工业微生物菌种选育与保藏精选PPT.ppt

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1、关于工业微生物菌种选育与保藏第1页，讲稿共55张，创作于星期日 由于发酵工程本身的发展以及遗传工程的介入，藻类藻类（alga）、病毒（）、病毒（virus）等也正在逐步地变为工业生产用的生物。尽管如此，目前人们对微生物的认识还是十分不够的。已经初步研究的不超过自然界微生物总量的10%左右。微生物的代谢产物据统计已超过一千三百多种，而大规模生产的不超过一百多种；微生物酶有近千种，而在工业上利用的不过四五十种。可见潜力是很大的。在工业生产中常用的微生物主要有细菌、酵母菌、霉菌和放线菌。第2页，讲稿共55张，创作于星期日 工业生产常用的细菌有工业生产常用的细菌有 枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌(Bacil

2、lus subtilis)乳酸杆菌乳酸杆菌(Lactobacillus lactics)醋酸杆菌醋酸杆菌(Acetobacter)棒状杆菌棒状杆菌(Corynebacterium)短杆菌短杆菌(Brevibacterium)用于生产：用于生产：生产淀粉酶生产淀粉酶(amylase）蛋白酶（蛋白酶（proteinase）乳酸乳酸(lactic acid)醋酸醋酸(acetic acid)氨基酸氨基酸(amino acid)肌苷酸肌苷酸(inosinic acid)细菌（bacteria）：属于单细胞原核生物（unicellular prokaryote），），以典型的二分分裂(binary)方式

3、繁殖。细胞生长时细胞生长时，环状染色体（chromosome）被复制，细胞内的蛋白质等组分同时增加一倍，然后在细胞中部产生一横段间隔，染色体被分开，继而间隔分裂形成两个相同的子细胞。如间隔不完全分裂就形成链状细胞。第3页，讲稿共55张，创作于星期日第4页，讲稿共55张，创作于星期日第5页，讲稿共55张，创作于星期日 酵母菌（酵母菌（yeast）酵母菌为单细胞真核生物（unicellular eukaryote），在自然界 中普遍存在，主要分布于含糖质较多的的酸性环境中，如水果、蔬菜、花蜜（nectar）和植物叶子上，以及果园土壤中。石油酵母（petroleum yeast）较多地分布在油田周围

4、的土壤中。酵母菌大多为腐生，常以单个细胞存在，以发芽形式进行繁殖。母细胞体积长到一定程度时就开始发芽。芽长大的同时母细胞缩小，在母子细胞间形成隔膜，最后形成同样大小的两个细胞。如果子芽不与母细胞脱离就如果子芽不与母细胞脱离就形成链状细胞，称为假菌丝形成链状细胞，称为假菌丝(pseudomycelium)。工业上用的酵母菌有：啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、假丝酵母(Candida)、类酵母(Saccharomycodes)等，用于酿酒(Brewing)、制造面包、制造低凝固点石油、生产脂肪酶（lipase），以及生产可食用、药用和饲料用酵母菌体蛋白等。第6页，讲稿

5、共55张，创作于星期日真真核核细细胞胞结结构构示示意意图图第7页，讲稿共55张，创作于星期日 霉菌（霉菌（mould）霉菌不是一个分类学上的名词。凡生长在营养基质上形成绒毛状、网状或絮状菌丝的真菌(fungi)统称为霉菌。霉菌在自然界分布很广，大量存在于土壤、空气、水和生物体内外等处。它喜欢偏酸性环境，大多数为好氧性(aerobiotic)，多腐生，少数寄生。霉菌的繁殖能力很强，它以无性孢子和有性孢子进行繁殖，大多以无性孢子繁殖为主。第8页，讲稿共55张，创作于星期日 生长方式是菌丝末端的伸长和顶端分支，彼此交错呈网状。菌丝的长度既受遗传性的控制，又受环境的影响，其分支数量取决于环境条件。菌丝

