高效液相色谱培训教案课件.ppt

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1、关于高效液相色谱培训教案第1页，此课件共153页哦第一节第一节 高效液相色谱的特点高效液相色谱的特点 高效液相色谱法作为色谱分析法的一个分支，是在高效液相色谱法作为色谱分析法的一个分支，是在20世纪世纪60年代末期，在经典液年代末期，在经典液相色谱法和气相色谱法的基础上，发展起来的新型的分离分析技术。液相色谱包括传相色谱法和气相色谱法的基础上，发展起来的新型的分离分析技术。液相色谱包括传统的柱色谱、薄层色谱和纸色谱。统的柱色谱、薄层色谱和纸色谱。20世纪世纪50年代后气相色谱法在色谱理论研究和实验技术上迅速崛起，而年代后气相色谱法在色谱理论研究和实验技术上迅速崛起，而液相色谱技术仍停留在经典操

2、作方式，其操作繁琐，分析时间很长，因而未液相色谱技术仍停留在经典操作方式，其操作繁琐，分析时间很长，因而未受到重视。受到重视。20世纪世纪60年代以后，随气相色谱法对高沸点有机物分析局限性的逐渐显现，人们年代以后，随气相色谱法对高沸点有机物分析局限性的逐渐显现，人们又重新认识到液相色谱法可弥补气相色谱法的不足之处。又重新认识到液相色谱法可弥补气相色谱法的不足之处。因此，在因此，在20世纪世纪60年代后，高效液相色谱技术才有了很快的发展。年代后，高效液相色谱技术才有了很快的发展。第2页，此课件共153页哦高效液相色谱（高效液相色谱（high performance liquid chromato

3、graphy，HPLC）还可称为高压液相色谱（）还可称为高压液相色谱（high pressure liquid chromatography）、高速液相色谱（）、高速液相色谱（high speed liquid chromatography）、高分离度液相色谱（）、高分离度液相色谱（high resolution liquid chromatography）或现代液相色谱（）或现代液相色谱（modern liquid chromatography）。）。第3页，此课件共153页哦11906年由俄国植物学家Tsweet创立 植物色素分离植物色素分离见图示 2、20世纪20年代，许多植物化学家开始

4、采用色谱方法对植物提取物进行分离，色谱方法才被广泛的应用。3、3040年代发表了薄层色谱、纸色谱的论文 4、40年代瑞典科学家Tiselius等在分配液相色谱、吸附色谱和电泳领域取得了成果 5、50年代英国Martin和Synge建立GC色谱 6、60年代GC-MS联用分析已不能满足分析测试的要求 一、色谱法（一、色谱法（chromatograph）的起源和发展）的起源和发展第4页，此课件共153页哦图示固定相固定相CaCO3颗粒颗粒流动相流动相石油醚石油醚 植物色素混合物第5页，此课件共153页哦7、70年代年代HPLC崛起，气相色谱和高效液相色谱，逐步成为各行各业必不可少的分析崛起，气相色

5、谱和高效液相色谱，逐步成为各行各业必不可少的分析工具，广泛应用于各个生产领域。工具，广泛应用于各个生产领域。8、1975年，美国年，美国Dow化学公司的化学公司的H.Small等人首先提出的离子色谱的概念，在分等人首先提出的离子色谱的概念，在分离柱后加一个抑制柱，同年商品化的离子色谱仪问世。离柱后加一个抑制柱，同年商品化的离子色谱仪问世。9、1979年，美国依阿华州立大学年，美国依阿华州立大学J.S.Fritz等人提出的非抑制型离子色谱仪。等人提出的非抑制型离子色谱仪。10、20世纪世纪80年代以后，一种新型的色谱技术年代以后，一种新型的色谱技术毛细管电泳技术随之出现。毛细管电泳技术随之出现。

