重组dna导入受体细胞讲稿.ppt

《重组dna导入受体细胞讲稿.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《重组dna导入受体细胞讲稿.ppt（25页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、关于重组DNA导入受体细胞第一页，讲稿共二十五页哦转化转化转染转导接合转移1.重组体导入细菌细胞重组体导入细菌细胞（1）大肠杆菌）大肠杆菌重组质粒重组质粒DNA分子进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过分子进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称之为程称之为转化（转化（transformation)。转化不仅适合于大肠杆菌受体细胞，而且适合于枯草杆菌和蓝藻等其他原转化不仅适合于大肠杆菌受体细胞，而且适合于枯草杆菌和蓝藻等其他原核生物以及酵母等低等真核生物受体细胞。核生物以及酵母等低等真核生物受体细胞。化学诱导感受态法化学诱导感受态法 电转化电转化感受态细胞（感受态细胞（com

2、petence cell）是指处于能吸收周围环境中是指处于能吸收周围环境中DNA分子的分子的生理状态的细胞。生理状态的细胞。第二页，讲稿共二十五页哦I.化学诱导感受态法化学诱导感受态法 原理：原理：E.coli 细胞处于细胞处于0，CaCl2的低渗溶液中，细的低渗溶液中，细胞膨胀成球形，细胞膜形成液晶结构，转化混合物中胞膨胀成球形，细胞膜形成液晶结构，转化混合物中的的DNA形成抗形成抗DNase的羟基的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经表面，经42短时间热冲击处理，液晶结构被扰动而短时间热冲击处理，液晶结构被扰动而使细胞膜出现间隙，促使使细胞膜出现间隙，促使DNA复合物

3、进入细胞，在丰复合物进入细胞，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。培养基平板上，可选出所需的转化子。第三页，讲稿共二十五页哦 Ca Ca2+2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到处理的感受态细胞，其转化率一般能达到10106 610108 8转化转化子子/gDNAgDNA。化学法简单、快速、稳定、重复性好，感受态细菌可以在化学法简单、快速、稳定、重复性好，感受态细菌可以在-7070保存，但转化保存，但转化

4、DNADNA大小有限制，不同物种需要不同的大小有限制，不同物种需要不同的诱导方法。诱导方法。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R,M),(R,M),它可以它可以容忍外源容忍外源DNADNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。分子进入体内并稳定地遗传给后代。第四页，讲稿共二十五页哦培养大肠杆培养大肠杆菌菌OD600至至0.3-0.4On ice 5-10 min4离心收集菌离心收集菌用冰冷的用冰冷的60mMCaCl2重悬重悬4离心收集菌离心收集菌4离心收

5、集菌离心收集菌分装、分装、-70 冻存冻存用冰冷的用冰冷的60mMCaCl2重悬重悬On ice 30 min用冰冷的用冰冷的60mMCaCl2重悬重悬感受态细胞制备感受态细胞制备 制备感受态菌必须使用对数生长期的菌，且制备感受态菌必须使用对数生长期的菌，且必须在冰冷的条件下制备必须在冰冷的条件下制备。CaCl2处理充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。处理充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。储存感受态菌要在储存感受态菌要在-70以下，使用感受态菌时必须迅速融化，融化后一以下，使用感受态菌时必须迅速融化，融化后一般不能再次冻存使用般不能再次冻存使用第五页，讲稿共二十五页哦10ng质粒质粒DNA100 L

6、感受态菌感受态菌冰上混合，静冰上混合，静置置10分钟分钟42C 1分钟分钟冰浴冰浴2min，加，加入入1mL LB培养培养基基37摇摇1小时小时10-100 L转化液涂含转化液涂含抗菌素的平板抗菌素的平板吸附吸附DNA摄入摄入DNA转化过程转化过程第六页，讲稿共二十五页哦II.II.电转化电转化 可以转化大分子可以转化大分子DNADNA（50Kb)50Kb)，胞壁较厚的物种需要制备原生质体后，胞壁较厚的物种需要制备原生质体后电转化电转化电穿孔转化法最早用于将电穿孔转化法最早用于将DNA导入真核细胞，导入真核细胞，1988年，年，Dower等人成等人成功地应用该法进行了大肠杆菌的转化。功地应用该

