分子生物学常用技术精选PPT.ppt
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1、关于分子关于分子生物学常生物学常用技术用技术第1页,讲稿共130张,创作于星期一分子生物学常用技术分子生物学常用技术 凝胶电泳凝胶电泳 分子杂交分子杂交 聚合酶链反应聚合酶链反应(PCR)技术技术 DNA的物理图谱的物理图谱 DNA序列测定序列测定 基因芯片基因芯片第2页,讲稿共130张,创作于星期一第一节第一节 凝胶电泳凝胶电泳(gel electrophoresis)电泳概念电泳概念基本原理基本原理 Q 6r:迁移率迁移率 Q:电荷电荷量量 r:粒子半径(分子量)粒子半径(分子量):介质粘度介质粘度 第3页,讲稿共130张,创作于星期一电泳的用途电泳的用途分离分离鉴定纯度鉴定纯度测定分子量
2、测定分子量凝胶电泳的种类凝胶电泳的种类琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 第4页,讲稿共130张,创作于星期一一、琼脂糖凝胶电泳一、琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresis)分离核酸原理分离核酸原理 操作要点操作要点 应用范围应用范围第5页,讲稿共130张,创作于星期一(一)(一)分离核酸原理分离核酸原理 电荷效应电荷效应 分子筛效应分子筛效应 分子构象分子构象第6页,讲稿共130张,创作于星期一1.电荷效应电荷效应 核酸是核酸是两性电解质两性电解质 pH=3.5,正电荷正电荷 pH=8.08.3,负电荷,正极负电荷,正极第7页,讲
3、稿共130张,创作于星期一第8页,讲稿共130张,创作于星期一2.分子筛效应分子筛效应 小分子小分子移动快移动快,大分子移动慢,大分子移动慢第9页,讲稿共130张,创作于星期一3.分子构象分子构象闭环超螺旋闭环超螺旋线状线状DNA开环开环DNA+-第10页,讲稿共130张,创作于星期一(二)操作要点(二)操作要点支持物支持物 凝胶浓度的选择凝胶浓度的选择 DNA分子量标准分子量标准 电泳缓冲液电泳缓冲液 样品制备样品制备 电泳条件电泳条件 DNA电泳染色电泳染色 DNA片段的回收片段的回收 第11页,讲稿共130张,创作于星期一1.支持物支持物第12页,讲稿共130张,创作于星期一商品化的琼脂
4、糖商品化的琼脂糖第13页,讲稿共130张,创作于星期一琼脂糖种类琼脂糖种类普通低熔点高纯高筛分熔点8090几十几十V/cm温度:温度:1525 第25页,讲稿共130张,创作于星期一潜水电泳潜水电泳第26页,讲稿共130张,创作于星期一7.电泳染色电泳染色 溴乙锭溴乙锭(ethidium bromide,EB)结构及染色原理结构及染色原理 染色方法染色方法加入凝胶液中加入凝胶液中 电泳结束后电泳结束后染色染色 第27页,讲稿共130张,创作于星期一EB染色原理染色原理第28页,讲稿共130张,创作于星期一第29页,讲稿共130张,创作于星期一紫外灯下显色紫外灯下显色第30页,讲稿共130张,创
5、作于星期一8.DNA片段的回收片段的回收低熔点琼脂糖法低熔点琼脂糖法 透析袋电洗脱法透析袋电洗脱法(5kb)DEAE-纤维素膜法纤维素膜法(0.55kb)第31页,讲稿共130张,创作于星期一(三)应用范围(三)应用范围 DNA的分离、纯化和鉴定的分离、纯化和鉴定 限制性酶切图谱分析限制性酶切图谱分析 重组体的分离、鉴定重组体的分离、鉴定 杂交分析杂交分析 PCR产物的分离鉴定产物的分离鉴定 第32页,讲稿共130张,创作于星期一琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳第33页,讲稿共130张,创作于星期一二、聚丙烯酰胺凝胶电泳二、聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrop
6、horesis,PAGE)分离原理分离原理 操作要点操作要点 优点优点 应用范围应用范围第34页,讲稿共130张,创作于星期一(一)分离原理(一)分离原理 电荷效应电荷效应 分子筛效应分子筛效应第35页,讲稿共130张,创作于星期一PAGE支持物支持物单体丙烯酰胺单体丙烯酰胺(Acr)交联剂甲叉双丙烯酰胺交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)催化剂过硫酸胺催化剂过硫酸胺(AP)加加速速剂剂N,N,N,N-四四甲甲基基乙乙二二胺胺(TEMED)第36页,讲稿共130张,创作于星期一聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶第37页,讲稿共130张,创作于星期一(二)操作要点(二)操作要点凝胶的分类凝胶的分类 凝胶浓度
