反向遗传学及其相关技术精选PPT.ppt

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1、关于反向遗传学及其相关技术第1页，讲稿共75张，创作于星期日一、概述一、概述（一）遗传研究的二条途径（一）遗传研究的二条途径1、表、表里：里：正向遗传学研究正向遗传学研究杂交或诱变杂交或诱变表型观察表型观察遗传规律遗传规律确定存在的基确定存在的基因及数目因及数目基因的功能及作用性质。基因的功能及作用性质。这一途径是从生物体的性状、表型变化来研究遗传这一途径是从生物体的性状、表型变化来研究遗传物质的组成、分布与传递规律，属于正向遗传学采物质的组成、分布与传递规律，属于正向遗传学采用的研究方法。用的研究方法。第2页，讲稿共75张，创作于星期日2、里里表：表：反向遗传学研究反向遗传学研究在在已已知知

2、DNA序序列列的的基基础础上上，通通过过DNA重重组组、定定点点突突变变、插插入入/缺缺失失等等遗遗传传修修饰饰手手段段创创造造突突变变体体并并研研究究突突变变所所造造成成的的表表型型效效应应，从从而而研研究究基基因因的的生生物物学功能，阐明生命的本质现象与规律。学功能，阐明生命的本质现象与规律。与反向遗传学相关的遗传操作技术为反向遗传学与反向遗传学相关的遗传操作技术为反向遗传学技术。技术。第3页，讲稿共75张，创作于星期日（二）（二）RNA病毒的反向遗传学病毒的反向遗传学 n采采用用病病毒毒的的遗遗传传材材料料，在在培培养养细细胞胞或或易易感感宿宿主主中中重重新新拯救出活病毒或类似病毒物质。

3、拯救出活病毒或类似病毒物质。n能能够够拯拯救救病病毒毒的的遗遗传传材材料料称称为为感感染染性性克克隆隆，一一般般是是在在细细菌菌质质粒粒中中含含有有整整个个病病毒毒基基因因组组的的cDNA拷拷贝贝，使使得得cDNA本本身或从身或从cDNA体外转录所得的体外转录所得的RNA具有感染性。具有感染性。nRNA病病毒毒的的反反向向遗遗传传系系统统通通过过定定向向修修饰饰病病毒毒的的基基因因组组序序列列，检检测测被被拯拯救救的的人人工工改改造造病病毒毒的的表表型型，可可以以在在体体内内(in vivo)有有效效地地研研究究病病毒毒基基因因结结构构、功功能能和和病病毒毒-宿宿主主相相互互作作用。用。第4页

4、，讲稿共75张，创作于星期日nRNA病毒的反向遗传操作病毒的反向遗传操作 RT-PCR构建构建RNA病毒的全长病毒的全长cDNA，并进行遗传修饰，并进行遗传修饰 与与RNA聚合酶启动子结合聚合酶启动子结合 体外转录病毒体外转录病毒RNA 转录物转录物RNA感染哺乳动物细胞感染哺乳动物细胞 拯救到活病毒拯救到活病毒 拯救病毒的表型变化拯救病毒的表型变化 病毒基因组的表达、调控、致病机理、病毒基因组的表达、调控、致病机理、病毒与宿主细胞互作、疫苗制造等病毒与宿主细胞互作、疫苗制造等第5页，讲稿共75张，创作于星期日单正股单正股RNA病毒：病毒：RNA聚合酶聚合酶+mRNA +中间型中间型 结构蛋白

5、结构蛋白+子代正股子代正股RNA单负股单负股RNA病毒：病毒：RNA聚合酶聚合酶 +结构蛋白结构蛋白子代负股子代负股RNA逆转录病毒逆转录病毒：RNARNA/DNA中间体中间体逆转录酶逆转录酶DNA/DNA宿主宿主子代子代RNA正股正股RNA与负股与负股RNA病毒、逆转录病毒病毒、逆转录病毒?第6页，讲稿共75张，创作于星期日（三）真核生物的反向遗传学（三）真核生物的反向遗传学采采用用反反向向遗遗传传学学鉴鉴定定基基因因功功能能是是真真核核生生物物功功能能基因组学的主要内容。基因组学的主要内容。研研究究手手段段包包括括基基因因的的互互补补实实验验、超超表表达达、反反义义抑抑制制、基因敲除基因敲

6、除/基因打靶、基因陷阱、基因激活等手段。基因打靶、基因陷阱、基因激活等手段。利利用用基基因因敲敲除除或或基基因因沉沉默默而而产产生生的的功功能能变变化化研研究究基因功能是主要的反向遗传学技术。基因功能是主要的反向遗传学技术。第7页，讲稿共75张，创作于星期日二、反向遗传学相关技术二、反向遗传学相关技术1、基因的同源重组、基因的同源重组2、基因的位点突变、基因的位点突变3、基因沉默、基因沉默基因敲除基因敲除第8页，讲稿共75张，创作于星期日利用利用DNA转化技术，将含有目的基因和靶基因同源转化技术，将含有目的基因和靶基因同源片段的重组载体导入靶细胞，通过载体与靶细胞染色片段的重组载体导入靶细胞，

