第11页，共35页2.2.产物增加量的测定产物增加量的测定 此法可定量的物质有：（1）各种氨基酸和草酸 （2）黄嘌呤、次黄嘌呤以及CoA3.3.辅酶变化量的

12、测定辅酶变化量的测定 条件：条件：测定以NAD或NADP为辅酶的脱氢酶的底物的量，此法适用范围很广。原理：原理：NADH和NADPH在340nm有特征最大吸收峰，而NAD和NADP在340nm却无这一吸收带，故可应用于NAD或NADP为辅酶的脱氢酶反应，通过测定340nm吸光度的变化，就可以对作用相应脱氢酶底物的物质进行定量分析。现在学习的是第12页，共35页现在学习的是第13页，共35页羟基丙酮酸定量羟基丙酮酸定量可用两种酶：可用两种酶：甘油酸脱氢酶甘油酸脱氢酶（专一性强）（专一性强）乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶（丙酮酸干扰）（丙酮酸干扰）现在学习的是第14页，共35页现在学习的是第15页，共35页

13、（二）和指示酶反应偶联的定量法（二）和指示酶反应偶联的定量法常用在下面两种情况常用在下面两种情况现在学习的是第16页，共35页指示酶反应指示酶反应1.以脱氢酶为指示剂以脱氢酶为指示剂现在学习的是第17页，共35页A2-A1代表了代表了G-1-P的量的量现在学习的是第18页，共35页例2 样品中同时含有样品中同时含有G和果糖，利用酶法分析和果糖，利用酶法分析 测定测定G的量（利用己糖激酶的量（利用己糖激酶）现在学习的是第19页，共35页现在学习的是第20页，共35页例例3在一个比色杯中同时定量丙酮酸，磷酸烯醇式丙在一个比色杯中同时定量丙酮酸，磷酸烯醇式丙酮酸和酮酸和D-2-磷酸甘油酸磷酸甘油酸现

14、在学习的是第21页，共35页现在学习的是第22页，共35页2.以脱氢酶以外的酶作为指示剂以脱氢酶以外的酶作为指示剂过氧化物酶作为指示剂过氧化物酶作为指示剂现在学习的是第23页，共35页心肌黄酶作为指示剂心肌黄酶作为指示剂心肌黄酶作为指示剂心肌黄酶作为指示剂492nm有强吸收有强吸收例：例：L-谷氨酸的定量测定谷氨酸的定量测定测定反应：测定反应：L-Glu+NAD +H2O 谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶+-酮戊二酸戊二酸+NADH+H+指示反应：指示反应：NADH+INT +H心肌黄酶心肌黄酶NAD +甲臜甲臜+NADH+H +INT(NADH+H +INT(碘代硝基四唑碘代硝基四唑碘代硝基四唑碘代

15、硝基四唑)NAD +甲臜甲臜 心肌黄酶心肌黄酶+现在学习的是第24页，共35页酶循环放大分析法酶循环放大分析法现在学习的是第25页，共35页酶循环放大法的原理、步骤酶循环放大法的原理、步骤（超微量前列腺素的定量为例）（超微量前列腺素的定量为例）（三步）第一步：转换反应（三步）第一步：转换反应第二步：循环反应第二步：循环反应现在学习的是第26页，共35页第三步：指示反应：利用终点法测第三步：指示反应：利用终点法测Glu（或（或3磷酸甘油酸）的量磷酸甘油酸）的量如何测得循环数如何测得循环数n？用已知量的用已知量的NADH已知已知作为作为NADH转转在相同条件下在相同条件下进行循环反应和指示反应进行

16、循环反应和指示反应NADH已知已知=NADH指示指示/n n=NADH指示指示/NADH已知已知（即用已知量的（即用已知量的NADH已知已知平行做循环反应，指示反平行做循环反应，指示反应）应）现在学习的是第27页，共35页在这种方法中应注意的几个问题：在这种方法中应注意的几个问题：1.在进行循环反应之前，必须在进行循环反应之前，必须设法除去转换反应中剩余的辅酶设法除去转换反应中剩余的辅酶，在上例中就是，在上例中就是设法除去设法除去NAD+除去的方式：除去的方式：NAD和和NADP的氧化型和还原型在不同的的氧化型和还原型在不同的pH值下其稳定性不同，可值下其稳定性不同，可通过调节通过调节pH来达

17、到目的来达到目的 NAD+NADP+(氧化型氧化型)NADH NADPH(还原型还原型)pH2（25）1h稳定稳定 5min99.9%被破坏被破坏pH13（60）10min99.9%被破坏被破坏 1001h 仍稳定仍稳定 2.在循环反应在循环反应中中，底物（不是辅酶）需够量底物（不是辅酶）需够量3.要用要用已知量的循环底物已知量的循环底物（上例中（上例中NADH）平行做循环反应和指）平行做循环反应和指示反应以求得循环数示反应以求得循环数n现在学习的是第28页，共35页现在学习的是第29页，共35页单酶循环单酶循环现在学习的是第30页，共35页现在学习的是第31页，共35页（二）应用范围（二）应

18、用范围1.有循环底物参加的酶反应的底物或酶可测定有循环底物参加的酶反应的底物或酶可测定NAD、NADP、CoA等等2.能与以上反应偶联的酶反应的底物或酶能与以上反应偶联的酶反应的底物或酶 可测可测定定现在学习的是第32页，共35页“酶法分析酶法分析酶法分析酶法分析”一章的要求一章的要求一章的要求一章的要求1 1 掌握终点法的测定原理，终点法的条件掌握终点法的测定原理，终点法的条件掌握终点法的测定原理，终点法的条件掌握终点法的测定原理，终点法的条件2 2 使用终点法测定时应注意的问题使用终点法测定时应注意的问题使用终点法测定时应注意的问题使用终点法测定时应注意的问题3 3 掌握通过测定辅酶变化量

19、的单酶反应定量法（学会如何进行实验设掌握通过测定辅酶变化量的单酶反应定量法（学会如何进行实验设掌握通过测定辅酶变化量的单酶反应定量法（学会如何进行实验设掌握通过测定辅酶变化量的单酶反应定量法（学会如何进行实验设计和分析）计和分析）计和分析）计和分析）4 4 掌握以脱氢酶为指示剂的偶联定量法（学会如何进行实验设计和分析）掌握以脱氢酶为指示剂的偶联定量法（学会如何进行实验设计和分析）掌握以脱氢酶为指示剂的偶联定量法（学会如何进行实验设计和分析）掌握以脱氢酶为指示剂的偶联定量法（学会如何进行实验设计和分析）5 5 掌握酶循环放大分析的原理和步骤掌握酶循环放大分析的原理和步骤掌握酶循环放大分析的原理和步骤掌握酶循环放大分析的原理和步骤6 6 使用循环放大分析法时应注意的问题使用循环放大分析法时应注意的问题使用循环放大分析法时应注意的问题使用循环放大分析法时应注意的问题7 7掌握循环放大分析法的应用（学会如何进行实验设计和分析）掌握循环放大分析法的应用（学会如何进行实验设计和分析）掌握循环放大分析法的应用（学会如何进行实验设计和分析）掌握循环放大分析法的应用（学会如何进行实验设计和分析）现在学习的是第33页，共35页反应速度法反应速度法现在学习的是第34页，共35页辅酶的测定辅酶的测定现在学习的是第35页，共35页