7、法进行了大肠杆菌的转化。原理原理:利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔(electroporation),形成可逆的瞬间通道，从而促进外源形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的有效吸的有效吸收。收。电穿孔转化法的效率受电场强度、电脉冲时间和外源电穿孔转化法的效率受电场强度、电脉冲时间和外源DNA浓度等参数的影浓度等参数的影响，通过优化这些参数，每微克响，通过优化这些参数，每微克DNA可以得到可以得到1091010转化子。转化子。电压增高或电脉冲时间延长时，转化效率将会提高，但受体细胞电压增高或电脉冲时间延长时，转化效率将会提高，但受

8、体细胞存活率会降低。研究表明，当电场强度和脉冲时间的组合方式导存活率会降低。研究表明，当电场强度和脉冲时间的组合方式导致致50%70%细菌死亡时，转化效率达到最高。细菌死亡时，转化效率达到最高。第七页，讲稿共二十五页哦LB培养受体菌至培养受体菌至OD600=0.5-0.6冰浴冰浴15分钟，分钟，4离心集离心集菌菌冰冷的水重悬冰冷的水重悬菌体菌体4 离心集菌离心集菌冰冷的水重悬冰冷的水重悬菌体菌体4 离心收集离心收集菌体菌体少量冰冷的水重少量冰冷的水重悬悬细胞分装成细胞分装成50 L电转仪调为电转仪调为2.5kV,25 F脉冲控制器脉冲控制器200-400 0.5 g质粒质粒DNA混合、冰浴混合

9、、冰浴加入加入1mLSOC培养液培养液37C中速震荡中速震荡60分分钟钟涂布涂布转化转化细胞制备：细胞制备：电转化：电转化：第八页，讲稿共二十五页哦用于电穿孔转化法的细胞处理要比感受态细胞的制备要容易，当细菌生用于电穿孔转化法的细胞处理要比感受态细胞的制备要容易，当细菌生长到对数中期后予以冷却、离心，然后用长到对数中期后予以冷却、离心，然后用低盐缓冲液充分清洗低盐缓冲液充分清洗降低细降低细胞悬浮液的离子强度，并用胞悬浮液的离子强度，并用10%甘油重悬细胞，使其细胞浓度为甘油重悬细胞，使其细胞浓度为31010个个ml，分装，在干冰上速冻后置于，分装，在干冰上速冻后置于-70贮存。每小份细胞融贮存

10、。每小份细胞融解后即可用于转化，有效期达解后即可用于转化，有效期达6个月以上个月以上一般电穿孔转化须一般电穿孔转化须在低温下（在低温下（04）进行）进行，转化效率要比在室温下操，转化效率要比在室温下操作提高约作提高约100倍。倍。由于细菌细胞相对较小，因此与由于细菌细胞相对较小，因此与 DNA导入真核细胞时相比，大肠杆菌导入真核细胞时相比，大肠杆菌的电转化要求有更高的场强，而反应体积则相对要小，以的电转化要求有更高的场强，而反应体积则相对要小，以2040l为宜。为宜。第九页，讲稿共二十五页哦第十页，讲稿共二十五页哦第十一页，讲稿共二十五页哦（2）枯草芽孢杆菌）枯草芽孢杆菌 Spizzen Sp

