植物基因克隆方法精选PPT.ppt

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1、关于植物基因克隆方法第1页，讲稿共47张，创作于星期二 一、基因克隆（分子克隆一、基因克隆（分子克隆一、基因克隆（分子克隆一、基因克隆（分子克隆molecularcloningmolecularcloning）通过体外重组技术通过体外重组技术通过体外重组技术通过体外重组技术,将一段目的将一段目的将一段目的将一段目的DNADNADNADNA经切割、连接经切割、连接经切割、连接经切割、连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量子代分子的过程。子代分子的过程。子代分子的过

2、程。子代分子的过程。二、基因克隆的核心二、基因克隆的核心二、基因克隆的核心二、基因克隆的核心-体外重组体外重组体外重组体外重组(Recombination)(Recombination)(Recombination)(Recombination)人工将一段目的人工将一段目的人工将一段目的人工将一段目的DNADNADNADNA插入一个载体的过程。插入一个载体的过程。插入一个载体的过程。插入一个载体的过程。第2页，讲稿共47张，创作于星期二载体载体DNA（vector）目的目的DNA（targetfragment）重组重组DNA（recombinantDNA）宿主（宿主（host）筛选、扩增筛选、

3、扩增克隆（克隆（clone）基因克隆的路线基因克隆的路线DNA重组重组转化转化第3页，讲稿共47张，创作于星期二用何种方法取决于基因产物（用何种方法取决于基因产物（用何种方法取决于基因产物（用何种方法取决于基因产物（GeneproductsGeneproducts）的丰度以及）的丰度以及）的丰度以及）的丰度以及genegene的相关背景知识，的相关背景知识，的相关背景知识，的相关背景知识，如如如如 geneoritsproteingeneoritsprotein的表达模式及初级结构等的表达模式及初级结构等的表达模式及初级结构等的表达模式及初级结构等 （一）已知（一）已知基因产物基因产物的基因分

4、离的基因分离（二）未知（二）未知基因产物基因产物的基因分离的基因分离第4页，讲稿共47张，创作于星期二（一）已知（一）已知Geneproducts的基因分离的基因分离1 1 1 1、利用、利用、利用、利用DNADNADNADNA探针筛选基因文库探针筛选基因文库探针筛选基因文库探针筛选基因文库 前提是已知一段前提是已知一段前提是已知一段前提是已知一段DNADNADNADNA序列并构建了基因文库序列并构建了基因文库序列并构建了基因文库序列并构建了基因文库 同源同源同源同源(homologous)DNA(homologous)DNA(homologous)DNA(homologous)DNA探针探针

5、探针探针 为了克隆一个完整基因结构或研究调节序列。为了克隆一个完整基因结构或研究调节序列。为了克隆一个完整基因结构或研究调节序列。为了克隆一个完整基因结构或研究调节序列。异源异源异源异源(Heterologous)DNA(Heterologous)DNA(Heterologous)DNA(Heterologous)DNA探针探针探针探针 利用一种植物的一段利用一种植物的一段利用一种植物的一段利用一种植物的一段DNADNADNADNA序列作探针，从其它序列作探针，从其它序列作探针，从其它序列作探针，从其它 植物中克隆同源基因植物中克隆同源基因植物中克隆同源基因植物中克隆同源基因 注意：有的基因在

6、不同物种间同源性很高，有的则很低注意：有的基因在不同物种间同源性很高，有的则很低注意：有的基因在不同物种间同源性很高，有的则很低注意：有的基因在不同物种间同源性很高，有的则很低。第5页，讲稿共47张，创作于星期二2 2 2 2、利用、利用、利用、利用proteinproteinproteinprotein信息分离基因信息分离基因信息分离基因信息分离基因 前提是所研究的前提是所研究的前提是所研究的前提是所研究的proteinproteinproteinprotein可以从植物中分离纯化可以从植物中分离纯化可以从植物中分离纯化可以从植物中分离纯化 利用利用利用利用antibodyantibodya

7、ntibodyantibody筛选表达文库筛选表达文库筛选表达文库筛选表达文库(Expression Library)(Expression Library)(Expression Library)(Expression Library)Antibody production Antibody production Construction of Expression Library Construction of Expression Library 利用利用利用利用proteinproteinproteinprotein测序的氨基酸信息测序的氨基酸信息测序的氨基酸信息测序的氨基酸信息 Pr