7、通过载体与靶细胞染色体上同源序列间的重组，将外源基因整合入内源基因体上同源序列间的重组，将外源基因整合入内源基因组内，使外源基因得以表达。组内，使外源基因得以表达。通过研究靶细胞或者个体在目的基因插入前后遗传通过研究靶细胞或者个体在目的基因插入前后遗传特性的改变，达到研究基因功能的目的。特性的改变，达到研究基因功能的目的。1、基因的同源重组、基因的同源重组第9页，讲稿共75张，创作于星期日完完全全敲敲除除：通通过过同同源源重重组组直直接接将将靶靶基基因因在在细细胞胞或或者动物个体中的活性完全消除。者动物个体中的活性完全消除。条条件件敲敲除除：将将某某个个基基因因的的修修饰饰限限制制于于特特定定

8、类类型型的细胞或个体发育特定的阶段。的细胞或个体发育特定的阶段。完全敲除完全敲除条件敲除条件敲除特定组织特定组织/时间基因敲除时间基因敲除基因敲除基因敲除第10页，讲稿共75张，创作于星期日1）通过同源重组的基因敲除步骤）通过同源重组的基因敲除步骤构建重组载体构建重组载体 重组重组DNA转入受体细转入受体细胞核内胞核内 筛选目的细胞筛选目的细胞 转基因生物转基因生物重组载体的类型：重组载体的类型：a)替换性载体系统：替换性载体系统：包括同源序列片段、替换包括同源序列片段、替换基因的启动子、报道基因基因的启动子、报道基因等成分。等成分。b)插入性载体系统：插入性载体系统：插入基因片段插入基因片段

9、(目的基因目的基因)、同源序列片段、标志基因片同源序列片段、标志基因片段。段。第11页，讲稿共75张，创作于星期日用用替替换换型型（a）或或插插入入型型（b）载载体体进进行行完完全全基基因因敲敲除除实验实验第12页，讲稿共75张，创作于星期日2）Res同源重组系统同源重组系统源于源于噬菌体噬菌体Res重组酶的重组系统重组酶的重组系统Ha 和和Hb:同源重组区域同源重组区域 Pa 和和Pb:引物位点引物位点sm:筛选标记筛选标记Red 同源重组技术用于基因打靶同源重组技术用于基因打靶第13页，讲稿共75张，创作于星期日3）Cre-LoxP同源重组系统同源重组系统 源自源自P1噬菌体的重组系统噬菌

10、体的重组系统 属属于于传传统统的的同同源源重重组组载载体体，但但具具有有时时空空调调控控的的功功能能。该该系系统统由由P1噬噬菌菌体体的的Cre重重组组酶酶和和LoxP位位点点两两部部分分组组成。成。nCre重重组组酶酶：由Cre基因编码，识别LoxP位点，介介导导两两个个LoxPLoxP位位点点（序序列列）之之间间的的特特异异性性重重组组，使使LoxPLoxP位位点点间的基因序列被删除或重组。间的基因序列被删除或重组。nLoxP位位点点：由2个13bp的反向重复序列和1个8bp的间隔区域构成。第14页，讲稿共75张，创作于星期日Cre酶 Cre酶 Cre酶 CreCre重组酶重组酶13bp的

11、反向重复序列的反向重复序列 第15页，讲稿共75张，创作于星期日Cre-LoxP 重组系统的特点重组系统的特点CreCrea)Cre 重组酶所催化的是一个可逆的重组事件重组酶所催化的是一个可逆的重组事件b)Cre催化重组不需要任何辅助因子的参与催化重组不需要任何辅助因子的参与介导两个同向介导两个同向LoxP位点之间序列的插入位点之间序列的插入/缺失（下左）缺失（下左）介导两个反向介导两个反向LoxP位点之间序列颠倒（下右）位点之间序列颠倒（下右）介导两条含介导两条含LoxP位点位点DNA链的交换或染色体易位。链的交换或染色体易位。第16页，讲稿共75张，创作于星期日Cre-Loxp gene

12、knock-out system第17页，讲稿共75张，创作于星期日4)高等动物基因敲除技术高等动物基因敲除技术真真真真核核核核生生生生物物物物基基基基因因因因敲敲敲敲除除除除的的的的技技技技术术术术路路路路线线线线主主主主要要要要包包包包括括括括构构构构建建建建重重重重组组组组基基基基因因因因载载载载体体体体，用用用用电电电电穿穿穿穿孔孔孔孔、显显显显微微微微注注注注射射射射等等等等方方方方法法法法把把把把重重重重组组组组DNADNA导导导导入入入入胚胚胚胚胎胎胎胎干干干干细细细细胞胞胞胞纯纯纯纯系系系系中中中中，使使使使外外外外源源源源DNADNA与与与与胚胚胚胚胎胎胎胎干干干干细细细细胞