6、或呈分散生长，或呈菌丝团状生长。工业上常用的霉菌有：工业上常用的霉菌有：藻状菌纲的根霉、毛霉、犁头霉，子囊菌纲的红曲霉，半知菌类的曲霉、青霉等；产品产品：酶制剂（enzyme preparation）、抗生素(antibiotic)、有机酸（organic acid）及甾体激素（steroid hormone）等。第9页，讲稿共55张，创作于星期日例如1、青霉属 青霉素产生菌 点青霉菌产黄青霉菌诱变提高产量v 青霉：延胡索酸 葡萄糖酸v2、头孢霉菌 产生头孢菌素Cv3、曲霉菌生产有机酸、甾体类转化第10页，讲稿共55张，创作于星期日 放线菌放线菌(Actinomycetes)放线菌因菌落呈放线

7、状而得名。它是一个原核生物类群，在自然界中分布很广，尤其在含有机质丰富的微碱性土壤中较广。大多腐生，少数寄生。放线菌主要以无性孢子进行繁殖，也可借菌丝片段进行繁殖。后一种繁殖方式见于液体沉没培养（submerged cultures）中。其生长方式是菌丝末端伸长和分支，彼此交错成网状结构，成为菌丝体。菌丝长度即受遗传性的控制，又与环境相关。第11页，讲稿共55张，创作于星期日 在液体沉没培养中由于搅拌器（agitator）的剪应力作用，常常形成短的分支旺盛的菌丝体，或呈分散生长，或呈菌丝团状生长。它的它的最大经济价值在于能产生多种抗生素最大经济价值在于能产生多种抗生素（antibiotics）

8、。）。从微生物中发现的抗生素，有60%以上是放线菌产生的，如链霉素、红霉素、金霉素、庆大霉素等。常用的放线菌主要来自以下几个属：链霉菌属、小单孢菌属和诺卡氏菌属等。第12页，讲稿共55张，创作于星期日v1、链霉菌属，是产生抗生素最多的一个属v链霉素 灰色链霉菌v红霉素 红色链霉菌v四环素 金色链霉菌 v2、小单孢菌 庆大霉素 由绛红小单孢菌和棘孢小单孢菌产生。第13页，讲稿共55张，创作于星期日 其他生物：其他生物：A:担子菌（担子菌（Basidiomycetes）：所谓的担子菌就是人们通常所说的菇类(mushroom)生物。担子菌资源的利用正愈来愈引起人们的重视，如多糖(polysaccha

9、ride)、抗癌(anticancer)药物的开发。近几年来，日本、美国的一些科学家对香菇的抗癌作用进行了深入的研究，发现香菇中的“1，2-葡萄糖苷酶”及两种糖类物质具有抗癌作用。第14页，讲稿共55张，创作于星期日 B：病毒：病毒(virus)其特点如下：1.形体微小，体积比细菌小的多。2.没有细胞结构，是一种独特分子的生物，主要由核酸和蛋白质构成。3.营寄生生活，由于缺乏独立代谢的酶体系，不能脱离寄主而自行生长繁殖，有专一性。人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）获得性免疫缺陷综合症（acquired immunodeficiency synd

10、rome，AIDS）第15页，讲稿共55张，创作于星期日第16页，讲稿共55张，创作于星期日 噬菌体（phage）是病毒的一种。：烈性噬菌体和温和噬菌：烈性噬菌体和温和噬菌体概念与区别。体概念与区别。噬菌体在寄主细胞中的生长繁殖过程可分为吸附、浸入、增殖、成熟和释放。第17页，讲稿共55张，创作于星期日 C：藻类（：藻类（alga）：培养螺旋藻，按干重计算每公顷可收获60吨，而种植大豆每公顷才可获4吨；从蛋白质产率来看，螺旋藻是大豆28倍。培养珊列藻，从蛋白质产率计算，每公顷珊列藻所得蛋白质是小麦的20-35倍。此外，还可通过藻类将CO转变为石油，培养单胞藻或其他藻类而获得的石油，可占细胞干重

11、的5%-50%,合成的油与重油相同，加工后可转变汽油、煤油、和其他产品。有的国家已建立培植单胞藻的农场，每年每公顷地培植的单胞藻按5%干物质为碳水化合物（石油）计算，可得60吨石油燃料。此项技术的应用，还可减轻因工业生产而大量排放CO造成的温室效应。国外还有人从“藻类农场”获取氢能的报道，大量培养藻类，利用其光合放氢作用来取得氢能。第18页，讲稿共55张，创作于星期日藻藻 类类 工工 厂厂第19页，讲稿共55张，创作于星期日 二、微生物工业对菌种的要求微生物工业对菌种的要求 目前，随着微生物工业原料的转换和新产品的不断出现，势必要求开拓更多新品种。尽管微生物工业用的菌种多种多样，但作为大规模生