11、izzen感受态转化感受态转化 原生质体转化原生质体转化 电转化电转化枯草芽孢杆菌可以形成自然感受态，在对数生长后期由信息素激枯草芽孢杆菌可以形成自然感受态，在对数生长后期由信息素激发一种二元信号传导系统的调节，激活一系列感受态相关基因的发一种二元信号传导系统的调节，激活一系列感受态相关基因的表达。表达。Spizzen Spizzen 在在19581958年发现这一现象并发展了感受态转化的方法年发现这一现象并发展了感受态转化的方法.基本步骤：基本步骤：细胞在较为丰富的培养基中培养至对数生长后期，然后细胞在较为丰富的培养基中培养至对数生长后期，然后转接到营养贫瘠的培养基中，可使其形成感受态（一般

12、非常短暂）转接到营养贫瘠的培养基中，可使其形成感受态（一般非常短暂）I.SpizzenI.Spizzen感受态转化感受态转化第十二页，讲稿共二十五页哦在枯草芽孢杆菌中，转化的过程包括外源在枯草芽孢杆菌中，转化的过程包括外源DNA的吸附、断裂、吸收降解和重组（或的吸附、断裂、吸收降解和重组（或形成独立的复制单元，如质粒）几个阶段：形成独立的复制单元，如质粒）几个阶段：吸附：吸附：这一过程发生在感受态细胞的表面，是一个非共价结合的过程。在枯草芽孢这一过程发生在感受态细胞的表面，是一个非共价结合的过程。在枯草芽孢杆菌的感受态细胞表面平均约有杆菌的感受态细胞表面平均约有50个个DNA吸附位点，这些位点

13、对双链吸附位点，这些位点对双链DNA有非常大的亲有非常大的亲和力和力双链双链DNA的断裂的断裂：在吸附发生后的：在吸附发生后的30秒内，秒内，DNA被核酸酶随机断裂，其平均长被核酸酶随机断裂，其平均长度约为度约为7kb。DNA的降解和吸收：的降解和吸收：在断裂发生之后，双链在断裂发生之后，双链DNA的一条链被完全降解，另一的一条链被完全降解，另一条链穿过细胞壁和细胞膜后进入胞内。条链穿过细胞壁和细胞膜后进入胞内。合成双链并环化：合成双链并环化：变成双链后依靠同源区环化。自身无同源区段（重复序列）的变成双链后依靠同源区环化。自身无同源区段（重复序列）的DNA，转化效率极低。对于质粒单体，需要体外

14、酶切、连接成质粒多聚体才能高效转化。，转化效率极低。对于质粒单体，需要体外酶切、连接成质粒多聚体才能高效转化。103105个个/g DNA缺点：缺点：对于生长差别较大的菌株需要重新确定转接培养时间；酶切后质粒无法转化。对于生长差别较大的菌株需要重新确定转接培养时间；酶切后质粒无法转化。由于需要借助同源重组来重新环化质粒，对于由于需要借助同源重组来重新环化质粒，对于recArecA缺陷菌株转化效率非常低缺陷菌株转化效率非常低第十三页，讲稿共二十五页哦 原理：用溶菌酶等处理消化部分细胞壁，制备原生质体，在原理：用溶菌酶等处理消化部分细胞壁，制备原生质体，在PEP(聚乙二醇）等促溶剂作用下使细胞膜形

15、成小孔，胞外聚乙二醇）等促溶剂作用下使细胞膜形成小孔，胞外DNA通过小通过小孔进入胞内孔进入胞内,然后在再生培养基上筛选转化子。然后在再生培养基上筛选转化子。II.原生质体转化原生质体转化 优点：优点：不需要质粒有自身同源区，因此对于单体质粒的转化效率也很高（不需要质粒有自身同源区，因此对于单体质粒的转化效率也很高（106个个/微克微克DNA）缺点：缺点：转化效率随质粒分子量变大而减小；部分抗生素在再生培养基失去筛选转化效率随质粒分子量变大而减小；部分抗生素在再生培养基失去筛选作用（例如卡那霉素在作用（例如卡那霉素在DM3培养基中无效）培养基中无效）不适用于革兰氏阴性菌不适用于革兰氏阴性菌II