8、obe(oligonucleotides)Probe(oligonucleotides)Primer(degeneratedprimer)Primer(degeneratedprimer)第6页，讲稿共47张，创作于星期二(b)(b)Oligonucleotide probes or generated primers for genes whose translation products have been characterized p176Trp-Asp-Glu-Asn-Asn-MetTrp-Asp-Glu-Asn-Asn-Met 1 2 2 2 2 1 1 2 2 2 2 1 (16

9、 species)(16 species)Ser-Glu-Try-Leu-Thr-AsnSer-Glu-Try-Leu-Thr-Asn 6 2 2 6 4 2 6 2 2 6 4 2 (1152 species)(1152 species)第7页，讲稿共47张，创作于星期二第8页，讲稿共47张，创作于星期二RT-PCR and RACE PCRR ReverseeverseT Transcription,ranscription,R RapidapidA Amplificationmplificationofofc cDNADNAE Endsnds第9页，讲稿共47张，创作于星期二问题问题问题

10、问题1 1：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCRRT-PCR产物。产物。产物。产物。原因：原因：原因：原因：1 1）RNARNA被降解被降解被降解被降解 建议解决方法建议解决方法建议解决方法建议解决方法：利用无污染技术分离利用无污染技术分离利用无污染技术分离利用无污染技术分离RNARNA；如果使用如果使用如果使用如果使用RNaseRNase抑制剂，抑制剂，抑制剂，抑制剂，不要加热超过不要加热超过不要加热超过不要加热超过4545或或或或pHpH超过超过超过超过8.08.0。2 2）RNA

11、RNA中包含逆转录抑制剂中包含逆转录抑制剂中包含逆转录抑制剂中包含逆转录抑制剂 建议解决方法建议解决方法建议解决方法建议解决方法：通过乙醇沉淀通过乙醇沉淀通过乙醇沉淀通过乙醇沉淀RNARNA除去抑制剂。用除去抑制剂。用除去抑制剂。用除去抑制剂。用7070（v/vv/v）乙醇对）乙醇对）乙醇对）乙醇对RNARNA沉淀进行清洗。沉淀进行清洗。沉淀进行清洗。沉淀进行清洗。逆转录抑制剂包括：逆转录抑制剂包括：逆转录抑制剂包括：逆转录抑制剂包括：SDSSDS，EDTAEDTA，甘油，焦磷酸钠，甲酰胺和胍，甘油，焦磷酸钠，甲酰胺和胍，甘油，焦磷酸钠，甲酰胺和胍，甘油，焦磷酸钠，甲酰胺和胍盐。盐。盐。盐。R

12、T-PCRRT-PCR实验中的常见问题与对策实验中的常见问题与对策第10页，讲稿共47张，创作于星期二3 3）多糖同）多糖同）多糖同）多糖同RNARNA共沉淀共沉淀共沉淀共沉淀建议解决方法：建议解决方法：建议解决方法：建议解决方法：使用氯化锂沉淀使用氯化锂沉淀使用氯化锂沉淀使用氯化锂沉淀RNARNA以除去多糖。以除去多糖。以除去多糖。以除去多糖。4 4）起始）起始）起始）起始RNARNA量不够量不够量不够量不够建议解决方法：建议解决方法：建议解决方法：建议解决方法：增加增加增加增加RNARNA量。量。量。量。对于对于对于对于50ng50ng的的的的RNARNA样品，可以在样品，可以在样品，可以

13、在样品，可以在第一链第一链第一链第一链cDNAcDNA合成中使用合成中使用合成中使用合成中使用0.1g0.1g到到到到0.5g0.5g乙酰乙酰乙酰乙酰BSABSA。5 5）RNARNA模板二级结构太多模板二级结构太多模板二级结构太多模板二级结构太多建议解决方法：建议解决方法：建议解决方法：建议解决方法：将将将将RNARNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性和引物在不含盐及缓冲液条件下变性和引物在不含盐及缓冲液条件下变性和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退退退退火火火火.提高逆转录反应温度，对提高逆转录反应温度，对提高逆转录反应温度，对提高逆转录反应温度，对SuperScriptSuperScri

14、pt可以到可以到可以到可以到5050，对，对，对，对ThermoScriptThermoScript可以到可以到可以到可以到6565。注意：不要在注意：不要在注意：不要在注意：不要在6060时使用时使用时使用时使用oligo(dT)oligo(dT)引物，选择一个在反应温度可引物，选择一个在反应温度可引物，选择一个在反应温度可引物，选择一个在反应温度可以退火的以退火的以退火的以退火的GSPGSP。对于。对于。对于。对于1kb1kb的的的的RT-PCRRT-PCR产物，保持反应温度产物，保持反应温度产物，保持反应温度产物，保持反应温度 6565。注注注注意：不要在高于意：不要在高于意：不要在高于

