高效液相色谱HPLC基本原理精选PPT讲稿.ppt

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1、关于高效液相色谱HPLC基本原理第一页，讲稿共四十七页哦1）高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较高高速速：HPLC采采用用高高压压输输液液设设备备，流流速速大大增增加加，分分析析速速度度极极快快，只只需需数数分分钟钟；而而经经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。高高效效：填填充充物物颗颗粒粒极极细细且且规规则则，固固定定相相涂涂渍渍均均匀匀、传传质质阻阻力力小小，因因而而柱柱效效很很高高。可可以以在在数数分分钟钟内完成数百种物质的分离。内完成数百种物质的分离。高灵敏度：高灵敏度：检测器灵敏度极高：检测器灵敏度极

2、高：UV10-9g,荧光检测器荧光检测器10-11g。2）HPLC与与GC的比较的比较分分析析对对象象及及范范围围：GC分分析析只只限限于于气气体体和和低低沸沸点点的的稳稳定定化化合合物物，而而这这些些物物质质只只点点有有机机物物总总数数的的20%；HPLC可可以以分分析析高高沸沸点点、高高分分子子量量的的稳稳定定或或不不稳稳定定化化合合物物，这这类类物质占有机物总数的物质占有机物总数的80%。流流动动相相的的选选择择：GC采采用用的的流流动动相相中中为为有有限限的的几几种种“惰惰性性”气气体体，只只起起运运载载作作用用，对对组组分分作作用用小小；HPLC采采用用的的流流动动相相为为液液体体或

3、或各各种种液液体体的的混混合合，可可供供选选择择的的机机会会多多。它它除除了了起起运运载载作作用用外外，还还可可与与组组分分作作用用，并并与与固固定定相相对对组组分分的的作作用用产产生生竞竞争争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。操作温度：操作温度：GC需高温；需高温；HPLC通常在室温下进行。通常在室温下进行。第二页，讲稿共四十七页哦极性增加极性增加不溶于水不溶于水溶于水溶于水非极性非极性离子离子非离子极性非离子极性吸附吸附反向分配反向分配分配分配正向分配正向分配离子交换离子交换尺寸排阻尺寸排阻凝胶渗透凝胶渗透凝胶过滤

4、凝胶过滤分分子子量量3）应用应用 由由于于HPLC分分离离分分析析的的高高灵灵敏敏度度、定定量量的的准准确确性性、适适于于非非挥挥发发性性和和热热不不稳稳定定组组分分的的分分析析，因因此此，在在工工业业、科科学学研研究究，尤尤其其是是在在生生物物学学和和医医学学等等方方面面应应用用极极为为广广泛泛。如如氨氨基基酸酸、蛋蛋白白质质、核核酸酸、烃烃、碳碳水水化化合合物物、药药品品、多多糖糖、高高聚聚物物、农农药药、抗抗生生素素、胆胆固固醇醇、金金属属有有机机物物等等分分析析，大多是通过大多是通过HPLC来完成的。来完成的。右右图图是是各各种种HPLC方方法法的的应应用用范范围围及对象及对象第三页，

5、讲稿共四十七页哦二、二、HPLC仪器仪器 HPLC仪器包括：仪器包括：1.高压输液装置高压输液装置;2.进样系统进样系统;3.分离系统分离系统;4.检测系统检测系统;5.此此外外还还配配有有梯梯度度淋淋洗洗、自动进样和数据处理装置。自动进样和数据处理装置。其工作过程如图所示。其工作过程如图所示。第四页，讲稿共四十七页哦He储液瓶储液瓶分布器分布器过滤过滤2 m高压泵高压泵入口检查入口检查出口检查出口检查脉流消除脉流消除抽气抽气过滤器过滤器反压调节反压调节压力计压力计注样阀注样阀分离柱分离柱到检测器到检测器第五页，讲稿共四十七页哦1.高压输液系统高压输液系统1）贮贮液液器器：1-2L的的玻玻璃璃

6、瓶瓶，配配有有溶溶剂剂过过滤滤器器(Ni合合金金)，其孔径约，其孔径约2 m，可防止颗粒物进行泵内。，可防止颗粒物进行泵内。第六页，讲稿共四十七页哦2）溶剂脱气系统：）溶剂脱气系统：l 为什么需要脱气为什么需要脱气 防止在检测器中产生气泡，引起噪音。防止在检测器中产生气泡，引起噪音。除去氧气的影响。除去氧气的影响。l 超声波脱气超声波脱气l 真空加热脱气真空加热脱气l He气鼓泡脱气气鼓泡脱气l 在线脱气机脱气在线脱气机脱气 溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去。剂中除去。第七页，讲稿共四十七页哦第八页，讲稿共四十

7、七页哦在线真空脱气和在线真空脱气和He脱气对保留时间在现性的影响脱气对保留时间在现性的影响第九页，讲稿共四十七页哦3）泵：）泵：对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。输液泵种类：恒压型和恒流型。输液泵种类：恒压型和恒流型。恒压泵恒压泵(类似于风箱类似于风箱)可迅速获得高压，适于柱的匀浆填充。但因泵腔体积大，可迅速获得高压，适于柱的匀浆填充。但因泵腔体积大，在往复推动时，会引起脉动，且输出流量随色谱系统阻力（主要是柱填充物）变化在往复推动时，会引起脉动，且输出流量随色谱系统阻力（主要是柱填充物）变化而变