12、产，对菌种则有下列要求：(1)廉价原料、生长迅速、目的产物产量高。(2)易于控制培养条件，酶活性高；发酵周期较短。(3)抗杂菌和噬菌体的能力强。(4)菌种纯，不易变异和退化，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，保证安全生产。第20页，讲稿共55张，创作于星期日 在筛选所需的菌种时应考虑的一些重要的指标：（1）菌种的营养特征：（2）菌种的生长温度：（3）菌种对所采用的设备及生产过程的适应性：（4）菌种的稳定性：（5）产物的得率和产物的浓度：（6）产物容易回收：能满足（3）（6），则有希望成为效益较高的生产菌种。第21页，讲稿共55张，创作于星期日第二节第二节 菌种的衰退、复壮与保藏菌种的衰退、复

13、壮与保藏v菌种退化是指经较长时间传代保藏后，菌株的一个或多个生理性状和形态特征逐渐减退或消失的现象。第22页，讲稿共55张，创作于星期日 一、微生物菌种衰退的原因一、微生物菌种衰退的原因 1.原因原因 一是菌种保藏不妥;二是菌种生长的要求没有得到满足，或是遇到不利的条件，或是失去某些需要的条件；三是经诱变获得的新菌株发生回复突变回复突变，从而丧失新的特征的情况。连续传代是菌种退化的直接原因，这是由于菌种经常处于旺盛的生长状态。衰退菌株的特点：个体或群体特征发生变化；生产个体或群体特征发生变化；生产能力降低；代谢能力降低；发酵周期延长；抗不良环能力降低；代谢能力降低；发酵周期延长；抗不良环境能力

14、降低。境能力降低。第23页，讲稿共55张，创作于星期日 2 防止菌种衰退的措施 菌种的分离菌种的分离:因为在菌种发生衰退的同时，并不是所有的菌体都衰退，其中未衰退的菌体往往是经过环境条件考验的，具有更强的生产能力。因此，对于已衰退的菌株采用单细胞菌株分离单细胞菌株分离的措施，即用稀释平板法或用平板划线法，以取得单细胞所长成的菌落（colony），再通过菌落和菌体的特征分析和性能测定，就可获得具有原来形状的菌株，甚至性能更好的菌株（strain）。）。如果菌种已经发生退化，产量下降，则要进 行分离复壮。第24页，讲稿共55张，创作于星期日 如对芽孢杆菌(Bacillus)，可先将菌液用沸水处理几

15、分钟，再用平板进行分离，从所剩下的孢子中挑选出最优的菌体。如果遇到某些菌株即使进行单细胞分离，仍不能达到复壮的效果，则可改变培养条件，达到复壮的目的。如AT3.942栖土曲霉(Aspergillus terricola)的产孢子能力下降，可适当提高培养温度，恢复其能力。同时通过实验选择一种有利于高产菌株而不利于低产菌株的培养条件。第25页，讲稿共55张，创作于星期日 其它防其它防 衰衰 措措 施施v菌种的复壮v提供良好的环境条件v使用优良的保存方法v定期纯化菌种第26页，讲稿共55张，创作于星期日二、菌种的复壮v通过分离达到复壮:菌落纯菌落纯/细胞纯细胞纯 在琼脂平板划线、涂布或与琼脂培养基混

16、合培养再分离，达到菌落纯菌落纯 采用单细胞或单孢子分离法达到细胞纯细胞纯v通过寄主体达到复壮:对于寄生性微生物的退化菌株,将菌株接种到寄主细胞进行繁殖达到复壮。第27页，讲稿共55张，创作于星期日 三、菌种保藏（strain preservation）基本原理基本原理：根据菌种的生理、生化特点，人为地创造条件，使菌种的代谢活动处于休眠状态。要求：要求：维持菌种的存活和减少菌种的变异，尽量使菌种保持原来优良的生产性能。保藏时首先选择优良纯菌种优良纯菌种，最好是它们的休眠体如孢子（spore）、芽孢(gemma)等；其次是要创造一个有利于休眠的环境条件，如低温、干燥、缺氧和缺乏营低温、干燥、缺氧和