13、胞胞胞基基基基因因因因组组组组中中中中相相相相应应应应部部部部分分分分发发发发生生生生同同同同源源源源重重重重组组组组，将将将将重重重重组组组组载载载载体体体体中中中中的的的的DNADNA序序序序列列列列整整整整合合合合到到到到内源基因组中并得以表达。内源基因组中并得以表达。内源基因组中并得以表达。内源基因组中并得以表达。显显显显微微微微注注注注射射射射命命命命中中中中率率率率较较较较高高高高，技技技技术术术术难难难难度度度度相相相相对对对对大大大大些些些些。电电电电穿穿穿穿孔孔孔孔法法法法命中率比显微注射低，操作使用方命中率比显微注射低，操作使用方命中率比显微注射低，操作使用方命中率比显微注

14、射低，操作使用方 便。便。便。便。胚胚胚胚胎胎胎胎干干干干细细细细胞胞胞胞（ESES细细细细胞胞胞胞）分分分分离离离离和和和和体体体体外外外外培培培培养养养养的的的的成成成成功功功功奠奠奠奠定定定定了了了了哺哺哺哺乳动物基因敲除的技术基础。乳动物基因敲除的技术基础。乳动物基因敲除的技术基础。乳动物基因敲除的技术基础。第18页，讲稿共75张，创作于星期日模式动物小模式动物小鼠中完全基鼠中完全基因敲除的步因敲除的步聚聚近交系，白色，近交系，白色，易产生免疫缺易产生免疫缺陷陷 第19页，讲稿共75张，创作于星期日2、基因的位点突变、基因的位点突变1）点突变）点突变TILLING技术技术TILLING

15、(targeting induced local lesions in genomes)定向诱导基因组局部突变定向诱导基因组局部突变，是一种快速有效地从由化学诱变剂，是一种快速有效地从由化学诱变剂(EMS)诱变过的突变群体中鉴定出点突变的方法。诱变过的突变群体中鉴定出点突变的方法。先先用用化化学学诱诱变变剂剂(甲甲基基磺磺酸酸乙乙酯酯，EMS)诱诱发发产产生生一一系系列列的的点点突突变变，再再用用设设计计的的特特异异性性引引物物进进行行PCR扩扩增增，然然后后将将PCR扩扩增增产产物物变变性性和和退退火火形形成成异异源源双双链链核核酸酸分分子子，再再用用特特异异切切割割错错配配的的内内切切酶酶

16、CELl酶酶切切，最最后后变变性性处处理理后后采用双色聚丙烯酰胺凝胶采用双色聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳检测分析。电泳检测分析。第20页，讲稿共75张，创作于星期日（建池）（建池）第21页，讲稿共75张，创作于星期日第22页，讲稿共75张，创作于星期日TILLING特点：特点：TILLING技术属于高频率点突变和技术属于高频率点突变和PCR筛选相结合的技筛选相结合的技术，可发现基因的错义突变、基因截短型损伤等突变术，可发现基因的错义突变、基因截短型损伤等突变类型。类型。u可可获获得得大大量量的的等等位位基基因因系系列列，对对长长度度很很小小基基因因，复复等等位位基因等具有独特的技术优势。基因

17、等具有独特的技术优势。u可可诱诱导导产产生生高高频频率率的的点点突突变变，筛筛选选目目的的基基因因需需要要较较小的突变群体。小的突变群体。u不不依依赖赖于于农农杆杆菌菌介介导导转转化化或或内内源源标标签签系系统统，无无需需耗耗时的转基因和复杂的组织培养。时的转基因和复杂的组织培养。u需要知道所研究基因的序列。需要知道所研究基因的序列。第23页，讲稿共75张，创作于星期日2）随机插入突变）随机插入突变A.T-DNA插入突变插入突变 以以农农杆杆菌菌介介导导的的转转化化为为基基础础的的一一种种插插入入突突变变研研究究方方法法，根根据据插插入入位位点点的的基基因因序序列列与与植植物物表表型型变变异异

18、等等的的相相互互关关系系可可以以从基因组中分离出相应的基因并鉴定其功能。从基因组中分离出相应的基因并鉴定其功能。构建构建T-DNA载体载体转化转化突变体的筛选及遗传分析突变体的筛选及遗传分析分离分离T-DNA 插入位点的侧翼序列插入位点的侧翼序列基因的定位、结基因的定位、结构与功能分析。构与功能分析。第24页，讲稿共75张，创作于星期日T-DNA法法敲敲除除植植物物基基因因及及突变体筛选：突变体筛选：a.引引物物设设计计。LP和和RP分分别别代代表表插插入入基基因因两两端端的的引引物物，LB是是指指载载体体上上的的一一段段 引引物物。旁旁邻邻序序列是经测序后获得的列是经测序后获得的DNA序列。

