基因诊断与基因治疗讲稿.ppt

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1、基因诊断与基因治疗第一页，讲稿共四十七页哦基因变异致病类型基因变异致病类型内源基因的变异内源基因的变异 由于先天遗传背景的差异和后天内、外环境的影响，由于先天遗传背景的差异和后天内、外环境的影响，人类的基因结构及其表达的各个环节都可能发生异常，人类的基因结构及其表达的各个环节都可能发生异常，从而导致疾病。从而导致疾病。外源基因的入侵外源基因的入侵 如各种病原体感染人体后，其特异的基因被带入人如各种病原体感染人体后，其特异的基因被带入人体并在体内增殖而引起各种疾病。体并在体内增殖而引起各种疾病。第二页，讲稿共四十七页哦第一节第一节基因诊断基因诊断Gene Diagnosis第三页，讲稿共四十七页

2、哦 一、基因诊断的概念、内容和特点一、基因诊断的概念、内容和特点定义定义:利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，直接检测直接检测基因结构基因结构及其及其表达水平表达水平是否正常，从而对疾病是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。作出诊断的方法。前提条件：前提条件：已明确疾病表型与基因型的关系。已明确疾病表型与基因型的关系。第四页，讲稿共四十七页哦基因诊断的基本内容基因诊断的基本内容n检测个体基因序列特征检测个体基因序列特征n基因突变分析基因突变分析n测定基因拷贝数测定基因拷贝数n基因表达产物分析基因表达产物分析n测定是否存在外源基因测定是否存在外源

3、基因第五页，讲稿共四十七页哦 特点特点:1.1.以基因作为检查材料和探查目标，属于以基因作为检查材料和探查目标，属于“病因诊病因诊 断断”，针对性强。针对性强。2.2.分子杂交技术选用特定基因序列作为探针，故具有很分子杂交技术选用特定基因序列作为探针，故具有很高的特异性。高的特异性。3.3.由于分子杂交和聚合酶链反应（由于分子杂交和聚合酶链反应（PCRPCR）技术都具有放大效）技术都具有放大效应，故诊断灵敏度很高。应，故诊断灵敏度很高。4 4.适用性强，诊断范围广。适用性强，诊断范围广。5.5.检测外源基因时，可以检测出潜伏的病原体。检测外源基因时，可以检测出潜伏的病原体。第六页，讲稿共四十七

4、页哦基因变异致病类型基因变异致病类型内源基因的变异内源基因的变异 由于先天遗传背景的差异和后天内、外环境的影响，人类由于先天遗传背景的差异和后天内、外环境的影响，人类的基因结构及其表达的各个环节都可能发生异常，从而导致的基因结构及其表达的各个环节都可能发生异常，从而导致疾病。疾病。外源基因的入侵外源基因的入侵 如各种病原体感染人体后，其特异的基因被带入人体并如各种病原体感染人体后，其特异的基因被带入人体并在体内增殖而引起各种疾病。在体内增殖而引起各种疾病。第七页，讲稿共四十七页哦二、基因诊断常用技术方法二、基因诊断常用技术方法n限制性内切酶谱分析法限制性内切酶谱分析法nDNA限制性长度多态性限

5、制性长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RLFP)分析分析 n等位基因特异寡核苷酸探针等位基因特异寡核苷酸探针(allele specific oligonucleotide,ASO)（一）核酸分子杂交技术（一）核酸分子杂交技术第八页，讲稿共四十七页哦Mst酶切位点酶切位点(GCTNAGG)53正常基因正常基因53突变基因突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组的镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析限制性酶切分析第九页，讲稿共四十七页哦+0.2kb1.15kb1.35kb正常人正常人突变携带着突变携带着患者患者镰状红

6、细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析第十页，讲稿共四十七页哦 在人类基因组中，平均约在人类基因组中，平均约200200对碱基可发生一对变异，中对碱基可发生一对变异，中性变异导致个体间核苷酸序列的差异，称为性变异导致个体间核苷酸序列的差异，称为DNADNA多态性多态性。不少不少DNADNA多态性发生在限制性内切酶识别位点上，酶解多态性发生在限制性内切酶识别位点上，酶解该该DNADNA片段就会产生长度不的片段，称为片段就会产生长度不的片段，称为限制性片段长度多限制性片段长度多态性态性。在某一特定家族中，如果某一致病基因与特异。在某一特定家族中，如果某一致病基因