15、意：不要在高于3737时使用时使用时使用时使用M-MLVM-MLV。如果不需要全长如果不需要全长如果不需要全长如果不需要全长cDNAcDNA，在第一链反应中使用随机引物。，在第一链反应中使用随机引物。，在第一链反应中使用随机引物。，在第一链反应中使用随机引物。第11页，讲稿共47张，创作于星期二6 6）PCRPCR引物设计较差引物设计较差引物设计较差引物设计较差建议解决方法：建议解决方法：建议解决方法：建议解决方法：避免在引物避免在引物避免在引物避免在引物33端含有互补序列。避免可以形成内端含有互补序列。避免可以形成内端含有互补序列。避免可以形成内端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列

16、。设计部发卡结构的序列。设计部发卡结构的序列。设计部发卡结构的序列。设计TmTm类似的引物。类似的引物。类似的引物。类似的引物。7 7）镁离子浓度太低）镁离子浓度太低）镁离子浓度太低）镁离子浓度太低建议解决方法：建议解决方法：建议解决方法：建议解决方法：从从从从1mM1mM到到到到3mM3mM，间隔，间隔，间隔，间隔0.5mM0.5mM进行一系列反应，确定进行一系列反应，确定进行一系列反应，确定进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。8 8）退火温度太高）退火温度

17、太高）退火温度太高）退火温度太高建议解决方法：建议解决方法：建议解决方法：建议解决方法：把退火温度设定为低于把退火温度设定为低于把退火温度设定为低于把退火温度设定为低于Tm5Tm5。因为公式估算。因为公式估算。因为公式估算。因为公式估算TmTm值值值值比所有真正的退火温度实际会高些或低些。比所有真正的退火温度实际会高些或低些。比所有真正的退火温度实际会高些或低些。比所有真正的退火温度实际会高些或低些。9 9）富含）富含）富含）富含GCGC的模板的模板的模板的模板建议解决方法：建议解决方法：建议解决方法：建议解决方法：对于对于对于对于GCGC含量含量含量含量5050的模板，使用的模板，使用的模板

18、，使用的模板，使用PCRxEnhancerPCRxEnhancerSolutionSolution。第12页，讲稿共47张，创作于星期二问题问题问题问题2 2：在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带。：在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带。：在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带。：在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带。原因：原因：原因：原因：1 1）引物和模板非特异性退火）引物和模板非特异性退火）引物和模板非特异性退火）引物和模板非特异性退火建议解决方法：建议解决方法：建议解决方法：建议解决方法：以以以以2 2到到到到5 5间隔增加退火温度，减少退火时间。间隔增加退火温度，减少退火时间。间隔增加退火温度

19、，减少退火时间。间隔增加退火温度，减少退火时间。在开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的退火温度。在开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的退火温度。在开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的退火温度。在开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的退火温度。使使使使用用用用PlatinumTaqDNAPlatinumTaqDNA进行自动热启动进行自动热启动进行自动热启动进行自动热启动PCRPCR。2 2）引物设计较差）引物设计较差）引物设计较差）引物设计较差避免在引物避免在引物避免在引物避免在引物33端含有端含有端含有端含有2 2到到到到3 3个个个个dGdG或或或或dC

20、dC。3 3）RNARNA中沾染了基因组中沾染了基因组中沾染了基因组中沾染了基因组DNADNA4 4）镁离子浓度太高）镁离子浓度太高）镁离子浓度太高）镁离子浓度太高建议解决方法：建议解决方法：建议解决方法：建议解决方法：优化镁离子浓度。优化镁离子浓度。优化镁离子浓度。优化镁离子浓度。5 5）因为扩增复杂模板导致引物错误起始）因为扩增复杂模板导致引物错误起始）因为扩增复杂模板导致引物错误起始）因为扩增复杂模板导致引物错误起始建议解决方法：建议解决方法：建议解决方法：建议解决方法：使用巢式使用巢式使用巢式使用巢式PCRPCR或递减或递减或递减或递减PCRPCR。第13页，讲稿共47张，创作于星期二