6、11、20世纪世纪90 年代以后，年代以后，ELSD一种新型的检测器出现，改变了弱紫外吸收物一种新型的检测器出现，改变了弱紫外吸收物质的梯度检测难题。质的梯度检测难题。12、20世纪世纪90 年代中期以后，用于年代中期以后，用于HPLC的的MS检测器开始普及，使液检测器开始普及，使液相进入定性的时代。相进入定性的时代。第6页，此课件共153页哦进入进入21世纪，世纪，HPLC在多个方面取得突破：在多个方面取得突破：Merck商品化的一体化柱，给人们一种全新的色谱柱概念。商品化的一体化柱，给人们一种全新的色谱柱概念。2004年，年，Waters提出了提出了UPLC的新概念，超高压液相色谱。借助小

7、颗粒的填料，特的新概念，超高压液相色谱。借助小颗粒的填料，特殊化的设计，实现超高效和快速、高通量的分析。殊化的设计，实现超高效和快速、高通量的分析。2004年年10月月13日，日，ESA公司向外界宣布了一项高效液相色谱的最新技术突公司向外界宣布了一项高效液相色谱的最新技术突破，破，Corona带电气溶胶检测器（带电气溶胶检测器（CAD）诞生，新一代的通用型检测器。）诞生，新一代的通用型检测器。2005年，岛津发布了第一个基于年，岛津发布了第一个基于Web的的HPLC系统。系统。HPLC向高通量、高灵敏、网络化、小型化发展。向高通量、高灵敏、网络化、小型化发展。第7页，此课件共153页哦二、色谱

8、法定义、分离基础和目的二、色谱法定义、分离基础和目的定义：利用各组分物理化学性质的不同，在流动相流定义：利用各组分物理化学性质的不同，在流动相流 经固定相时，由于各组分在两相间的吸附、分经固定相时，由于各组分在两相间的吸附、分 配配或或其它亲和力的差异而产生不同速度的移其它亲和力的差异而产生不同速度的移 动动，最终达到分离的目的。图例最终达到分离的目的。图例分离基础：差速迁移分离基础：差速迁移 (例例:赛跑赛跑)目的：多组分分离，实现定性定量分析目的：多组分分离，实现定性定量分析第8页，此课件共153页哦图示分离机制：分离机制：各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心 利用吸附剂对不同组分的吸

9、附能力差异而实现分离吸附解吸再吸附再解吸无数次洗脱分开碳酸钙碳酸钙吸附剂吸附剂石油醚石油醚流动相流动相色素第9页，此课件共153页哦三、高效液相色谱与其它色谱方法的比较三、高效液相色谱与其它色谱方法的比较1.HPLC与经典与经典LC的比较的比较 从分析原理上讲，高效液相色谱法和经典液相（柱）色谱法从分析原理上讲，高效液相色谱法和经典液相（柱）色谱法没有本质的差别，但由于它采用了新型高压输液泵、高灵敏度检没有本质的差别，但由于它采用了新型高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，而使经典的液相色谱法焕发出新的活力。测器和高效微粒固定相，而使经典的液相色谱法焕发出新的活力。第10页，此课件共15

10、3页哦三、高效液相色谱与其它色谱方法的比较三、高效液相色谱与其它色谱方法的比较1.HPLC与经典与经典LC的比较的比较 经典液相（柱）色谱法使用粗粒多孔固定相，装填在大口径、经典液相（柱）色谱法使用粗粒多孔固定相，装填在大口径、长玻璃柱管内，流动相仅靠重力流经色谱柱，溶质在固定相的传长玻璃柱管内，流动相仅靠重力流经色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度缓慢，柱入口压力低，仅有低柱效，分析时间很长。质、扩散速度缓慢，柱入口压力低，仅有低柱效，分析时间很长。高效液相色谱法使用全多孔微粒固定相，装填在小口径、短不锈高效液相色谱法使用全多孔微粒固定相，装填在小口径、短不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵进入