8、化，现已较少使用。而变化，现已较少使用。恒流型溶剂流量恒定，与柱填充情况无关，使用较多。有机械注射式和机械恒流型溶剂流量恒定，与柱填充情况无关，使用较多。有机械注射式和机械往复式两种。应用最多的是机械往复式恒流泵往复式两种。应用最多的是机械往复式恒流泵(见下图。每分钟往复见下图。每分钟往复25100次，次，因此脉动小。对流量变化敏感的检测器也会有噪声干扰，此时可连接一脉动阻尼器因此脉动小。对流量变化敏感的检测器也会有噪声干扰，此时可连接一脉动阻尼器)。第十页，讲稿共四十七页哦串联泵串联泵 单元泵原理单元泵原理第十一页，讲稿共四十七页哦单元泵工作原理Authoring Division Name

9、 File NameSecurity Notice(if required)Damper阻尼器阻尼器Seal密封垫密封垫Piston活塞活塞杆杆Ball Screw DriveGearOutlet Ball Valve出口单向阀出口单向阀Active Inlet Valve入口单向阀入口单向阀Purge valve冲洗阀冲洗阀第十二页，讲稿共四十七页哦溶剂传输系统工作原理往复活塞泵(单向阀)（密封金垫）Gold SealSapphireInsertRuby BallSpringInsert入口出口自溶剂瓶至液相系统第十三页，讲稿共四十七页哦4）梯梯度度洗洗脱脱装装置置：在在分分离离过过程程中中

10、逐逐渐渐改改变变流流动动相相组组成成的的装装置置。如如果果只只有有一一个个泵泵，可可采采用用低低压压混混合合设设计计（将将两两种种或或以以上上的的溶溶剂剂按按一一定定比比例例混混合合，再再由由高高压压泵泵输输出出）；如如果果有有两两个个或或以以上上泵泵，调调节节各各自自的的流流量，在高压下混合。量，在高压下混合。第十四页，讲稿共四十七页哦低压梯度低压梯度第十五页，讲稿共四十七页哦高压梯度高压梯度第十六页，讲稿共四十七页哦第十七页，讲稿共四十七页哦2.进样系统进样系统进样装置包括两种：进样装置包括两种：1）手手动动进进样样器器：目目前前最最常常用用的的为为六六通通阀阀。由由于于进进样样量量可可由

11、由样样品品管管控控制制，因因此此进进样样准确，重复性好，如图。准确，重复性好，如图。装入样品装入样品出口出口进样进样采样环采样环泵入溶剂泵入溶剂进色谱柱进色谱柱第十八页，讲稿共四十七页哦ToWasteSample Loop(Fixed Volume)FromToColumnSampleSyringeLoadInjectToColumnPumpFrom PumpTo Waste手动进样器六通阀第十九页，讲稿共四十七页哦第二十页，讲稿共四十七页哦2 2）自动进样器）自动进样器第二十一页，讲稿共四十七页哦工作原理工作原理第二十二页，讲稿共四十七页哦第二十三页，讲稿共四十七页哦3.色谱柱色谱柱1）对对

12、色色谱谱柱柱的的要要求求：内内壁壁光光滑滑的的优优质质不不锈锈钢钢柱柱，柱柱接接头头的的死死体体积积尽尽可可能能小小。柱柱长长多多为为1530cm，内径为，内径为45mm(尺寸排阻色谱柱常大于尺寸排阻色谱柱常大于5mm，制备色谱柱内径更大，制备色谱柱内径更大)；2）柱的填充：主要采用匀浆法。根据使用匀浆试剂的性质不同可分为：）柱的填充：主要采用匀浆法。根据使用匀浆试剂的性质不同可分为：平衡密度法平衡密度法：即即使使溶溶剂剂密密度度和和填填充充颗颗粒粒密密度度相相近近，此此时时颗颗粒粒沉沉降降速速度度趋趋于于0。常常用用的的匀匀浆浆试试剂剂有有四四氯乙烯、四溴乙烷和二碘甲烷等；氯乙烯、四溴乙烷和

13、二碘甲烷等；非平衡密度法非平衡密度法：当采用粘度较大的试剂，如当采用粘度较大的试剂，如CC4，CH3OH,丙酮，二氧杂环已烷、丙酮，二氧杂环已烷、THF等。等。填充方法：填充方法：填填充充时时，按按上上述述方方法法制制作作匀匀浆浆液液，用用流流动动相相充充满满色色谱谱柱柱及及其其延延长长管管中中，然然后后将将匀匀浆浆液液倒倒入入匀匀浆浆填填充充器器，在在较较高高压压力力下下迅迅速速将将其其注注入入色色谱谱柱柱内内。要要求求填填充充速速度度快快(防防凝凝聚聚、沉沉降降或或结结块块)、且无空气进入且无空气进入(影响填充均匀性影响填充均匀性)。第二十四页，讲稿共四十七页哦0.090 in.0.130