19、序列。b.PCR产产物物电电泳泳结结果果。分分别别代代表表野野生生型型、杂杂合合子子和和纯纯合子合子PCR条带。条带。第25页，讲稿共75张，创作于星期日T-DNA插入特点：插入特点：n不能控制其在生物体基因组中的插入位点。在植物中用不能控制其在生物体基因组中的插入位点。在植物中用T-DNA 插入来敲除一个特定基因仍需要运气。插入来敲除一个特定基因仍需要运气。n隐性突变与显性突变：隐性隐性突变与显性突变：隐性表型的变化只能在转化体的表型的变化只能在转化体的部分后代中体现出来（基因敲除）；显性部分后代中体现出来（基因敲除）；显性可以在转化体可以在转化体中直接观察到（基因激活）。中直接观察到（基因

20、激活）。n某些特定基因，由于其特性在基因敲除后并不体现出某些特定基因，由于其特性在基因敲除后并不体现出功能的丧失。原因：重要的功能基因突变致死和冗余功能的丧失。原因：重要的功能基因突变致死和冗余基因。基因。n染色体重排：突变体表型与染色体重排：突变体表型与T-DNA 插入无关。插入无关。n效率不高，工作量大。建立饱和的突变体库。效率不高，工作量大。建立饱和的突变体库。第26页，讲稿共75张，创作于星期日B.转座子插入突变转座子插入突变利用某些能随机插入基因序列的转座子，在目标细胞基因组利用某些能随机插入基因序列的转座子，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，中进

21、行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞。然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞。由由转转座座子子引引起起的的突突变变可可以以转转座座子子DNA为为探探针针，从从突突变变体体的的基基因因组组DNA文文库库中中筛筛选选到到突突变变的的基基因因，再再利利用用这这部部分分序序列列从从野生型基因文库中获得完整的基因。野生型基因文库中获得完整的基因。也可以利用也可以利用PCR的方法扩增转座子的侧翼序列，进而得到完的方法扩增转座子的侧翼序列，进而得到完整的基因信息。整的基因信息。第27页，讲稿共75张，创作于星期日转座子插入特点：转座子插

22、入特点：插入的是完整的元件，便于分析。插入的是完整的元件，便于分析。可从插入位点切除，产生回复突变，因此不仅可以据可从插入位点切除，产生回复突变，因此不仅可以据此确认真正由转座子引起的突变，还可以进一步验证此确认真正由转座子引起的突变，还可以进一步验证突变基因的功能。突变基因的功能。转座子倾向于插入转座子的临近区域，可以用来研究基转座子倾向于插入转座子的临近区域，可以用来研究基因组某一局部区域的结构。因组某一局部区域的结构。通过不断跳动产生新的突变，相对较少的起始转化系就可以通过不断跳动产生新的突变，相对较少的起始转化系就可以获得整个基因组的饱和突变，大大减少了工作量。获得整个基因组的饱和突变

23、，大大减少了工作量。可以应用于转化效率不高的植物。可以应用于转化效率不高的植物。第28页，讲稿共75张，创作于星期日转座子系统转座子系统I.Ac/Ds 系统系统II.由由自自主主性性元元件件（Ac）和和非非自自主主性性元元件件（Ds）构构成成。Ds元元件件能能够够在在Ac编编码码的的转转座座酶酶的的作作用用下下移移动动，去去除除Ac元件可使其自身不能转座。元件可使其自身不能转座。III.通通过过遗遗传传杂杂交交引引入入自自主主性性元元件件，转转座座子子插插入入序序列列可可以以重重新新移移动动。因因此此，Ac/Ds 转转座座子子插插入入系系统统只只需需要要少少量的转基因品系（启动品系）作为转座源

24、即可。量的转基因品系（启动品系）作为转座源即可。第29页，讲稿共75张，创作于星期日在真核系统中，转座插入事件常不能产生可见的表在真核系统中，转座插入事件常不能产生可见的表型，这是因为功能基因的冗余或在早期产生致死效型，这是因为功能基因的冗余或在早期产生致死效应。采用经修饰的转座子可克服这些困难。应。采用经修饰的转座子可克服这些困难。修饰：转座因子后带一个报告基因，报告基因的表修饰：转座因子后带一个报告基因，报告基因的表达只有在转座事件发生的情况下才能获得，这样就达只有在转座事件发生的情况下才能获得，这样就可以通过报告基因来检测转座子的表达情况。可以通过报告基因来检测转座子的表达情况。修饰的修