11、高柱压的色谱柱，溶质在固定相钢柱内，流动相通过高压输液泵进入高柱压的色谱柱，溶质在固定相的传质，扩散速度大大加快，从而在短的分析时间内获得高柱效和高的传质，扩散速度大大加快，从而在短的分析时间内获得高柱效和高分离能力。分离能力。第11页，此课件共153页哦三、高效液相色谱与其它色谱方法的比较三、高效液相色谱与其它色谱方法的比较1.HPLC与经典与经典LC的比较见下表的比较见下表 方法项目高效液相色谱法经典液相色谱法色谱柱：柱长/cm 柱内径/mm10252101020010-50固定相粒度：粒径/m 筛孔/目55025003007560020030色谱柱入口压力/MPa2200.0010.1色

12、谱柱柱效/（理论塔板数/m）21035104250进样量/g10-610-2110分析时间/h0.051.0120第12页，此课件共153页哦2.HPLC与与GC的比较的比较 高效液相色谱法与气相色谱法有许多相似之处。气相色谱法具有选择高效液相色谱法与气相色谱法有许多相似之处。气相色谱法具有选择性高、分离效率高、灵敏度高，分析速度快的特点，但它仅适于分析蒸汽性高、分离效率高、灵敏度高，分析速度快的特点，但它仅适于分析蒸汽压低、沸点低的样品，而不适于分析高沸点有机物、高分子和热稳定性差压低、沸点低的样品，而不适于分析高沸点有机物、高分子和热稳定性差的化合物以及生物活性物质，因而使其应用受到限制。

13、在全部有机化合物的化合物以及生物活性物质，因而使其应用受到限制。在全部有机化合物中仅有中仅有20%的样品适用于气相色谱分析。高效液相色谱法却恰可弥补气的样品适用于气相色谱分析。高效液相色谱法却恰可弥补气相色谱法的不足之处，可对相色谱法的不足之处，可对80%的有机化合物进行分离和分析，此两种的有机化合物进行分离和分析，此两种方法的比较如下：方法的比较如下：不同色谱方法适用的分子量范围不同色谱方法适用的分子量范围 方法缩写方法全称分子量范围能检测的有机化合物的比重GPC凝胶渗透色谱1038085%HPLC高效液相色谱法400-2000GC气相色谱法104001520%第13页，此课件共153页哦2

14、.HPLC与与GC的比较的比较分析对象及范围流动相的选择操作条件GC能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，占有机物的20%流动相为有限的几种“惰性”气体，只起运载作用，对组分作用小加温常压操作HPLC溶解后能制成溶液的样品，高沸点、高分子量、难气化、离子型的稳定或不稳定化合物，占有机物的80%流动相为液体或各种液体的混合。它除了起运载作用外，还可通过溶剂来控制和改进分离。室温、高压下进行p相同相同：均为高效、高速、高选择性的色谱方法，兼具：均为高效、高速、高选择性的色谱方法，兼具分离和分析功能，均可以在线检测分离和分析功能，均可以在线检测 第14页，此课件共153页哦与经典液相色谱法相比与经典

15、液相色谱法相比 p颗粒极细（一般为颗粒极细（一般为10 m以下）、规则均匀的固定相，以下）、规则均匀的固定相，(键键合相合相)传质阻抗小，柱效高，分离效率高；传质阻抗小，柱效高，分离效率高；p高压输液泵输送流动相，流速快，分析速度快；高压输液泵输送流动相，流速快，分析速度快；p高灵敏度检测器，灵敏度大大提高。紫外检测器最小检测限可高灵敏度检测器，灵敏度大大提高。紫外检测器最小检测限可达达10 9g，而荧光检测器最小检测限可达，而荧光检测器最小检测限可达10 12g。四、高效液相色谱法的特点四、高效液相色谱法的特点第15页，此课件共153页哦与气相色谱法相比与气相色谱法相比p不受试样的挥发性和热