7、与特异的多态性片段紧密连锁，就可利用这一多态性片段作的多态性片段紧密连锁，就可利用这一多态性片段作为一种为一种“遗传标志遗传标志”，来判断家庭成员或胎儿是否为，来判断家庭成员或胎儿是否为致病基因的携带者。致病基因的携带者。DNADNA限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（RFLPRFLP）第十一页，讲稿共四十七页哦RLFP分析法分析法第十二页，讲稿共四十七页哦第十三页，讲稿共四十七页哦（二）聚合酶链反应（二）聚合酶链反应 (PCR)PCR/单链构象多态性分析单链构象多态性分析(single strand conformation polymorphism,SSCP)PCR产物变性后，经聚

8、丙烯酰胺凝胶电泳，正常基因产物变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常基因和变异基因的迁移位置不同，借此可分析确定致病基因的和变异基因的迁移位置不同，借此可分析确定致病基因的存在。存在。第十四页，讲稿共四十七页哦正常人正常人纯合突变纯合突变杂合突变杂合突变Leber 病患者病患者 PCR/SSCP分析分析+第十五页，讲稿共四十七页哦PCR/等位基因特异寡核苷酸探针等位基因特异寡核苷酸探针(allele specific oligonucleotide，ASO)第十六页，讲稿共四十七页哦（三）基因测序（三）基因测序即测定即测定DNADNA序列的技术。分离患者的有关基因，测序列的技术。分离患者的有关基因

9、，测定出碱基排列顺序，找出其变异所在，是最确切的定出碱基排列顺序，找出其变异所在，是最确切的基因检测方法。基因检测方法。目前用于测序的技术主要有目前用于测序的技术主要有SangerSanger等发明的双脱氧链等发明的双脱氧链末端终止法和末端终止法和 MaxamMaxam和和 GilbertGilbert发明的化学降解法。发明的化学降解法。第十七页，讲稿共四十七页哦（四）基因芯片（四）基因芯片 基因芯片基因芯片(gene chip)(gene chip)（又称（又称DNADNA芯片、生物芯片）通过芯片、生物芯片）通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的与一组已知序列的核酸探针杂交进行核

10、酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的方法，在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列与基因芯片探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。针序列。据此可重组出靶核酸的序列。应用领域应用领域:基因表达谱分析、基因突变及多态性分析、基因基因表达谱分析、基因突变及多态性分析、基因组文库作图、疾病诊断和预测、药物筛选、基因测序等组

11、文库作图、疾病诊断和预测、药物筛选、基因测序等。第十八页，讲稿共四十七页哦三、基因诊断的应用三、基因诊断的应用n遗传性疾病遗传性疾病n肿瘤肿瘤n感染性疾病，传染性流行病感染性疾病，传染性流行病n判断个体疾病易感性判断个体疾病易感性n器官移植组织配型器官移植组织配型n法医学中个体识别、亲子鉴定法医学中个体识别、亲子鉴定第十九页，讲稿共四十七页哦第二节第二节 基因治疗基因治疗Gene TherapyGene Therapy第二十页，讲稿共四十七页哦定义定义早期早期是指是指将外源正常基因导入靶细胞，将外源正常基因导入靶细胞，整合入细胞基因组，整合入细胞基因组，纠正或补偿因基因缺陷和异纠正或补偿因基因

12、缺陷和异纠正或补偿因基因缺陷和异纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病以达到治疗的目常引起的疾病以达到治疗的目常引起的疾病以达到治疗的目常引起的疾病以达到治疗的目的一种治疗方法。的一种治疗方法。目前目前广义上来讲是指将某种遗传物质转移广义上来讲是指将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法。治疗疾病目的的方法。通过基因水平的操作而通过基因水平的操作而治疗疾病的治疗疾病的方法。方法。一、基因治疗的概念一、基因治疗的概念第二十一页，讲稿共四十七页哦1 1、基因修正、基因修正（gene correctiongene correc

13、tion）2 2、基因替代（置换）、基因替代（置换）（gene replacementgene replacement）3 3、基因增强（补偿）、基因增强（补偿）（gene augmentationgene augmentation）4 4、基因抑制、基因抑制（gene constraintgene constraint）和和/或或 基因失活基因失活（gene inactivationgene inactivation）5 5、免疫基因治疗、免疫基因治疗6 6、活化前体药物基因（自杀基因）治疗、活化前体药物基因（自杀基因）治疗7 7、耐药基因治疗、耐药基因治疗二、基因治疗的策略二、基因治疗的策