25、饰的Ac/Ds转座子系统转座子系统第30页，讲稿共75张，创作于星期日n增强子陷阱增强子陷阱(enhancer trap)：转座子含有一：转座子含有一个具弱小启动子驱动的报告基因。报告基因的个具弱小启动子驱动的报告基因。报告基因的表达只有在转座发生在内源增强子附近时才能表达只有在转座发生在内源增强子附近时才能获得。获得。n启动子陷阱启动子陷阱(promoter trap)：转座子带有一：转座子带有一个无启动子的报告基因，这个基因只有在转座个无启动子的报告基因，这个基因只有在转座子插入一个植物活跃的内源启动子下游时才能子插入一个植物活跃的内源启动子下游时才能表达。表达。修饰的方法修饰的方法-增强

26、子陷阱与启动子陷阱增强子陷阱与启动子陷阱第31页，讲稿共75张，创作于星期日II.Mu转座子系统转座子系统n转转座座子子打打靶靶载载体体是是以以两两种种噬噬菌菌体体Mu为为基基础础的的mini-Mu转座子，每个转座子上都携带标记基因。转座子，每个转座子上都携带标记基因。n可可以以在在拟拟删删除除基基因因两两侧侧各各插插入入一一个个mini-Mu转转座座子子，然然后在两个插入位点之间制造缺失。后在两个插入位点之间制造缺失。n这这种种缺缺失失可可以以使使两两个个转转座座子子加加上上靶靶区区之之间间的的部部分分基基因因转移。转移。n特点：特点：u不需要知道基因组序列，仅已知外显子即可不需要知道基因组

27、序列，仅已知外显子即可u载体构建迅速，技术简单载体构建迅速，技术简单u载载体体可可以以携携带带多多种种不不同同抗抗性性基基因因，可可以以同同时时处处理理多多基因。基因。第32页，讲稿共75张，创作于星期日三、基因沉默技术三、基因沉默技术I.反义反义RNAII.RNA干扰干扰（RNAi）第33页，讲稿共75张，创作于星期日I.反义反义RNA技术技术反义反义RNA技术是根据技术是根据RNA序列人工合成的互补序列人工合成的互补RNA。根据反义根据反义RNA的作用机制可将其分为三类：的作用机制可将其分为三类：1、反反义义RNA是是直直接接作作用用于于靶靶mRNA的的核核蛋蛋白白体体结结合合位位点点或或

28、与与靶靶mRNA直直接接结结合合形形成成双双链链RNA，从从而而直直接接抑抑制制mRNA的的翻翻译译或被或被RNA酶酶识别降解。识别降解。2、反反义义RNA是是与与mRNA的的非非编编码码区区结结合合，引引起起mRNA构构象象的的变变化，从而抑制其翻译。化，从而抑制其翻译。3、反反义义RNA是是作作用用于于基基因因的的启启动动子子，直直接接抑抑制制靶靶mRNA的的转转录。录。第34页，讲稿共75张，创作于星期日（一）概念（一）概念RNA干扰干扰(RNA interference，RNAi)：与靶基因序列同源的双链与靶基因序列同源的双链RNA所诱导的一所诱导的一种序列特异性转录后种序列特异性转录

29、后基因沉默基因沉默现象。现象。II.RNA干扰干扰第35页，讲稿共75张，创作于星期日基因沉默基因沉默转录水平的基因沉默转录水平的基因沉默(Transcriptional Gene Silencing,TGS)转录后水平的基因沉默转录后水平的基因沉默(Post-transcriptional Gene Silencing,PTGS)基因沉默基因沉默第36页，讲稿共75张，创作于星期日转转录录水水平平的的基基因因沉沉默默（TGSTGS）是是指指基基因因在在细细胞胞核核内内RNARNA合合成成受受到到了了阻阻止止而而导导致致基基因因沉沉默默。转转录录水水平平基基因因沉沉默默可可以以通通过过有有性性

30、世世代代传传递，表现为减数分裂的可遗传性。递，表现为减数分裂的可遗传性。引起转录水平基因沉默的机制主要有以下几种：引起转录水平基因沉默的机制主要有以下几种：1.1.基基因因及及其其启启动动子子甲甲基基化化：通通常常发发生生在在DNADNA的的CGCG序序列列的的碱碱基基上上，该该区区域碱基甲基化往往导致转录受抑制域碱基甲基化往往导致转录受抑制。2.2.同同源源基基因因间间的的反反式式失失活活：拥拥有有同同源源序序列列的的沉沉默默位位点点和和其其他他位位点点的的DNADNA的的相相互互作作用用而而引引起起的的基基因因沉沉默默。甲甲基基化化并并失失活活的的基基因因能能作作为为一一种种“沉沉默默子子