21、RACERACEPCRPCR第14页，讲稿共47张，创作于星期二PCRPCR和细胞内和细胞内和细胞内和细胞内DNADNA复制的相同点：复制的相同点：复制的相同点：复制的相同点：（1 1 1 1）两者都符合半保留复制模型，即两条链都可作为）两者都符合半保留复制模型，即两条链都可作为）两者都符合半保留复制模型，即两条链都可作为）两者都符合半保留复制模型，即两条链都可作为 模板，子代链中一条链来自于亲代链，另一条链模板，子代链中一条链来自于亲代链，另一条链模板，子代链中一条链来自于亲代链，另一条链模板，子代链中一条链来自于亲代链，另一条链 是新合成的是新合成的是新合成的是新合成的（2 2 2 2）两

22、者都需要引物）两者都需要引物）两者都需要引物）两者都需要引物（3 3 3 3）两者都需要依赖）两者都需要依赖）两者都需要依赖）两者都需要依赖DNADNADNADNA的的的的DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶（4 4 4 4）两者的底物都是）两者的底物都是）两者的底物都是）两者的底物都是dNTPdNTPdNTPdNTP（5 5 5 5）DNADNADNADNA合成时都是在合成时都是在合成时都是在合成时都是在DNADNADNADNA聚合酶作用下按碱基配对聚合酶作用下按碱基配对聚合酶作用下按碱基配对聚合酶作用下按碱基配对 原则往原则往原则往原则往3-OH3-OH3-OH3-OH上加上加

23、上加上加dNTPdNTPdNTPdNTP，形成，形成，形成，形成3333，5555磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键（6 6 6 6）两者新合成链延伸的方向都是）两者新合成链延伸的方向都是）两者新合成链延伸的方向都是）两者新合成链延伸的方向都是5 5 5 5to3to3to3to3（7 7 7 7）两者）两者）两者）两者DNADNADNADNA合成的保真度（精确性）都较高合成的保真度（精确性）都较高合成的保真度（精确性）都较高合成的保真度（精确性）都较高第15页，讲稿共47张，创作于星期二PCRPCR和细胞内和细胞内和细胞内和细胞内DNADNA复制的不同点：复制的不同点：复制的不同点：复

24、制的不同点：（1 1 1 1）复制为半不连续复制，而）复制为半不连续复制，而）复制为半不连续复制，而）复制为半不连续复制，而PCRPCRPCRPCR两条链的合成都是连续的两条链的合成都是连续的两条链的合成都是连续的两条链的合成都是连续的（2 2 2 2）复复复复制制制制时时时时引引引引物物物物是是是是由由由由引引引引发发发发酶酶酶酶或或或或引引引引发发发发体体体体合合合合成成成成的的的的，而而而而PCRPCRPCRPCR引引引引物物物物是是是是在在在在反反反反应应应应前前前前加加加加到到到到反应体系中反应体系中反应体系中反应体系中（3 3 3 3）复复复复制制制制需需需需要要要要在在在在特特特

25、特定定定定的的的的复复复复制制制制原原原原点点点点起起起起始始始始，并并并并且且且且有有有有终终终终止止止止点点点点，而而而而PCRPCRPCRPCR在在在在有有有有特特特特异异异异引引引引物存在时在任何序列都可起始，并且没有终止点物存在时在任何序列都可起始，并且没有终止点物存在时在任何序列都可起始，并且没有终止点物存在时在任何序列都可起始，并且没有终止点（4 4 4 4）复复复复制制制制时时时时两两两两条条条条模模模模板板板板链链链链是是是是在在在在解解解解旋旋旋旋酶酶酶酶的的的的作作作作用用用用下下下下局局局局部部部部打打打打开开开开双双双双链链链链，而而而而PCRPCRPCRPCR两两两

26、两条条条条模板链通过变性完全打开双链模板链通过变性完全打开双链模板链通过变性完全打开双链模板链通过变性完全打开双链（5 5 5 5）复复复复制制制制时时时时两两两两条条条条链链链链的的的的合合合合成成成成是是是是同同同同步步步步进进进进行行行行的的的的，而而而而PCRPCRPCRPCR两两两两条条条条链链链链的的的的合合合合成成成成可可可可能能能能不不不不同步同步同步同步（6 6 6 6）PCRPCRPCRPCR的的的的DNADNADNADNA聚合酶为耐热的聚合酶为耐热的聚合酶为耐热的聚合酶为耐热的DNADNADNADNA聚合酶，而复制的聚合酶一般不耐热聚合酶，而复制的聚合酶一般不耐热聚合酶，