14、略第二十二页，讲稿共四十七页哦三、基因治疗的种类三、基因治疗的种类1 1、生殖细胞（、生殖细胞（germ cellgerm cell）基因治疗）基因治疗理论上将正常细胞基因转移到患者的生殖细胞理论上将正常细胞基因转移到患者的生殖细胞（精细胞，卵细胞早期胚胎）使其发育成正常个（精细胞，卵细胞早期胚胎）使其发育成正常个体。这是理想的治疗方法，从根本上治疗遗传病，体。这是理想的治疗方法，从根本上治疗遗传病，使其有害基因不能在人群中播散。使其有害基因不能在人群中播散。2 2、体细胞（、体细胞（somatic cellsomatic cell）基因治疗）基因治疗是指将正常基因转移到体细胞，使之表达基因是

15、指将正常基因转移到体细胞，使之表达基因产物，以达到治疗的目的。但有害基因能遗传产物，以达到治疗的目的。但有害基因能遗传给后代。给后代。第二十三页，讲稿共四十七页哦 四、基因治疗方式四、基因治疗方式一、体内疗法一、体内疗法（in vivoin vivo、一步法）、一步法）将携带有治疗基因的载体直接导入体内有关的组织器将携带有治疗基因的载体直接导入体内有关的组织器官，使其进入相应的组织并进行表达。官，使其进入相应的组织并进行表达。二、体外疗法二、体外疗法（ex vivoex vivo、二步法）、二步法）先把待接收基因的靶细胞从体内取出，将携带有治先把待接收基因的靶细胞从体内取出，将携带有治疗作用的

16、载体导入培养细胞内，筛选、增殖，再回疗作用的载体导入培养细胞内，筛选、增殖，再回输体内有关组织中。输体内有关组织中。第二十四页，讲稿共四十七页哦目的基因目的基因+载体载体重组重组DNADNA受体细胞受体细胞外源基因表达的筛选外源基因表达的筛选回输体内回输体内五、基因治疗的基本程序五、基因治疗的基本程序第二十五页，讲稿共四十七页哦1 1、为致病基因、为致病基因2 2、遗传分子机制清楚、遗传分子机制清楚3 3、该基因已被克隆，一级结构和表达调控机、该基因已被克隆，一级结构和表达调控机 制制清楚清楚4 4、可在体外操作，而且安全有效、可在体外操作，而且安全有效5 5、转移基因能完整地、稳定地整合，并

17、能适时适、转移基因能完整地、稳定地整合，并能适时适量表达量表达（一）目的基因的选择原则（一）目的基因的选择原则第二十六页，讲稿共四十七页哦 1 1、基因组、基因组DNADNA文库文库 2 2、cDNAcDNA（complementary DNAcomplementary DNA）3 3、人工合成基因片段、人工合成基因片段 4 4、PCRPCR扩增扩增 目的基因的来源目的基因的来源第二十七页，讲稿共四十七页哦（二）受体细胞的选择原则（二）受体细胞的选择原则1 1、最好选择组织特异性细胞、最好选择组织特异性细胞2 2、容易取出、容易取出3 3、具有较长的寿命、具有较长的寿命4 4、离体细胞能高效导

18、入目的基因、离体细胞能高效导入目的基因5 5、经体外操作后能存活并安全回输、经体外操作后能存活并安全回输常用的的受体细胞：常用的的受体细胞：淋巴细胞、造血干细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、淋巴细胞、造血干细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、骨骼肌细胞、血管内皮细胞、呼吸道上皮细胞、骨骼肌细胞、血管内皮细胞、呼吸道上皮细胞、肿瘤细胞。肿瘤细胞。第二十八页，讲稿共四十七页哦（三）载体的选择和外源基因的导入（三）载体的选择和外源基因的导入 病毒载体病毒载体 RNARNA病毒载体病毒载体（逆转录病毒）（逆转录病毒）DNADNA病毒：病毒：常用的有腺病毒、疱疹病毒、常用的有腺病毒、疱疹病毒、SV40SV40病毒

19、、巨细胞病毒、病毒、巨细胞病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒等腺相关病毒、单纯疱疹病毒等 非病毒载体非病毒载体 质粒、脂质体、受体介导的蛋白质粒、脂质体、受体介导的蛋白第二十九页，讲稿共四十七页哦 目前应用最多的最成功的是逆转录病毒，病毒感染细目前应用最多的最成功的是逆转录病毒，病毒感染细胞后，其基因组胞后，其基因组RNA RNA 经逆转录产生双链经逆转录产生双链DNADNA拷贝，插入拷贝，插入宿主染色体形成前病毒（宿主染色体形成前病毒（provirusprovirus），前病毒转录产生的），前病毒转录产生的正链既是病毒正链既是病毒RNARNA，再与前病毒编码的外壳蛋白包装成，再与前病毒编码的外壳