16、稳定性的限制，应用范围广；不受试样的挥发性和热稳定性的限制，应用范围广；p可选用各种溶剂作为流动相，对分离的选择性有很大作用，可选用各种溶剂作为流动相，对分离的选择性有很大作用，选择性高；选择性高；p一般在室温条件下进行分离，不需要高柱温。一般在室温条件下进行分离，不需要高柱温。第16页，此课件共153页哦优优点点：“三高”、“一快”、“一广”缺点：缺点：高选择性可将性质相似的组分分开 高效能反复多次利用组分性质的差异 产生很好分离效果 高灵敏度10-1110-13g，适于痕量分析 分析速度快几几十分钟完成分离 一次 可以测多种样品 应用范围广气体，液体、固体物质 对未知物分析的定性专属性差

17、需要与其他分析方法联用(GC-MS,LC-MS)第17页，此课件共153页哦p按分离机制分类：按分离机制分类：n分配色谱法分配色谱法n吸附色谱法吸附色谱法n离子交换色谱法离子交换色谱法 n空间排阻色谱法空间排阻色谱法第二节第二节 HPLC分类分类第18页，此课件共153页哦基本类型色谱法的分离机制 对于不同的分离机理，K的含义不同。吸附色谱 吸附系数 分配色谱 分配系数 离子交换色谱 离子交换系数 统称K 分子排阻色谱 分子排阻系数第19页，此课件共153页哦1.吸吸附附色色谱谱（液液-固固吸吸附附色色谱谱）：以以固固体体吸吸附附剂剂为为固固定定相相，如如硅硅胶胶、氧氧化化铝铝等等，较较常常使

18、使用用的的是是510m的的硅硅胶胶吸吸附附剂剂。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。2.分分配配色色谱谱（液液-液液分分配配色色谱谱）：早早期期通通过过在在担担体体上上涂涂渍渍一一薄薄层层固固定定液液制制备备固固定定相相,现现多多为为化化学学键键合合固固定定相相，即即用化学反应的方法通过化学键将固定液结合在担体表面。用化学反应的方法通过化学键将固定液结合在担体表面。第20页，此课件共153页哦 3.离离子子交交换换色色谱谱：固定相为离子交换树脂，流动相为无机酸或无机碱的水溶液。各种离子根据它们与树脂上的交换基团的交换能力的不同而得到分离。4.空间

19、排阻色谱（凝凝胶胶色色谱谱）以凝胶为固定相。凝胶是一种经过交联的、具有立体网状结构和不同孔径的多聚体的通称。如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶；第21页，此课件共153页哦（一）吸附色谱法（一）吸附色谱法要求要求：固定相吸附剂（硅胶或AL2O3）具表面活性吸附中心分离机制分离机制：见图示吸附系数吸附系数注：注：注：注：Ka a与组分的性质、吸附剂的活性、流动相的性质与组分的性质、吸附剂的活性、流动相的性质 及温度有关 next吸附平衡吸附平衡 X Xmm+nY+nYa aXa+nY+nYmm 第22页，此课件共153页哦图示分离机制：分离机制：各组分与流动相分子争

20、夺吸附剂表面活性中心 利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离吸附解吸再吸附再解吸无数次洗脱分开 back第23页，此课件共153页哦（二）分配色谱法（二）分配色谱法要求要求：固定相机械吸附在惰性载体上的液体 流动相必须与固定相不为互溶 载体惰性，性质稳定，不与固定相和流动相发生化学反应分离机制分离机制见图示 分配系数分配系数注：注：K K与组分的性质、流动相的性质、固定相的性质 以及柱温有关 next第24页，此课件共153页哦图示分离机制分离机制 利用组分在流动相和固定相间溶解度差别实现分离利用组分在流动相和固定相间溶解度差别实现分离 连续萃取过程 back第25页，此课件共153页哦