16、I.电转化电转化 原理、步骤和大肠杆菌电转化一样，但转化效率很低原理、步骤和大肠杆菌电转化一样，但转化效率很低(106个个/微克微克DNA)第十四页，讲稿共二十五页哦2.酵母菌的转化方法酵母菌的转化方法（1）原生质体转化法）原生质体转化法 早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质球转化法。早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质球转化法。在在Ca2+和和PEG的存在下，转化细胞可达存活的原生质球总数的的存在下，转化细胞可达存活的原生质球总数的1%-5%。但是操作周期长（再生需。但是操作周期长（再生需46天），而且转化效率受天），而且转化效率受到原生质再生率的严重制约。到原生质再

17、生率的严重制约。酵母原生质转化法一个显著特点是，一个受体细胞可同时酵母原生质转化法一个显著特点是，一个受体细胞可同时接纳多个质粒分子，而且这种共转化的原生质占转化子总数接纳多个质粒分子，而且这种共转化的原生质占转化子总数的的25%-33%。酵母酵母原生质体原生质体感受态感受态酶去壁酶去壁CaCl2、PEG插入外源基因插入外源基因的酵母载体的酵母载体PEG（聚乙二醇）（聚乙二醇）CaCl2使细胞壁具有使细胞壁具有通透性，允许通透性，允许DNA进入。进入。转化转化第十五页，讲稿共二十五页哦（2）碱金属离子介导的酵母菌转化）碱金属离子介导的酵母菌转化 酿酒酵母经碱金属离子（如酿酒酵母经碱金属离子（如

18、Li+等）、等）、PEG热休克处理后，也可高热休克处理后，也可高效吸收质粒效吸收质粒DNA，而且具有以下特性：，而且具有以下特性：吸收线性吸收线性DNA的能力明显大于环状的能力明显大于环状DNA，二者相差，二者相差80倍倍,共转化现象共转化现象较为罕见。较为罕见。（3）电转化法）电转化法 酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒DNA，但在此，但在此过程中应避免使用过程中应避免使用PEG，它对受电击的细胞具有较大的负作用。其优势，它对受电击的细胞具有较大的负作用。其优势在于不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件，适用范围广，而且转化在于不依

19、赖于受体细胞的遗传特征及培养条件，适用范围广，而且转化率高达率高达105转化子转化子/gDNA。酵母酵母0.1mol/L LiCl处理处理插入外源基因的酵母载体插入外源基因的酵母载体感受态感受态40%PEG 4000第十六页，讲稿共二十五页哦其他导入技术：其他导入技术：接合转移接合转移在质粒转移过程中，利用供体细胞可与受体细胞发生接合作用而将在质粒转移过程中，利用供体细胞可与受体细胞发生接合作用而将质粒导入受体细胞的方法，供体细胞和受体细胞可以为不同微生物：质粒导入受体细胞的方法，供体细胞和受体细胞可以为不同微生物：例如大肠杆菌和链霉菌例如大肠杆菌和链霉菌供体细胞含有辅助质粒，辅助质粒为可转移

20、的接供体细胞含有辅助质粒，辅助质粒为可转移的接合型质粒，含有与接合转移有关的基因（合型质粒，含有与接合转移有关的基因（tratra），），这类质粒一般也是广宿主质粒。这类质粒一般也是广宿主质粒。而重组质粒一般不含而重组质粒一般不含tratra基因，但有基因，但有bombom基因，可以基因，可以被诱动转移；一般是穿梭载体，保证在供体菌被诱动转移；一般是穿梭载体，保证在供体菌（E.coliE.coli）和受体菌（例如根瘤菌或链霉菌）中均）和受体菌（例如根瘤菌或链霉菌）中均能复制。能复制。将含辅助质粒的细胞、含重组质粒的供体细将含辅助质粒的细胞、含重组质粒的供体细胞与受体细胞三者共同培养，便可实现重