20、蛋白包装成新的病毒颗粒。新的病毒颗粒。完整的病毒颗粒具有插入宿主染色体必需的全套酶系统，完整的病毒颗粒具有插入宿主染色体必需的全套酶系统，适用于介导基因转移。适用于介导基因转移。逆转录病毒（逆转录病毒（retrovirusretrovirus）第三十页，讲稿共四十七页哦第三十一页，讲稿共四十七页哦第三十二页，讲稿共四十七页哦第三十三页，讲稿共四十七页哦第三十四页，讲稿共四十七页哦1 1、主要来自莫洛尼氏小鼠白血病病毒、主要来自莫洛尼氏小鼠白血病病毒（Moloney Moloney murine leukemia virusmurine leukemia virus，MoMLVMoMLV）其中三

21、个结构基因其中三个结构基因（gaggag、polpol、envenv）被删除）被删除2 2、标记基因（、标记基因（marker genemarker gene）插入空缺，供阳性选择）插入空缺，供阳性选择用。如：新霉素抗性基因（用。如：新霉素抗性基因（neomycin resistant geneneomycin resistant gene），），该基因编码新霉素磷酸转移酶该基因编码新霉素磷酸转移酶（NPTNPT），能对），能对抗新霉素（抗新霉素（G418G418）。）。3 3、有目的基因的插入位点、有目的基因的插入位点逆转录病毒载体的构建逆转录病毒载体的构建第三十五页，讲稿共四十七页哦逆转录

22、病毒载体的优点逆转录病毒载体的优点1.1.可插入足够长的外源可插入足够长的外源DNADNA（7KB7KB）2.2.基因转移效率高，几达基因转移效率高，几达100%100%3.3.重组体可整合入宿主染色体，并稳定表达和传代重组体可整合入宿主染色体，并稳定表达和传代4.4.宿主范围广、比较安全宿主范围广、比较安全缺点缺点1.1.只能整合入分裂活跃的细胞只能整合入分裂活跃的细胞2.2.靶细胞表面需要有特殊的受体靶细胞表面需要有特殊的受体3.3.必须使用带有必须使用带有“辅助病毒辅助病毒”的包装细胞系的包装细胞系4.4.病毒滴度低病毒滴度低第三十六页，讲稿共四十七页哦包装细胞：包装细胞：一种细胞，重组

23、逆转录病毒载体只能在其一种细胞，重组逆转录病毒载体只能在其中包装成没有感染能力的病毒颗粒，但能从中释放出去，中包装成没有感染能力的病毒颗粒，但能从中释放出去，这种细胞即包装细胞。这种细胞即包装细胞。1.1.多数由各种辅助病毒转染小鼠成纤维细胞系多数由各种辅助病毒转染小鼠成纤维细胞系 NTH3T3NTH3T3构构成。成。2.2.辅助病毒由辅助病毒由MoMLVMoMLV切除了病毒切除了病毒5 5端端LTRLTR至至GagGag起始密码起始密码之间包装信号之间包装信号 等序列，虽能产生病毒蛋白但不能进行包等序列，虽能产生病毒蛋白但不能进行包装。装。3.3.导入的逆转录病毒载体转录出的导入的逆转录病毒

24、载体转录出的RNARNA可以利用辅助病可以利用辅助病毒产生的病毒蛋白包装成假病毒颗粒。毒产生的病毒蛋白包装成假病毒颗粒。包装细胞系包装细胞系第三十七页，讲稿共四十七页哦第三十八页，讲稿共四十七页哦 （四）外源基因表达的筛选（四）外源基因表达的筛选 在较多的表达载体中都有在较多的表达载体中都有neoneor r标记基因存在，若向培标记基因存在，若向培养基中加入药物养基中加入药物G418G418，未被转化的细胞不存在，未被转化的细胞不存在neoneor r标记基因，细胞不能存活，最后只有转化细胞存活下标记基因，细胞不能存活，最后只有转化细胞存活下来。来。（五）（五）回输体内回输体内第三十九页，讲稿