21、分配色谱法分类正相分配色谱：流动相的极性弱于固定相的极性反相分配色谱：流动相的极性强于固定相的极性正相分配色谱：极性强的组分后被洗脱。（库仑力和氢键力）反相分配色谱：极性强的组分先出柱。第26页，此课件共153页哦（三）离子交换色谱法（三）离子交换色谱法要求要求：固定相离子交换树脂 流动相水为溶剂的缓冲溶液被分离组分离子型的有机物或无机物分离机制见图示分离机制见图示选择性系数选择性系数 pp阳离子交换树脂阳离子交换树脂 RSORSO3 3-H+X+X+RSO RSO3 3-X X+H+H+注：K Ks s与离子的电荷数、水合离子半径、流动相性质、离与离子的电荷数、水合离子半径、流动相性质、离子

22、交换树脂性质以及温度有关子交换树脂性质以及温度有关 nextnext 固定离子固定离子固定离子固定离子可交换离子可交换离子可交换离子可交换离子待测离子待测离子待测离子待测离子第27页，此课件共153页哦图示分离机制：分离机制：依据被测组分与离子交换剂交换能力（亲和力）依据被测组分与离子交换剂交换能力（亲和力）不同而实现分离不同而实现分离 back第28页，此课件共153页哦（四）空间排阻色谱法（四）空间排阻色谱法要求要求：固定相多孔性凝胶 流动相水凝胶过滤色谱 流动相有机溶剂凝胶渗透色谱 分离机制见图示分离机制见图示渗透系数渗透系数 注：注：Kp p仅取决于待测分子尺寸和凝胶孔径大小，仅取决于

23、待测分子尺寸和凝胶孔径大小，与流动相的性质无关与流动相的性质无关 next next第29页，此课件共153页哦图示分离机制分离机制：利用被测组分分子大小不同、在固定相上选择性利用被测组分分子大小不同、在固定相上选择性 渗透实现分离渗透实现分离 back第30页，此课件共153页哦 结论：结论：p四种色谱的分离机制各不相同，分别形成吸附平衡、分配平衡、离子交换平衡和渗透平衡 K分别为吸附系数，狭义分配系数，选择性系数和 渗透系数p除了凝胶色谱法中的K仅与待测分子大小尺寸、凝胶 孔径大小有关外，其他三种K值都受组分的性质、流 动相的性质、固定相的性质以及柱温的影响第31页，此课件共153页哦按固

24、定相的固定方式分：按固定相的固定方式分：平面色谱平面色谱 纸色谱 薄层色谱 高分子薄膜色谱柱色谱柱色谱 填充柱色谱 毛细管柱色谱 第32页，此课件共153页哦按溶质在色谱柱洗脱的动力学过程分类：按溶质在色谱柱洗脱的动力学过程分类：洗脱法洗脱法 前沿法前沿法置换法置换法第33页，此课件共153页哦 洗脱法（洗脱法（elution method）又称淋洗法，将含有不同组分的样品注又称淋洗法，将含有不同组分的样品注入色谱柱，流动相连续流过色谱柱，并携带样品组分在柱内向前移动，经色谱入色谱柱，流动相连续流过色谱柱，并携带样品组分在柱内向前移动，经色谱分离后，样品中不同组分依据与固定相和流动相相互作用的

25、差别，而顺序流出分离后，样品中不同组分依据与固定相和流动相相互作用的差别，而顺序流出色谱柱。色谱柱。前沿法（前沿法（frontal method）又称迎头法，如将含三个等量组分的样品溶于流动相，又称迎头法，如将含三个等量组分的样品溶于流动相，组成混合物溶液，并连续注入色谱柱，由于溶质的不同组分与固定相的作用力不同，则与组成混合物溶液，并连续注入色谱柱，由于溶质的不同组分与固定相的作用力不同，则与固定相作用最弱的第一个组分首先流出，其次是第二个组分与第一个组分混合流出，最后固定相作用最弱的第一个组分首先流出，其次是第二个组分与第一个组分混合流出，最后是与固定相作用最强的第三个组分与第二个组分和第