27、而复制的聚合酶一般不耐热聚合酶，而复制的聚合酶一般不耐热（7 7 7 7）复制一般为双向复制，而）复制一般为双向复制，而）复制一般为双向复制，而）复制一般为双向复制，而PCRPCRPCRPCR反应中反应中反应中反应中DNADNADNADNA合成是单向的合成是单向的合成是单向的合成是单向的（8 8 8 8）复制时由多种蛋白因子参与，而）复制时由多种蛋白因子参与，而）复制时由多种蛋白因子参与，而）复制时由多种蛋白因子参与，而PCRPCRPCRPCR只有只有只有只有DNADNADNADNA聚合酶参与聚合酶参与聚合酶参与聚合酶参与第16页，讲稿共47张，创作于星期二（二）未知（二）未知Geneprod

28、ucts的基因分离的基因分离1 1、差异杂交筛选（、差异杂交筛选（、差异杂交筛选（、差异杂交筛选（differentialhybridizationscreeningdifferentialhybridizationscreening）2 2、mRNAmRNA差异显示差异显示差异显示差异显示(differentialdisplay)(differentialdisplay)3 3、DNADNA表达文库（表达文库（表达文库（表达文库（expressionlibraryexpressionlibrary）4 4、DNADNA结合蛋白基因的分离结合蛋白基因的分离结合蛋白基因的分离结合蛋白基因的分离

29、5 5、信号传递蛋白基因的分离、信号传递蛋白基因的分离、信号传递蛋白基因的分离、信号传递蛋白基因的分离 6 6、图位克隆技术（、图位克隆技术（、图位克隆技术（、图位克隆技术（Map-basedcloningMap-basedcloning）第17页，讲稿共47张，创作于星期二建库法建库法cDNALibraryab第18页，讲稿共47张，创作于星期二传传统统mRNAmRNA差差异异显显示示技技术术（DDRT-PCRDDRT-PCR）是是根根据据绝绝大大多多数数真真核核细细胞胞mRNA3mRNA3端端具具有有的的多多聚聚腺腺苷苷酸酸尾尾（polyApolyA）结结构构，因因此此可可用用含含olig

30、ooligo（dTdT）的的寡聚核苷酸为引物将不同的寡聚核苷酸为引物将不同的mRNAmRNA反转录成反转录成cDNAcDNA。该该方方法法的的创创始始人人Liang Liang P P和和Pardee Pardee A A根根据据Poly Poly A A序序列列起起点点前前2 2个个碱碱基基除除AAAA外外只只有有1212种种可可能能性性的的特特征征，设设计计合合成成了了1212种种下下游游引引物物，称称3-3-锚锚定定引引物物，其其通通式式为为5-T11MN5-T11MN；同同时时为为扩扩增增出出polyApolyA上上游游500bp500bp以以内内所所有有可可能能性性的的mRNAmRN

31、A序序列列，在在55端端又又设设计计了了2020种种10bp10bp长长的的随随机机引引物物。这这样样构构成成的的引引物物对对进进行行PCRPCR扩扩增增能能产产生生出出2000020000条条左左右右的的DNADNA条条带带，其其中中每每一一条条都都代代表表一一种种特特定定mRNAmRNA种种，这这一一数数字字大大体体涵涵盖盖了了在在一一定定发发育育阶阶段段某某种细胞类型中所表达的全部种细胞类型中所表达的全部mRNAmRNA。将将差差别别表表达达条条带带中中的的DNADNA回回收收，扩扩增增至至所所需需含含量量，进进行行SouthernblotSouthernblot或或Northernbl

32、otNorthernblot或或直直接接测测序序，从从而而对对差差异异条条带带鉴鉴定定分分析析，以以便便最最终终获获得得差异表达的目的基因差异表达的目的基因 。第19页，讲稿共47张，创作于星期二mRNAmRNA差异显示差异显示差异显示差异显示(differentialdisplay)(differentialdisplay)第20页，讲稿共47张，创作于星期二表表达达文文库库法法第21页，讲稿共47张，创作于星期二从基因文库的功能上看可分为从基因文库的功能上看可分为克隆文库克隆文库及及表达文库表达文库。克克隆隆文文库库由由克克隆隆载载体体构构建建。载载体体中中具具复复制制子子、多多克克隆隆位