31、”，对对其其他他具具有有同同源源性性的的靶靶基基因因施施加加一一种种反反式式作作用用，使使具具有有同同源源序序列列的的靶靶基基因因发发生生甲甲基基化化并并导导致致失失活活。反反式式失失活活的的靶靶基基因因既既可以与沉默基因是等位基因，也可以是非等位基因。可以与沉默基因是等位基因，也可以是非等位基因。第37页，讲稿共75张，创作于星期日3.后后成成修修饰饰作作用用导导致致的的基基因因沉沉默默：指指转转基基因因的的序序列列和和碱碱基基组组成成不不发发生生改改变变，但但是是其其功功能能却却在在个个体体发发育育的的某某一一阶阶段段受受到到细细胞胞内内因因子子的的修修饰饰作作用用后后而而关关闭闭。这这种

32、种修修饰饰作作用用所所造造成成的的转转基基因因沉沉默默是是可可以以随随着着修修饰饰作作用用的的解解除除而而被被消消除除。后后成成修修饰饰作作用用导导致致的的转转基基因因沉沉默默与与受受体植物的核型构成有关。体植物的核型构成有关。4.重重复复序序列列：外外源源基基因因如如果果以以多多拷拷贝贝形形式式整整合合到到同同一一位位点点上上，形形成成首首尾尾相相连连的的正正向向重重复复或或头头对对头头、尾尾对对尾尾的的反反向向重重复复，则则不不能能表表达达，而而且且拷拷贝贝数数越越多多，基基因因沉沉默默现现象象越越严严重重。这这种种重重复复序序列列诱诱导导的的基基因因沉沉默默可可能能是是重重复复序序列列间

33、间自自发发配配对对，甲甲基基化化酶酶特异性识别这种配对结构而使其甲基化，从而抑制其表达。特异性识别这种配对结构而使其甲基化，从而抑制其表达。第38页，讲稿共75张，创作于星期日转转录录后后水水平平基基因因沉沉默默（PTGSPTGS）则则是是指指基基因因能能够够在在细细胞胞核核里里被稳定地转录，但在细胞质里却无相应的被稳定地转录，但在细胞质里却无相应的mRNAmRNA存在的现象。存在的现象。引起转录后水平的基因沉默机制主要有以下几种：引起转录后水平的基因沉默机制主要有以下几种：1.1.共共抑抑制制：由由NapoliNapoli在在转转CHSCHS基基因因的的矮矮牵牵牛牛花花中中发发现现，普普遍遍

34、存存在在于于转转基基因因植植物物中中。其其发发生生是是由由于于外外源源基基因因编编码码区区与与受受体体细细胞胞基基因因间间存在同源性而导致外源基因与内源基因的表达同时受到抑制。存在同源性而导致外源基因与内源基因的表达同时受到抑制。2.2.具具有有同同源源性性的的外外基基因因和和内内源源基基因因在在细细胞胞核核内内的的转转录录速速率率很很高高，但但在在细细胞胞质质内内无无mRNAmRNA积积累累，是是典典型型的的转转录录后后水水平平基基因因沉沉默默。共共抑抑制制的的产产生生不不仅仅同同内内、外外源源基基因因间间编编码码区区的的同同源性有关，还与控制外源基因的启动子的强度等因素有关。源性有关，还与

35、控制外源基因的启动子的强度等因素有关。第39页，讲稿共75张，创作于星期日2.基基因因压压制制：CogoniCogoni等等首首先先在在粗粗糙糙脉脉孢孢霉霉的的转转化化实实验验中中发发现现，外外源源基基因因可可以以抑抑制制自自身身和和相相应应内内源源基基因因的的表表达达，他他们们把把这这一一现现象象定定为为基基因因压压制制。基基因因压压制制是是可可逆逆的的，而而且且这这种种逆逆转转会会伴伴随随有有外外源源拷拷贝贝的的丢丢失失。基基因因压压制制发发生生在在转转录录后后水水平平，导导致致已已复复制制的稳定态的稳定态mRNAmRNA大量减少。大量减少。3.3.RNARNA干干扰扰：指指将将与与靶靶基

36、基因因的的mRNAmRNA同同源源互互补补的的双双链链RNA RNA(dsRNA)(dsRNA)导导入入细细胞胞后后并并被被切切割割成成21212323个个核核苷苷酸酸长长度度的的短短核核苷苷酸酸双双链链，在在其其它它作作用用因因子子的的参参与与下下能能够够特特异异地地与与其其同同源源的的mRNAmRNA结结合合并并导导致致其其降降解解，从从而而产产生生相相应应的的功功能能表型缺失。表型缺失。第40页，讲稿共75张，创作于星期日RNAi 一种新的遗传工具一种新的遗传工具RNAi是是植植物物、果果蝇蝇、线线虫虫和和包包括括哺哺乳乳动动物物在在内内的的许许多多生生物物抵抵抗抗病病毒毒感感染染和和限