26、一个组分混合一起流出。此法仅第一是与固定相作用最强的第三个组分与第二个组分和第一个组分混合一起流出。此法仅第一个组分的纯度较高，其他流出物皆为混合物，不能实现各个组分的完全分离。个组分的纯度较高，其他流出物皆为混合物，不能实现各个组分的完全分离。置换法（置换法（displacement method）又称顶替法，当含有三种组分的混合物又称顶替法，当含有三种组分的混合物样品注入色谱柱后，各组分皆与固定相有强作用力，若使用一般流动相无法将他们洗样品注入色谱柱后，各组分皆与固定相有强作用力，若使用一般流动相无法将他们洗脱下来，为此可使用一种比样品组分与固定相间作用力更强的置换剂（或称顶替剂）脱下来，

27、为此可使用一种比样品组分与固定相间作用力更强的置换剂（或称顶替剂）作流动相，当他注入色谱柱后，可迫使滞留在柱上的各个组分，依其与固定相作用力作流动相，当他注入色谱柱后，可迫使滞留在柱上的各个组分，依其与固定相作用力的差别而依次洗脱下来，且各谱带皆为各个组分的纯品。的差别而依次洗脱下来，且各谱带皆为各个组分的纯品。第34页，此课件共153页哦第三节第三节 高效液相色谱法的应用范围和局限性高效液相色谱法的应用范围和局限性 一、应用范围一、应用范围 高效液相色谱法适于分析高沸点不易挥发的、受热不稳定高效液相色谱法适于分析高沸点不易挥发的、受热不稳定易分解的、分子量大、不同极性的有机化合物；生物活性物

28、质易分解的、分子量大、不同极性的有机化合物；生物活性物质和多种天然产物；合成的和天然的高分子化合物等。和多种天然产物；合成的和天然的高分子化合物等。涉及石油化工产品、食品、合成药物、生物化工产品及涉及石油化工产品、食品、合成药物、生物化工产品及环境污染物等，约占全部有机化合物的环境污染物等，约占全部有机化合物的80%。其余。其余20%的的有机化合物，包括永久性气体，易挥发低沸点及中等分子量的有机化合物，包括永久性气体，易挥发低沸点及中等分子量的化合物，只能用气相色谱法进行分析。化合物，只能用气相色谱法进行分析。依据样品分子量和极性则要选择相应的依据样品分子量和极性则要选择相应的HPLC分离方法

29、。分离方法。第35页，此课件共153页哦极性增加极性增加不溶于水不溶于水溶于水溶于水非极性非极性离子离子非离子极性非离子极性吸附吸附反向反向分配分配分配分配正向正向分配分配离子离子交换交换尺寸尺寸排阻排阻凝胶凝胶渗透渗透凝胶凝胶过滤过滤分分子子量量化学、生物学和医学等化学、生物学和医学等应用广泛。如氨基酸、应用广泛。如氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳蛋白质、核酸、烃、碳水化合物、药品、多糖、水化合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、高聚物、农药、抗生素、胆固醇、金属有机物等胆固醇、金属有机物等分析，大多分析，大多(80%)是通是通过过HPLC来完成的。来完成的。应用应用各种各种HPLC方法的应用

30、范围及对象方法的应用范围及对象第36页，此课件共153页哦二、方法的局限性二、方法的局限性 高效液相色谱法虽具有应用范围广等的优点，但也有下述局限性：1、在高效液相色谱法中，使用多种溶剂作为流动相，当进行分析时所需成本高于气相色谱法，且易引起环境污染。当进行梯度洗脱操作时，它比气相色谱法的程序升温操作复杂。2、高效液相色谱法中缺少如气相色谱法中使用的通用型检测器（热导检测器和氢火焰离子化检测器）。3、高效液相色谱法不能替代气相色谱法，去完成要求柱效高达10万块理论塔板数以上，必须用毛细管气相色谱法分析组成复杂的具有多种沸程的石油产品。4、高效液相色谱法也不能代替中、低压柱色谱法，在200kPa