33、位点点及及选选择择标标记记，可可通过细菌培养使克隆片断大量增殖。通过细菌培养使克隆片断大量增殖。表表达达文文库库是是用用表表达达载载体体构构建建。载载体体中中除除上上述述元元件件外外，还还具具有有控控制制基基因因表表达达的的序序列列(如如启启动动子子、SDSD序序列列、ATGATG、终终止止子子等等)，可可在在宿宿主主细细胞胞中中表表达达出出克克隆隆片片段段的的编编码码产产物物。表表达达载载体体又又有有融融合合蛋蛋白白表表达达载载体体及及天天然然蛋蛋白白表表达载体之分。达载体之分。从从克克隆隆文文库库中中分分离离目目的的克克隆隆时时主主要要利利用用核核酸酸探探针针，可可以以是是根根据据蛋蛋白白

34、质质序序列列合成的寡核苷酸探针，也可以是同种或同属生物的同源序列探针。合成的寡核苷酸探针，也可以是同种或同属生物的同源序列探针。从从表表达达文文库库中中分分离离目目的的克克隆隆时时，因因克克隆隆片片段段的的表表达达产产物物蛋蛋白白质质具具有有抗抗原原性性及及生生物物活活性性，所所以以除除核核酸酸探探针针外外，还还可可以以利利用用免免疫疫学学探探针针及及生生物物功功能能进进行行筛筛选选。表表达达文文库库适适合合于于那那些些不不知知道道蛋蛋白白质质的的氨氨基基酸酸序序列列、不不能能用用核核酸酸类类探探针针筛筛选选的的目的基因的分离。目的基因的分离。第22页，讲稿共47张，创作于星期二1 1、差异杂

35、交筛选（、差异杂交筛选（、差异杂交筛选（、差异杂交筛选（differentialhybridizationscreeningdifferentialhybridizationscreening）2 2、mRNAmRNA差异显示差异显示差异显示差异显示(differentialdisplay)(differentialdisplay)3 3、DNADNA表达文库（表达文库（表达文库（表达文库（expressionlibraryexpressionlibrary）4 4、DNADNA结合蛋白基因的分离结合蛋白基因的分离结合蛋白基因的分离结合蛋白基因的分离 5 5、信号传递蛋白基因的分离、信号传递蛋

36、白基因的分离、信号传递蛋白基因的分离、信号传递蛋白基因的分离 6 6、图位克隆技术（、图位克隆技术（、图位克隆技术（、图位克隆技术（Map-basedcloningMap-basedcloning）利用表达文库利用表达文库利用酵母单杂交利用酵母单杂交第23页，讲稿共47张，创作于星期二Promoterstructure3noncodingregion5noncodingregioncodingregionPromoter regionPromoter region0 ATG-75-25TATACAATEnhancerSilencerOthercontrolsequenceCoreCore pr

37、omoterpromoterTerminationsignal第24页，讲稿共47张，创作于星期二DNA 结合蛋白结合蛋白第25页，讲稿共47张，创作于星期二a.a.DNADNADNADNA结合域结合域结合域结合域 -DNAbindingdomainDNAbindingdomain，简称，简称，简称，简称DNA-BDDNA-BD，它可识别效应，它可识别效应，它可识别效应，它可识别效应基因上游的一段特定的区段，基因上游的一段特定的区段，基因上游的一段特定的区段，基因上游的一段特定的区段，即上游激活序列即上游激活序列即上游激活序列即上游激活序列(up-stream(up-streamactivat

38、ingsequence,UAS)activatingsequence,UAS)，并与之结合。，并与之结合。，并与之结合。，并与之结合。b.b.转录激活域转录激活域转录激活域转录激活域-TranscriptionalactivationdomainTranscriptionalactivationdomain，简称，简称，简称，简称ADAD，它通，它通，它通，它通过同转录机过同转录机过同转录机过同转录机(transcriptionmachinery)(transcriptionmachinery)中的其它成分的结合作用，中的其它成分的结合作用，中的其它成分的结合作用，中的其它成分的结合作用，启动

39、启动启动启动UASUAS下游的基因进行转录下游的基因进行转录下游的基因进行转录下游的基因进行转录。转录因子的两个主要结构域：转录因子的两个主要结构域：转录因子的两个主要结构域：转录因子的两个主要结构域：第26页，讲稿共47张，创作于星期二 酵酵酵酵母母母母单单单单杂杂杂杂交交交交(yeast(yeast(yeast(yeast one one one one hybrid)hybrid)hybrid)hybrid)技技技技术术术术是是是是体体体体外外外外分分分分析析析析DNADNADNADNA与与与与细细细细胞胞胞胞内内内内蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质相相相相互互互互作作作作用用用用的的的的一一一