37、限制制转转座座子子运运动动的的一一种种自自然然存在的防御机制。存在的防御机制。RNAi可可以以作作为为一一种种简简单单、有有效效的的代代替替基基因因敲敲除除的的遗遗传传工工具具，来来制制备备特特定定基基因因缺缺失失表表型型的的个个体体，从从而而研研究究该该基基因因的功能的功能.这这项项技技术术在在疾疾病病的的基基因因治治疗疗上上也也有有光光明明的的应应用用前前景景。特特别别可可以以用用于于阻阻断断某某些些突突变变基基因因的的表表达达，或或者者由由蛋蛋白白过过量量表表达达引起的疾病。引起的疾病。第41页，讲稿共75张，创作于星期日(二二)、RNARNA干扰的发现干扰的发现 19941994年年

38、CogoniCogoni等证明真菌中亦有等证明真菌中亦有类似现象，此称为类似现象，此称为基因压制基因压制(quelling)(quelling)。共抑制现象共抑制现象(cosuppression)(cosuppression)上上世世纪纪9090年年代代初初，美美国国和和荷荷兰兰的的两两个个转转基基因因植植物物实实验验组组在在对对矮矮牵牵牛牛(petuniaspetunias)的研究中发现的研究中发现:转转基基因因的的植植株株不不仅仅没没有有新新基基因因表表达达，反反而而使使原原有有的的色色素素基基因因也也受受到到了了抑抑制。制。第42页，讲稿共75张，创作于星期日19951995年，康乃尔大

39、学的年，康乃尔大学的Su GuoSu Guo博士在试图阻博士在试图阻断秀丽新小杆线虫断秀丽新小杆线虫(C.elegans)(C.elegans)的的par-1par-1基基因实验中发现：因实验中发现：反义反义RNARNA与正义与正义RNARNA（对照）都能切断（对照）都能切断par-1par-1基因的表达。该研究小组一直未能给这基因的表达。该研究小组一直未能给这个意外以合理解释。个意外以合理解释。Guo S,Kemphues KJ,Par L.Cell,1995,81:611-620.秀丽新小杆线虫转基因实验秀丽新小杆线虫转基因实验反义反义RNA与正义与正义RNA？反义RNA-与靶核酸与靶核酸

40、(如如mRNA或有义或有义DNA)链互补的链互补的RNA分子，分子，可抑制靶核酸的功能。可抑制靶核酸的功能。正义正义RNA-与与mRNA对应的对应的RNA分子。分子。第43页，讲稿共75张，创作于星期日RNARNA干扰的发现干扰的发现 19981998年年，FireFire和和MelloMello（美美）首首次次在在秀秀丽丽新新小小杆杆线线虫虫中中证证明明上上述述现现象象属属于于转转录录后后水水平平的的基基因因沉沉默默。他他们们发发现现Su Su GuoGuo博博士士遇遇到到的的正正义义RNARNA抑抑制制基基因因表表达达的的现现象象，以以及及过过去去的的反反义义RNARNA技技术术对对基基因

41、因表表达达的的阻阻断断，都都是是由由于体外转录所得于体外转录所得RNARNA中污染了中污染了微量双链微量双链RNARNA而引起：而引起：将将体体外外转转录录得得到到的的单单链链RNARNA纯纯化化后后注注射射线线虫虫，基基因因抑抑制制效效应应变变得得十十分分微微弱弱，而而经经过过纯纯化化的的双双链链RNARNA却却正正好好相相反反，能能够够高高效效特特异异性性阻阻断断相相应应基基因因的的表表达达，其其抑抑制制基基因因表表达达的的效效率率比比纯纯化化后后的的反反义义RNARNA至至少少高高2 2个个数数量级。该小组将这一现象称为量级。该小组将这一现象称为RNARNA干扰干扰。Fire A,Xu

42、S,Montgomery ME,et al.Nature.1998,391:806-811.第44页，讲稿共75张，创作于星期日(A)Negative control showing lack of staining in the absence of the hybridization probe.（对照，缺（对照，缺mex-3，不着色），不着色）(B)Embryo from uninjected parent showing normal pattern of endogenous mex-3 RNA(purple staining).（正常野生型，紫）（正常野生型，紫）(C)Embryo

43、 from parent injected with purified mex-3 antisense RNA.These embryos(and the parent animals)retain mex-3 mRNA,although levels may be somewhat less than wild type.（野生型野生型+反义反义RNA，浅紫），浅紫）(D)Late 4-cell stage embryo from a parent injected with dsRNA corresponding to mex-3;no mex-3 RNA is detected.(Tem

44、plates used for interfering RNA and in situ probes were largely non-overlapping.)（野生型（野生型+双链双链RNA，不着色），不着色）Effects of mex-3 RNA interference on levels of the endogenous mRNA.Nomarski DIC micrographs show in situ hybridization（原位杂交）（原位杂交）of 4-cell stage embryos.第45页，讲稿共75张，创作于星期日“沉默沉默”是是金金Fire与与Mello