31、至1MPa柱压下去分析受压易分解、变形的具有生物活性的生化样品。第37页，此课件共153页哦 综上所述可知，高效液相色谱法也和任何一种常用的分析方综上所述可知，高效液相色谱法也和任何一种常用的分析方法一样，都不可能十全十美，作为使用者在掌握了高效液相色谱法一样，都不可能十全十美，作为使用者在掌握了高效液相色谱法的特点，使用范围和局限性的前提下，充分利用高效液相色谱法的特点，使用范围和局限性的前提下，充分利用高效液相色谱法的特点，就可在解决实际分析任务中发挥重要的作用。法的特点，就可在解决实际分析任务中发挥重要的作用。第38页，此课件共153页哦第二章第二章 高效液相色谱基本概念高效液相色谱基本

32、概念一、什么是高效液相色谱？一、什么是高效液相色谱？二、色谱过程二、色谱过程三、常用的基本术语三、常用的基本术语第39页，此课件共153页哦High Performance Liquid Chromatography，高效液相，高效液相色谱法，简称：色谱法，简称：HPLC。是一种区别于经典液相色谱；基于仪器方。是一种区别于经典液相色谱；基于仪器方法的高效能分离手段：高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵法的高效能分离手段：高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以及高灵敏度的检测器。以及高灵敏度的检测器。广泛应用于各个领域：医药广泛应用于各个领域：医药/环保环保/石化石化/生命科学生命科学/食品

33、及农食品及农业业 在技术，理论及应用上仍处于发展阶段。在技术，理论及应用上仍处于发展阶段。一、什么是高效液相色谱？一、什么是高效液相色谱？第40页，此课件共153页哦二、色谱过程二、色谱过程色谱过程：指物质分子（被分离组分分离组分）在相对运动的 两相（流动相流动相和固定相固定相）中的“分配”平衡过程以吸附色谱为例见图示色谱过程：吸附 解吸再吸附 再解吸 反复多次洗脱被测组分分配系数不同 差速迁移 分离第41页，此课件共153页哦图示p吸附能力弱的组分先流出 吸附能力强的组分后流出p组分的结构和性质微小差异 与固定相作用差异 随流动相移动的速度不等 差速迁移 色谱分离。第42页，此课件共153页

34、哦三、常用的基本术语三、常用的基本术语1、流出曲线和色谱峰2、基线、噪音和漂移3、峰宽柱效参数4、峰高和峰面积定量参数5、保留值定性参数6、分配系数和容量因子相平衡参数7、等温线8、分离因子和分离度分离参数第43页，此课件共153页哦1流出曲线和色谱峰流出曲线和色谱峰p流出曲线（色谱图流出曲线（色谱图 chromagtogram）：电信号强 度随时间变化曲线p色谱峰色谱峰(peak)：流出曲线上突起部分第44页，此课件共153页哦2基线、噪音和漂移基线、噪音和漂移 base line,noise and drift基线基线：仅有流动相通过检测器时产生 的信号曲线。反映检测器噪音 随时间变化的曲

35、线 （稳定平直直线）噪音噪音：仪器本身所固有的，以噪音 带表示（仪器越好，噪音越小）漂移漂移：基线向某个方向稳定移动 （仪器未稳定造成）第45页，此课件共153页哦3峰宽峰宽 peak width：色谱柱效参数色谱柱效参数p峰宽峰宽W：色谱峰两侧拐点切线与基线相交的截距p标准差标准差：为正态分布曲线两拐点间距离的一半。对应0.607h处峰宽的一半注：小，峰窄，柱效高p半峰宽半峰宽W1/2：峰高一半处所对应的峰宽p 注：除了用于衡量柱效，还可以计算峰面积注：除了用于衡量柱效，还可以计算峰面积第46页，此课件共153页哦图示第47页，此课件共153页哦p峰高(peak height；h)：组分在柱