17、缺乏营养物质等，养物质等，使菌体的代谢活动处于最低状态，延长其保存期。第28页，讲稿共55张，创作于星期日 保存方法：保存方法：应能较长期地保存原有菌种的优良性能，使菌种稳定，同时也要考虑到方法本身的经济简便。不同的菌种有不同的保存方法，以便长期保藏。酵母菌酵母菌：定期移植斜面低温保藏法。也可采用石蜡油封保藏法。霉菌：霉菌：斜面保藏法和沙土管保藏法。细细菌菌和和放放线线菌菌：一般细菌以采用冷冻干燥保藏法为佳。放线菌可用沙土或冷冻保藏法保藏。短期可采用斜面保藏。保藏应注意的问题保藏应注意的问题：菌体状态：休眠体 基质：营养贫乏 操作过程：不应对细胞造成伤害不应对细胞造成伤害第29页，讲稿共55张

18、，创作于星期日 工业生产中微生物育种的基本方法包括自然选育、诱变育种、抗性菌种选育、代谢控制育种及基因重组定向育种等。育种就是要改善菌种的特性，使之能提高产量、改进质量、降低成本、改进工艺、方便管理及综合利用等。代谢控制育种主要有两个方面：改变代谢通路的育种 改变代谢自动调节系统的育种第三节第三节 菌种的选育菌种的选育第30页，讲稿共55张，创作于星期日 一、自然选育 采样 增殖培养 从自然界选育菌株 纯种分离 性能鉴定 从自发突变中选育菌株第31页，讲稿共55张，创作于星期日 二、诱变育种 按照生产的要求，根据生物的遗传和变异的理论，用人工的方法造成菌种变异，再经过筛选、而达到菌种诱变选育的

19、目的。诱变育种诱变育种一般采用物理、化学诱变剂使微生物DNADNA的碱基的碱基排列发生变化，以使排列错误的DNA模板形成异常的遗转信息，造成某些蛋白结构变异，而使细胞功能发生改变。第32页，讲稿共55张，创作于星期日原种（出发菌株）纯化斜面培养完全培养基同步培养离心洗涤玻璃珠震荡分散过滤单细胞或孢子悬浮液 活菌计数诱变处理 诱变处理预备实验 处理液活菌计数平板分离 形态变异并计算其变异率斜面培养 初筛、复筛 自然分离和再复筛 保藏及扩大试验诱变育种第33页，讲稿共55张，创作于星期日 出发菌株的选择 诱变剂的选择 诱变操作及培养 突变株的筛选 突变高产基因的表现 形态突变 高产突变 耐药性突变

20、 营养缺陷型突变 结构类似物抗性突变第34页，讲稿共55张，创作于星期日出发菌株出发菌株（parent strain）选择应考虑的问题选择应考虑的问题v出发菌株的稳定性：v选用具备优良特性的菌株：v挑选对诱变剂敏感的菌株：v注意菌株的生理状态及生长发育时间：野生菌株 自发突变后获得的高产菌株 已经诱变过的菌株出发菌株出发菌株第35页，讲稿共55张，创作于星期日考虑试验菌株的遗传背景：各种诱变剂有不同的作用机制，一种诱变剂的作用常主要集中在DNA的某些特异部位上，多次反复用一种诱变因子易出现“饱和”或恢复突变现象，因此诱变时常采用多种不同的诱变因子或复合诱变因子。诱诱 变变 剂剂 的的 选选 择

21、择菌悬液的制备菌悬液的制备 单细胞悬浮液：单细胞悬浮液：10106 6个个/mL/mL 孢子悬浮液：孢子悬浮液：10108 8个个/mL/mL诱变：预实验确定适宜的诱变条件诱变：预实验确定适宜的诱变条件筛选：选择合适的筛选方法筛选：选择合适的筛选方法第36页，讲稿共55张，创作于星期日紫外线诱变紫外线是应用最广、研究最多、最经济、诱变效果较理想的诱变剂，紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为2537A灯与处理物的距离为1530cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在7080%为宜。第37页，讲稿共55张，创作于星期日被照射的