45、获获2006年诺贝尔年诺贝尔奖奖第46页，讲稿共75张，创作于星期日在在19991999年一年内年一年内,发现发现RNARNA干扰现象广泛存在于植物、真菌、干扰现象广泛存在于植物、真菌、线虫、昆虫、蛙类、鸟类、大鼠、小鼠、猴一直到人类的几线虫、昆虫、蛙类、鸟类、大鼠、小鼠、猴一直到人类的几乎所有的真核生物细胞中。乎所有的真核生物细胞中。20002000年，又先后发现小鼠早期胚年，又先后发现小鼠早期胚胎中和大肠杆菌中也存在胎中和大肠杆菌中也存在RNARNA干扰现象。干扰现象。20002000年提出年提出RNAiRNAi作用机制模型。作用机制模型。Hannond SM et al.Nature,2

46、000,404(6775):293-296Zamore PD.Cell,2000,101(1):25-3320012001年，年，RNAiRNAi技术成功诱导培养的哺乳动物细胞基因沉默现象。技术成功诱导培养的哺乳动物细胞基因沉默现象。NatureNature，20012001，411411（68366836）：）：494494498498RNAiRNAi技术被技术被ScienceScience评为评为20012001年度的十大科技进展之一。年度的十大科技进展之一。第47页，讲稿共75张，创作于星期日20022002年年5 5月，月，Lindenbach(Lindenbach(美美),),双链双

47、链RNARNA艾滋病艾滋病病毒病毒细胞细胞减少艾滋病病毒基因表达减少艾滋病病毒基因表达90%90%以上。以上。20022002年年7 7月月,Novina,Novina等用等用RNAiRNAi技术实现了技术实现了HIV1HIV1病毒病毒的阻抑。的阻抑。20022002年年7 7月月,McCaffrey(McCaffrey(美美)等等人人,双双链链RNA+RNA+肝肝炎炎病病毒毒-标标志志基基因因鼠鼠肝肝脏脏抑抑制制标标志志基基因因的的表表达达/肝炎病毒基因的表达。肝炎病毒基因的表达。利用利用RNAiRNAi可以直接和有效地起到抗病毒的作用。可以直接和有效地起到抗病毒的作用。第48页，讲稿共75

48、张，创作于星期日共共共共 抑抑抑抑 制制制制、基基基基 因因因因 压压压压 制制制制 和和和和RNAiRNAidsRNAdsRNA降降降降 解解解解 靶靶靶靶mRNAmRNA抑制靶基因的表达。均属于抑制靶基因的表达。均属于抑制靶基因的表达。均属于抑制靶基因的表达。均属于PTGSPTGS！dsRNAdsRNA导导导导 入入入入 线线线线 虫虫虫虫RNAi RNAi；dsRNAdsRNA注注注注 射射射射线线线线 虫虫虫虫 体体体体 腔腔腔腔RNAi RNAi；dsRNAdsRNA浸浸浸浸润润润润线线线线虫虫虫虫/dsRNA/dsRNA的的的的工工工工程程程程菌菌菌菌喂喂喂喂养养养养线线线线虫虫虫

49、虫RNAiRNAi。dsRNAdsRNA导导导导入入入入植植植植物物物物RNAiRNAi；同同同同样样样样，dsRNAdsRNA注注注注射射射射植植植植物物物物韧韧韧韧皮皮皮皮部部部部RNAiRNAi；吸吸吸吸附附附附500bp500bp基基基基因因因因片片片片段段段段的的的的金金金金属属属属片片片片插插插插入入入入植植植植物物物物侵侵侵侵入点组织发生入点组织发生入点组织发生入点组织发生RNAiRNAi。RNAiRNAi普普普普遍遍遍遍存存存存在在在在于于于于各各各各种种种种生生生生物物物物中中中中,具具具具有有有有抗抗抗抗病病病病毒毒毒毒、稳稳稳稳定定定定转转转转座座座座子子子子及及及及监监

50、监监控异常表达控异常表达控异常表达控异常表达mRNAmRNA的生物学功能。的生物学功能。的生物学功能。的生物学功能。第49页，讲稿共75张，创作于星期日（三）、（三）、RNARNA干扰的机制干扰的机制 dsRNA：双链：双链RNA，包含正义链和反义链。，包含正义链和反义链。Dicer：属属于于RNase 家家族族的的一一员员，是是dsRNA的的特特异异性性核核酸酸内内切切酶酶，能能以以一一种种ATP依依赖赖的的方方式式逐逐步步切切割割由由外外源源导导入入或或者者由由转转基基因因、病病毒毒感感染染等等各各种种方方式式引引入入的的双双链链RNA。siRNA(small interfering RN