7、的选择凝胶浓度的选择 凝胶液的配制凝胶液的配制 凝胶中凝胶中DNA的检测的检测DNA片段的回收片段的回收 第38页,讲稿共130张,创作于星期一1.凝胶的分类凝胶的分类非变性非变性凝胶:凝胶:dsDNA变性凝胶变性凝胶:ssDNA尿素尿素甲酰胺甲酰胺SDS第39页,讲稿共130张,创作于星期一2.凝胶浓度的选择凝胶浓度的选择第40页,讲稿共130张,创作于星期一第41页,讲稿共130张,创作于星期一3.凝胶液的配制凝胶液的配制 试剂(ml)制备浓度(%)3.5 5.08.0122030%Acr11.616.626.640.066.6ddH2O67.762.752.739.312.75XTBE2
8、0.020.020.020.020.010%AP0.70.70.70.70.7TEMED35ul/100ml第42页,讲稿共130张,创作于星期一PAGE装置装置第43页,讲稿共130张,创作于星期一第44页,讲稿共130张,创作于星期一第45页,讲稿共130张,创作于星期一第46页,讲稿共130张,创作于星期一电电 泳泳第47页,讲稿共130张,创作于星期一4.凝胶中凝胶中DNA的检测的检测溴乙锭染色法溴乙锭染色法 银盐染色法银盐染色法 甲醛甲醛 还原还原放射自显影法放射自显影法 Ag+DNA Ag(黑褐色)黑褐色)第48页,讲稿共130张,创作于星期一5.DNA片段的回收片段的回收压碎浸泡
9、法压碎浸泡法 1kb 纯度高,回收率低纯度高,回收率低第49页,讲稿共130张,创作于星期一(三)(三)PAGE优点优点机械强度好、化学稳定性高机械强度好、化学稳定性高分辨率高分辨率高 载样量大载样量大 回收的回收的DNA纯度高纯度高 第50页,讲稿共130张,创作于星期一(四)(四)PAGE应用范围应用范围分离、纯化和鉴定分离、纯化和鉴定RNA和小分子和小分子DNA DNA序列分析序列分析 PCR产物鉴定产物鉴定 蛋白质的检测和分析蛋白质的检测和分析 第51页,讲稿共130张,创作于星期一第二节第二节 分子杂交分子杂交分子杂交的基本原理分子杂交的基本原理固相支持物固相支持物探针探针几种常用杂
10、交技术几种常用杂交技术第52页,讲稿共130张,创作于星期一一、分子杂交的基本原理一、分子杂交的基本原理 核酸的变性和复性核酸的变性和复性第53页,讲稿共130张,创作于星期一分分子子杂杂交交DNA-DNA第54页,讲稿共130张,创作于星期一DNA-RNA第55页,讲稿共130张,创作于星期一杂交条件杂交条件 靶分子靶分子 探针探针 杂交袋杂交袋 杂交炉杂交炉第56页,讲稿共130张,创作于星期一杂交种类杂交种类被检核酸种类和方法被检核酸种类和方法 原位杂交原位杂交斑点杂交斑点杂交Southern杂交杂交Northern杂交杂交Western杂交杂交 反应介质反应介质 液相杂交液相杂交 固相
11、杂交固相杂交()第57页,讲稿共130张,创作于星期一二、固相支持物二、固相支持物 固相支持物的特性固相支持物的特性结合能力强结合能力强不影响杂交反应不影响杂交反应结合牢固结合牢固 非特异性吸附少非特异性吸附少 机械性能良好机械性能良好 第58页,讲稿共130张,创作于星期一固相支持物的种类固相支持物的种类 硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜 (nitrocellulose filter membrane)尼龙膜尼龙膜(nylon membrane)第59页,讲稿共130张,创作于星期一1.硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜 特点特点吸附吸附ssDNA和和RNA 杂交信号本底低杂交信号本底低 不足不足不适
12、于重复杂交不适于重复杂交滤膜较脆滤膜较脆 不适于电转移印迹法不适于电转移印迹法 对对DNA小片段小片段(缺口翻译缺口翻译 操作简便操作简便 DNA/cDNA 探针探针 第69页,讲稿共130张,创作于星期一第70页,讲稿共130张,创作于星期一DNA的的5末端标记末端标记(5end labeling)碱性磷酸酶碱性磷酸酶T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶 标记原理标记原理 制备寡核苷酸探针制备寡核苷酸探针 制备短的制备短的DNA/RNA探针探针 第71页,讲稿共130张,创作于星期一DNA的的5末端标记末端标记第72页,讲稿共130张,创作于星期一四、四、Southern 杂交杂交Southern
13、blotting/DNA blotting1975年,年,Edwen Southern等等印迹印迹(blotting):转移转移 blot:a spot or mark,esp.of ink blotting 第73页,讲稿共130张,创作于星期一1.印迹的方法印迹的方法 毛细管转移法毛细管转移法 电转移法电转移法 真空转移法真空转移法 第74页,讲稿共130张,创作于星期一毛细管转移法毛细管转移法 第75页,讲稿共130张,创作于星期一电转移法电转移法第76页,讲稿共130张,创作于星期一真空转移法真空转移法第77页,讲稿共130张,创作于星期一第78页,讲稿共130张,创作于星期一2.So
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