14、 in.0.090 in.0.170 in.SwagelokWatersParkerRheodyneValcoUptight0.090 in.0.080 in.第二十五页，讲稿共四十七页哦柱温箱柱温箱第二十六页，讲稿共四十七页哦第二十七页，讲稿共四十七页哦第二十八页，讲稿共四十七页哦第二十九页，讲稿共四十七页哦第三十页，讲稿共四十七页哦4.检测器检测器 液液相相色色谱谱检检测测器器包包括括紫紫外外吸吸收收、荧荧光光发发射射、示示差差折折光和安培检测器等。光和安培检测器等。1）紫外检测器）紫外检测器 其其检检测测原原理理和和UV-Vis方方法法一一样样。只只是是，此此时时所所采采用用的的吸吸收收

15、池池为为微微量量吸吸收收池池，通通常常其其光光程程为为2-10mm,体积约为体积约为110 L。HPLC分分析析中中，约约有有80%的的物物质质可可以以在在254 nm或或280nm处处产产生生紫紫外外吸吸收收。因因此此该该类类检检测测器器应应用用很广。很广。在在选选择择测测量量波波长长时时注注意意：溶溶剂剂必必须须能能让让所所选选择择的的光光透透过，即所选波长不能小于溶剂的最低使用波长。过，即所选波长不能小于溶剂的最低使用波长。石英窗石英窗接色谱柱接色谱柱UV光电倍增管光电倍增管废液废液第三十一页，讲稿共四十七页哦Lamp Optical mirrorsGratingDetector cel

16、lSlitBeam splitter第三十二页，讲稿共四十七页哦Tungsten lampLensDeuterium lampLens systemHolmium filterDetector cellOptical slitGratingDiode Array第三十三页，讲稿共四十七页哦TimeWavelengthmsecnmLIGHTSHIFT REGISTERSWITCHVIDEO LINEREADOUT CYCLEPHOTODIODECAPACITORTRANSISTOR第三十四页，讲稿共四十七页哦第三十五页，讲稿共四十七页哦第三十六页，讲稿共四十七页哦Take peak spectr

17、umCompare with libraryMatch:998Chlortoluron?250 300W a v e l e n g t h (nm)250 300W a v e l e n g t h (nm)*Library Searching may be performed in an automated fashion.Spectral Libraries:Principle第三十七页，讲稿共四十七页哦2）荧光检测器）荧光检测器 许多有机物具荧光活性，尤其是芳香族化合物具有很强的活性。荧光检测器是许多有机物具荧光活性，尤其是芳香族化合物具有很强的活性。荧光检测器是一种选择性很强的检测

18、器，其灵敏度比一种选择性很强的检测器，其灵敏度比UV检测器高检测器高23个数量级。个数量级。第三十八页，讲稿共四十七页哦第三十九页，讲稿共四十七页哦3）示差折光检测器）示差折光检测器 原理：利用两束相同角度的光照射溶剂相和样品原理：利用两束相同角度的光照射溶剂相和样品+溶剂相，利用二者对光的折射率不同，其中一束（通常溶剂相，利用二者对光的折射率不同，其中一束（通常是通过样品是通过样品+溶剂相）光因为发生偏转造成两束光的强度溶剂相）光因为发生偏转造成两束光的强度差发生变化，将此差示信号放大并记录，该信号代表样品差发生变化，将此差示信号放大并记录，该信号代表样品的浓度。的浓度。为通用型检测器，灵敏

19、度为为通用型检测器，灵敏度为10-7g/mL。但对温度变。但对温度变化敏感，且不适于梯度淋洗。化敏感，且不适于梯度淋洗。第四十页，讲稿共四十七页哦第四十一页，讲稿共四十七页哦第四十二页，讲稿共四十七页哦第四十三页，讲稿共四十七页哦第四十四页，讲稿共四十七页哦第四十五页，讲稿共四十七页哦4）安培检测器）安培检测器 由由恒恒电电位位仪仪和和一一薄薄层层反反应应池池（体体积积为为15 L）组成。如图。）组成。如图。该该检检测测器器是是利利用用待待测测物物流流入入反反应应池池时时在在工工作作电电极极表表面面发发生生氧氧化化或或还还原原反反应应，两两电电极极间间就就有有电电流流通通过过，此电流大小与待测物浓度成正比。此电流大小与待测物浓度成正比。采采用用安安培培检检测测器器时时，流流动动相相必必须须含含有有电电解解质质，且且呈呈化化学学隋隋性性。它它最最适适于于与与反反相相色色谱谱匹匹配配。但但此此检检测测器器只只能能检检测测具具有有电电活活性性的的物物质。质。接参比电极接参比电极和对电极和对电极接色谱柱接色谱柱Teflon塑料块塑料块1 cm工作电极工作电极(Pt,Au,碳糊碳糊)第四十六页，讲稿共四十七页哦感感谢谢大大家家观观看看第四十七页，讲稿共四十七页哦