22、菌悬液细胞数，细菌为106个/ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106107个/ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约0.51.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后的处理应在红灯下进行。第38页，讲稿共55张，创作于星期日 操作步骤 1将细菌培养液以3000rmin离心5min，倾去上清液，将菌体打散加入无菌生理盐水再离心洗涤。2将菌悬液放入一已灭菌的，装有玻璃珠的三角瓶内用手摇动，以打散菌体。将菌液倒入有定性滤纸的漏斗内过滤，单细胞滤液装入试管内，一般处于浑浊态的细胞液含细胞数可达108个ml左右，作为待处理菌悬液。

23、第39页，讲稿共55张，创作于星期日3取24m1制备的菌液加到直径9cm培养皿内，放入一无菌磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、15W紫外线下30cm处。在正式照射前，应先开紫外线10min，让紫外灯预热，然后开启皿盖正式在搅拌下照射1050s。操作均应在红灯下进行，或用黑纸包住，避免白炽光。第40页，讲稿共55张，创作于星期日4取未照射的制备菌液和照射菌液各0.5ml进行稀释分离，计数活菌细胞数。5取照射菌液2ml于液体培养基中(300ml三角瓶内装30ml培养液)，120rmin振荡培养46h。6取中间培养液稀释分离、培养。7挑取菌落进行筛选。第41页，讲稿共55张，创作于星期日氮芥的诱变作用

24、:常用其盐酸盐，为白色粉末，在碳酸氢钠存在的情况下，呈游离状态，再与微生物细胞作用，引起诱变。可用甘氨酸解毒。使用方法：1配制活化剂和解毒剂，高压灭菌备用，活化剂：取碳酸氢钠68g溶于10ml蒸馏水中即可；解毒剂：碳酸氢钠136mg,甘氨酸120mg,溶解于200ml水中。第42页，讲稿共55张，创作于星期日2氮芥盐酸盐溶液的配制：所有用品灭菌、烘干，取约10mg氮芥盐酸盐放入一小瓶，加入蒸馏水2ml，加盖橡皮塞即可。3吸取1ml孢子悬液（200万孢子/ml）加入一灭菌小瓶，加入0.6ml缓冲液，再加入0.4ml氮芥溶液，加盖橡皮塞，摇匀，此时氮芥作用浓度1mg/ml.4加氮芥溶液30s后计时

25、，到时间后，取0.1ml作用液加入9.9ml解毒液中，使停止作用。第43页，讲稿共55张，创作于星期日亚硝基胍诱变曲霉菌亚硝基胍诱变曲霉菌 N甲基N-硝基-N-亚硝基胍(NGN，MNNG或NTG)对真核或原核微生物都有强烈的诱变作用。其精确的作用机制尚不很清楚，据认为是伴随着重氮甲烷的生成及在酸性条件下生成亚硝酸，直接作用于细胞内的DNA复制系统，从而诱发了变异。MNNG的诱变作用随pH的升高而增强。第44页，讲稿共55张，创作于星期日(二)操作步骤 1单孢子悬液制备 取斜面，加入6ml 0.1molL pH6.o的磷酸缓冲液，用接种环刮下孢子，振荡试管，立即通过带滤纸漏斗过滤，由此制得单孢子

26、悬液，若孢子液浑浊状，其孢子浓度可达l06个ml，此为待处理孢子悬液。2MNNG溶液的制备 用分析天平称取2mg，加入2ml 0.1molL pH 6.0磷酸缓冲液，于暗处振荡溶解。第45页，讲稿共55张，创作于星期日3诱变处理 吸取MNNG溶液lml，加入到1m1孢子悬液中，30振荡30min，立即稀释1000倍停止作用，然后以10-2，10-4两个稀释度分离培养，30 3天后计数。4死亡率计算 将未处理的孢子液1ml加入1ml磷酸缓冲液中，同上逐级稀释分离，30下培养3天。根据处理前后的活孢子数可计算出死亡率。5挑取菌落进行糖化酶及蛋白酶产量筛选第46页，讲稿共55张，创作于星期日随机筛选