25、共四十七页哦1.1.选择合适的疾病：单基因遗传病选择合适的疾病：单基因遗传病2.2.具备该病分子缺陷的知识具备该病分子缺陷的知识3.3.有目的基因的克隆有目的基因的克隆4.4.克隆基因的有效表达克隆基因的有效表达5.5.克隆基因的有效调节克隆基因的有效调节6.6.可利用的动物模型可利用的动物模型遗传病基因治疗的必要条件遗传病基因治疗的必要条件四、基因治疗的应用四、基因治疗的应用（一）遗传病的基因治疗（一）遗传病的基因治疗第四十页，讲稿共四十七页哦基因治疗的部分对象基因治疗的部分对象1.1.严重联合免疫缺陷症（腺苷脱氨酶严重联合免疫缺陷症（腺苷脱氨酶ADAADA缺乏）缺乏）2.2.囊性纤维变性囊

26、性纤维变性3.Gaucher3.Gaucher病病型（葡糖脑苷脂酶缺陷）型（葡糖脑苷脂酶缺陷）4.4.苯丙酮酸尿症（苯丙氨酸羟化酶缺陷）苯丙酮酸尿症（苯丙氨酸羟化酶缺陷）5.5.血友病血友病B B（凝血（凝血因子缺陷）因子缺陷）6.6.家族性高胆固醇血症家族性高胆固醇血症7.7.地中海贫血地中海贫血第四十一页，讲稿共四十七页哦1.1.宿主的修饰：宿主的修饰：保护分裂旺盛的正常组织，如造保护分裂旺盛的正常组织，如造血干细胞：导入血干细胞：导入二氢叶酸还原酶基因二氢叶酸还原酶基因，获得对，获得对氨氨甲蝶呤甲蝶呤的抗性的抗性2.2.增强肿瘤浸润淋巴细胞（增强肿瘤浸润淋巴细胞（TILTIL）活性：）活

27、性：如将肿瘤坏死因子（如将肿瘤坏死因子（TNFTNF）基因导入）基因导入TILTIL。这是。这是目前肿瘤基因治疗最常用的方法。目前肿瘤基因治疗最常用的方法。3.3.肿瘤细胞的修饰肿瘤细胞的修饰（二）肿瘤的基因治疗（二）肿瘤的基因治疗第四十二页，讲稿共四十七页哦如：如：自杀基因自杀基因 +病毒载体病毒载体 转染转染 重组载体重组载体 药物前体药物前体 (无毒无毒)GeneGene酶酶 药物复合物药物复合物(有毒有毒)细胞死亡第四十三页，讲稿共四十七页哦例如：例如：单纯疱疹病毒单纯疱疹病毒 哺乳动物细胞哺乳动物细胞 HSV Gene-TK （在肿瘤细胞中表达，正常细胞中不表达）（在肿瘤细胞中表达，

28、正常细胞中不表达）GeneTK GCV（胸苷类似物）（胸苷类似物）TdR P p GCV-p 抑制抑制DNA合成合成 脱氧胸苷酸脱氧胸苷酸 肿瘤细胞死亡肿瘤细胞死亡 邻近细胞死亡邻近细胞死亡/凋亡（旁观者效应）凋亡（旁观者效应）第四十四页，讲稿共四十七页哦（三）艾滋病的基因治疗（三）艾滋病的基因治疗（四）心血管疾病、神经系统疾病等（四）心血管疾病、神经系统疾病等 其它领域中的应用其它领域中的应用第四十五页，讲稿共四十七页哦1 1、基因治疗要获得成功，必须具备切实有效的、基因治疗要获得成功，必须具备切实有效的目的基因。目的基因。2 2、外源基因在人体内的、外源基因在人体内的表达调控表达调控存在一

29、定的问题，尽管存在一定的问题，尽管目前已有多种基因载体可供选择，但如何扬长避短，构建安目前已有多种基因载体可供选择，但如何扬长避短，构建安全、高效、靶向、可控的载体是亟待解决的问题。全、高效、靶向、可控的载体是亟待解决的问题。3 3、目前基因治疗的方案多数是采用、目前基因治疗的方案多数是采用ex vivoex vivo 方法，但受体方法，但受体细胞经体外长期培养和增殖后，细胞生物学特性是否细胞经体外长期培养和增殖后，细胞生物学特性是否改变也是值得研究的问题。改变也是值得研究的问题。4 4、要充分估计导入外源基因对机体的、要充分估计导入外源基因对机体的不利影响不利影响。第四十六页，讲稿共四十七页哦祝大家复习好第四十七页，讲稿共四十七页哦