40、一种种种种方方方方法法法法，通通通通过过过过对对对对酵酵酵酵母母母母细细细细胞胞胞胞内内内内报报报报告告告告基基基基因因因因表表表表达达达达状状状状况况况况的的的的分分分分析析析析，来来来来鉴鉴鉴鉴别别别别DNADNADNADNA结结结结合合合合位位位位点点点点并并并并发发发发现现现现潜潜潜潜在在在在的的的的结结结结合合合合蛋蛋蛋蛋白白白白基基基基因因因因，或或或或对对对对DNADNADNADNA结结结结合合合合位位位位点点点点进进进进行行行行分分分分析析析析.运运运运用用用用此此此此技技技技术术术术，能能能能筛筛筛筛选选选选到到到到与与与与DNADNADNADNA结结结结合合合合的的的的蛋蛋

41、蛋蛋白白白白质质质质，并并并并可可可可直直直直接接接接从从从从基基基基因因因因文文文文库库库库中中中中得得得得到到到到编编编编码码码码该该该该蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的核核核核苷苷苷苷酸酸酸酸序序序序列列列列，而而而而无无无无需需需需复杂的蛋白质分离纯化操作复杂的蛋白质分离纯化操作复杂的蛋白质分离纯化操作复杂的蛋白质分离纯化操作 。目目目目前前前前认认认认为为为为真真真真核核核核生生生生物物物物的的的的转转转转录录录录起起起起始始始始需需需需要要要要转转转转录录录录因因因因子子子子的的的的参参参参与与与与。这这这这些些些些转转转转录录录录因因因因子子子子通通通通常常常常由由由由一一一一个

42、个个个DNADNADNADNA结结结结合合合合域域域域（BD)BD)BD)BD)和和和和一一一一个个个个或或或或多多多多个个个个与与与与其其其其他他他他调调调调控控控控蛋蛋蛋蛋白白白白相相相相互互互互作作作作用用用用的的的的转转转转录录录录激激激激活活活活域域域域（ADADADAD）组组组组成成成成。用用用用于于于于酵酵酵酵母母母母单单单单杂杂杂杂交交交交系系系系统统统统的的的的酵酵酵酵母母母母GAL4GAL4GAL4GAL4蛋蛋蛋蛋白白白白即是一种典型的转录因子。即是一种典型的转录因子。即是一种典型的转录因子。即是一种典型的转录因子。酵母单杂交酵母单杂交 Yeastone-hybridsys

43、tem第27页，讲稿共47张，创作于星期二 GAL4GAL4GAL4GAL4的的的的DNADNADNADNA结结结结合合合合域域域域靠靠靠靠近近近近羧羧羧羧基基基基端端端端,含含含含有有有有几几几几个个个个锌锌锌锌指指指指结结结结构构构构,可可可可激激激激活活活活酵酵酵酵母母母母半半半半乳乳乳乳糖糖糖糖苷苷苷苷酶酶酶酶的的的的上上上上游游游游激激激激活活活活位位位位点点点点(UAS);(UAS);(UAS);(UAS);而而而而转转转转录录录录激激激激活活活活结结结结构构构构域域域域可可可可与与与与RNARNARNARNA聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶或或或或转转转转录录录录因因因因子子子子TFII

44、DTFIIDTFIIDTFIID相相相相互互互互作作作作用用用用，提提提提高高高高RNARNARNARNA聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶的的的的活活活活性性性性.在在在在这这这这一一一一过过过过程程程程中中中中，DNADNADNADNA结结结结合合合合结结结结构构构构域域域域和和和和转转转转录录录录激激激激活活活活结结结结构构构构域域域域可可可可完完完完全全全全独独独独立立立立地地地地发发发发挥挥挥挥作作作作用用用用.据据据据此此此此，我我我我们们们们可可可可将将将将GAL4GAL4GAL4GAL4的的的的DNADNADNADNA结结结结合合合合结结结结构构构构域域域域置置置置换换换换为为为为其其其