21、组胞与受体细胞三者共同培养，便可实现重组质粒导入受体细胞，称为质粒导入受体细胞，称为三亲杂交接合转移三亲杂交接合转移第十七页，讲稿共二十五页哦三亲杂交接合转移三亲杂交接合转移重组质粒从大肠杆菌转重组质粒从大肠杆菌转移到土壤农杆菌移到土壤农杆菌第十八页，讲稿共二十五页哦叶盘叶盘消毒消毒切取切取土壤农杆土壤农杆菌浸泡菌浸泡看护培养基看护培养基愈伤组织愈伤组织分化幼苗分化幼苗3.导入植物细胞导入植物细胞（1）叶盘法（叶盘法（leaf disk)第十九页，讲稿共二十五页哦植物细胞植物细胞原生质体原生质体纤维素酶和纤维素酶和果胶酶果胶酶DNA混合入电击缓冲混合入电击缓冲液液1-2kV,3-25 F电击电

22、击愈伤组织愈伤组织幼苗幼苗分化分化（2）.电击法（电击法（electroporation)第二十页，讲稿共二十五页哦又称又称高速微型子弹射击法（高速微型子弹射击法（High-velocity microprojectiles)以冷压缩气体为动力将吸附以冷压缩气体为动力将吸附DNA的金属微粒打入细胞内，完成基的金属微粒打入细胞内，完成基因转移，适合各种细胞（微生物、动植物）。因转移，适合各种细胞（微生物、动植物）。快速、简便、安全、高效。还可以导入细胞（如内生菌）、蛋白、细胞快速、简便、安全、高效。还可以导入细胞（如内生菌）、蛋白、细胞器、细胞核等。器、细胞核等。DNA1.2 m钨弹头钨弹头吸附

23、吸附特制手枪特制手枪射击植物射击植物装入装入（3）.基因枪法（基因枪法（gene gun）第二十一页，讲稿共二十五页哦原理（略）原理（略）4.导入动物细胞导入动物细胞（1）.磷酸钙沉淀法磷酸钙沉淀法在磷酸钙在磷酸钙-DNA沉淀物中，两种物理上毫无联系的沉淀物中，两种物理上毫无联系的DNA分子混合分子混合物往往能侵染同一个细胞物往往能侵染同一个细胞该方法经常用于两种该方法经常用于两种DNA同时转化一个宿主细胞的过程同时转化一个宿主细胞的过程(也称为共转也称为共转化）化）。在基因工程实验中。在基因工程实验中,时常需要用没有选择表型的质粒作转化时常需要用没有选择表型的质粒作转化,然后在宿主菌中筛选出

24、这种质粒。这时可采用有选择标记的另然后在宿主菌中筛选出这种质粒。这时可采用有选择标记的另一质粒与之共转化一质粒与之共转化,通过后者进行筛选。这项技术常用于哺乳类细通过后者进行筛选。这项技术常用于哺乳类细胞的实验，效率高达胞的实验，效率高达15%。第二十二页，讲稿共二十五页哦脂质体有商业试剂盒（如脂质体有商业试剂盒（如Life Technologies）。）。（2）.脂质体（脂质体（lipofectin）载体法）载体法利用脂类包埋利用脂类包埋DNA，通过脂类和细胞膜的融合，将，通过脂类和细胞膜的融合，将DNA导入细胞。导入细胞。可使用特殊的被修饰可使用特殊的被修饰的脂质体（糖基化、的脂质体（糖基化、抗体），特异性的和抗体），特异性的和靶细胞融合。靶细胞融合。效率较低：效率较低：1%第二十三页，讲稿共二十五页哦利用利用显微注射仪显微注射仪直接把直接把DNA注射到宿主细胞或细胞核里，使其整合到注射到宿主细胞或细胞核里，使其整合到染色体上。染色体上。一般细胞一端被微吸管固定，从另一端注入一般细胞一端被微吸管固定，从另一端注入DNA（10pl)（3）.显微注射法显微注射法(microinjection)第二十四页，讲稿共二十五页哦感感谢谢大大家家观观看看第二十五页，讲稿共二十五页哦