27、方法：随机筛选方法：菌种经诱变处理后,进行平板分离,随机挑选单菌落,从中筛选高产菌株。为了提高筛选效率，发展了一些快速筛选方法（包括摇瓶快速筛选方法（包括摇瓶筛选法，琼脂块筛选法等），并归纳出筛选高产菌的培养基筛选法，琼脂块筛选法等），并归纳出筛选高产菌的培养基选择准则:1、制备一系列含有各种类型营养成分（生长限制因素）培养基；2、避免使用容易同化的碳源或氮源，（引起分解代谢物阻遏）；3、加入缓冲液以减少pH的变化；4、确定含有所需的辅助因子。第47页，讲稿共55张，创作于星期日 生长因子产生菌（对应于营养缺陷型）的筛选：生长因子产生菌（对应于营养缺陷型）的筛选：通过观察分离菌能否促进营养缺陷

28、型（auxotroph）的生长，便可检出生长因子产生菌。抗反馈突变株（抗结构类似物）的筛选抗反馈突变株（抗结构类似物）的筛选：结构类似物具有和代谢产物代谢产物相似的反馈调节作用，但又不同于代谢物，不具有正常的生理功能，对细胞代谢又阻碍作用。由于突破了原有的反馈调节系统，这些突变株就可以产生大量的该种代谢物。理性化筛选理性化筛选第48页，讲稿共55张，创作于星期日高通量筛选（筛选（high throughput screening):将许多模型固定在各自不将许多模型固定在各自不同的载体上，用机器人加样，培养后用计算机记录结果，并进行分同的载体上，用机器人加样，培养后用计算机记录结果，并进行分析，

29、使筛选从繁重的劳动中解脱出来，实现大规模筛选。析，使筛选从繁重的劳动中解脱出来，实现大规模筛选。细胞模型：细胞模型：观察待测样品对细胞的作用，只能反映药物对细胞生长等过程的综合作用，不能反映作用的途径和靶点。包括各种正常细胞和病理细胞。分子模型：分子模型：包括受体、酶，其特点是药物作用的靶点明确。通过高通量筛选方法，可以发现效果好、临床应用价值高通过高通量筛选方法，可以发现效果好、临床应用价值高的创新药物，治疗疑难病症。的创新药物，治疗疑难病症。高通量筛选筛选第49页，讲稿共55张，创作于星期日诱变育种的几个概念诱变育种的几个概念v形态突变型：指发生细胞形态变化或菌落形态变化的突变 型 v生化

30、突变型：没有形态效应的突变型，如营养缺陷型v致死突变型：生活力下降的突变型v条件致死突变型：在某些条件下能成活，在另一些条件 下是致死的突变型v营养缺陷型突变株：由于代谢障碍而成为必须添加某种物 质才能生长的突变株v温度敏感性突变株：可在某一温度下生长而在另一温度下 不能生长的突变型第50页，讲稿共55张，创作于星期日 第四节 生产菌株的改良 杂交育种：两个不同基因型的菌株通过结合或原生质体融合使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选出具有新性状的菌株。一、常规的杂交育种:不须用脱壁酶处理，就能使细胞结合而发生遗传物质重新组合。二、原生质体融合：原生质体的制备、原生质体的融合、融合子的选择、实用型

31、菌株的筛选。第51页，讲稿共55张，创作于星期日第52页，讲稿共55张，创作于星期日1.标记菌株的筛选：对两亲株要进行标记，以提高筛选率。2.原生质体的制备：用相应的酶脱去菌体的细胞壁，制得完整的原生质体。3.原生质体的融合与再生：两原生质体在促融因子的存在下，发生融合，重建细胞壁，形成新的细胞。4.融合子的选择：在选择培养基上，通过两个亲本的遗传标记互补而选择融合子。第53页，讲稿共55张，创作于星期日三、DNA重组技术(分子生物学)v目标DNA片段的获得v与载体DNA分子的连接v重组DNA分子引入宿主细胞v重组体的选择与鉴定v外源基因的表达第54页，讲稿共55张，创作于星期日感感谢谢大大家家观观看看第55页，讲稿共55张，创作于星期日