45、其他他他他蛋蛋蛋蛋白白白白，只只只只要要要要他他他他能能能能与与与与我我我我们们们们想想想想要要要要了了了了解解解解的的的的目目目目的的的的基基基基因因因因相相相相互互互互作作作作用用用用，就就就就照照照照样样样样可可可可以以以以通通通通过过过过其其其其转转转转录录录录激激激激活活活活结结结结构域激活构域激活构域激活构域激活RNARNARNARNA聚合酶，从而启动对下游报告基因的转录。聚合酶，从而启动对下游报告基因的转录。聚合酶，从而启动对下游报告基因的转录。聚合酶，从而启动对下游报告基因的转录。正正正正是是是是基基基基于于于于这这这这一一一一理理理理论论论论，酵酵酵酵母母母母单单单单杂杂杂杂

46、交交交交系系系系统统统统由由由由2 2 2 2部部部部分分分分组组组组成成成成：(1)(1)(1)(1)将将将将文文文文库库库库蛋蛋蛋蛋白白白白片片片片段段段段与与与与GAL4GAL4GAL4GAL4转转转转录录录录激激激激活活活活域域域域融融融融合合合合表表表表达达达达的的的的cDNAcDNAcDNAcDNA文文文文库库库库质质质质粒粒粒粒；(2)(2)(2)(2)含含含含有有有有目目目目的的的的基基基基因因因因和和和和下下下下游游游游报报报报告告告告基基基基因因因因的的的的报告质粒。报告质粒。报告质粒。报告质粒。首首首首先先先先将将将将报报报报告告告告质质质质粒粒粒粒整整整整合合合合入入入

47、入酵酵酵酵母母母母基基基基因因因因组组组组,产产产产生生生生带带带带有有有有目目目目的的的的基基基基因因因因的的的的酵酵酵酵母母母母报报报报告告告告株株株株；再再再再将将将将文文文文库库库库质质质质粒粒粒粒转转转转化化化化入入入入报报报报告告告告株株株株；若若若若存存存存在在在在文文文文库库库库蛋蛋蛋蛋白白白白与与与与目目目目的的的的基基基基因因因因相相相相互互互互作作作作用用用用,可可可可通通通通过过过过对对对对报报报报告告告告基基基基因因因因的的的的表表表表达达达达将将将将文文文文库库库库蛋蛋蛋蛋白白白白的的的的基基基基因因因因筛筛筛筛选选选选出出出出来来来来.第28页，讲稿共47张，创作

48、于星期二第29页，讲稿共47张，创作于星期二第30页，讲稿共47张，创作于星期二1 1、差异杂交筛选（、差异杂交筛选（、差异杂交筛选（、差异杂交筛选（differentialhybridizationscreeningdifferentialhybridizationscreening）2 2、mRNAmRNA差异显示差异显示差异显示差异显示(differentialdisplay)(differentialdisplay)3 3、DNADNA表达文库（表达文库（表达文库（表达文库（expressionlibraryexpressionlibrary）4 4、DNADNA结合蛋白基因的分离结合

49、蛋白基因的分离结合蛋白基因的分离结合蛋白基因的分离 5 5、信号传递蛋白基因的分离信号传递蛋白基因的分离信号传递蛋白基因的分离信号传递蛋白基因的分离 6 6、图位克隆技术（、图位克隆技术（、图位克隆技术（、图位克隆技术（Map-basedcloningMap-basedcloning）第31页，讲稿共47张，创作于星期二 酵母双杂交体系酵母双杂交体系酵母双杂交体系酵母双杂交体系酵酵酵酵母母母母双双双双杂杂杂杂交交交交体体体体系系系系(yeast(yeast-twotwohybridhybridsystem,system,Y2H)Y2H)是是是是上上上上一一一一世世世世纪纪纪纪九九九九十十十十年

50、年年年代代代代初初初初期期期期在在在在转转转转录录录录因因因因子子子子结结结结构构构构基基基基础础础础上上上上发发发发展展展展起起起起来来来来的的的的一一一一种种种种敏敏敏敏感感感感的的的的检检检检测测测测蛋蛋蛋蛋白质白质白质白质-蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质相互作用的方法，亦即是体内鉴定基因的方法。相互作用的方法，亦即是体内鉴定基因的方法。相互作用的方法，亦即是体内鉴定基因的方法。相互作用的方法，亦即是体内鉴定基因的方法。它它它它不不不不仅仅仅仅可可可可有有有有效效效效地地地地用用用用来来来来分分分分离离离离能能能能与与与与一一一一种种种种已已已已知知知知的的的的靶靶靶靶蛋蛋蛋蛋白白白白(tar