36、后出现浓度极大时的检测信号，即色谱峰顶至基线的距离。p峰面积(peak area；A)：色谱曲线与基线间包围的面积。4峰高和峰面积：峰高和峰面积：色谱定量参数色谱定量参数第48页，此课件共153页哦5保留值：保留值：色谱定性参数色谱定性参数保保留留时时间间 retention time,tR：从进样开始到组分出现浓度极大点时所需时间，即组分通过色谱柱所需要的时间死死时时间间dead time,t0：不被固定相滞留组分的保留时间，相当于流动相到达检测器所需要的时间调调整整保保留留时时间间tR：组分由于和固定相作用，比不作用的组分在柱中多停留的时间，即组分在固定相中滞留的时间。等于组分的保留时间与

37、死时间之差值表示组分在色谱固定相内滞留状态的参数表示组分在色谱固定相内滞留状态的参数（1）时间表示的保留值）时间表示的保留值第49页，此课件共153页哦图示第50页，此课件共153页哦续前保留体积保留体积VR：从进样开始到组分出现浓度极大点时所需要的 流动相的体积。VR与tR和Fc（流动相流速mL/min）的关系 死体积死体积V0：由进样器至检测器的流路中未被固定相占有的空间 体积。包括从进样器到色谱柱导管的体积、固定相的孔隙及颗 粒间隙、柱出口导管及检测器内腔体积的总和。（2）用体积表示的保留值）用体积表示的保留值第51页，此课件共153页哦续前调整保留体积调整保留体积VR：保留体积与死体积

38、之差，即组分 停留在固定相时所消耗流动相的体积第52页，此课件共153页哦6分配系数和容量因子：相平衡参数分配系数和容量因子：相平衡参数 分配系数分配系数K（partition coefficient,平衡常数）：指在一定温度和压力下，组分在色谱柱中达分配平衡后，在固定相与流动相中的浓度比注：注：注：注：K K为热力学常数为热力学常数 与组分性质、固定相性质、流动相性质及温度有关与组分性质、固定相性质、流动相性质及温度有关 实验条件固定，实验条件固定，K K仅与组分性质有关仅与组分性质有关pp不同分离机理的色谱中，不同分离机理的色谱中，K K名称虽有所不同，但物理意义都名称虽有所不同，但物理意

39、义都 一样，表示平衡状态下两相中浓度之比一样，表示平衡状态下两相中浓度之比第53页，此课件共153页哦讨论：讨论：色谱条件一定时，tR主要取决K的大小 （色谱法基本的定性参数）K，tR，组分后出柱 K=0，组分不保留 K，组分完全保留p分配系数K不容易获得，不常用tR（保留时间）与（保留时间）与K（分配系数）的关系：（分配系数）的关系：第54页，此课件共153页哦p容量因子容量因子（capacity factor,容量比，分配比）k：在平衡状态下，组分在固定相与流动相中的质量比第55页，此课件共153页哦 色谱分离前提色谱分离前提各组分分配系数不等各组分分配系数不等 注：应选择合适分离条件使得

40、难分离的组分K不等2 2）色谱条件（）色谱条件（s s，mm，T T）一定时，）一定时，K K一定一定 t tR一定一定 1）组分一定，K不等的前提 s和m改变 T改变第56页，此课件共153页哦7、等温线：、等温线：定义：指一定温度下，组分在两相中分配达平衡时，在两相指一定温度下，组分在两相中分配达平衡时，在两相 中的浓度关系曲线，即中的浓度关系曲线，即cs对对cm的关系曲线的关系曲线 图示图示(1)线性等温线线性等温线（理想）（理想）对称峰对称峰(2)非线性等温线非线性等温线凸形凸形拖尾峰拖尾峰（常见）（常见）凹形凹形前沿峰前沿峰固定相表面活性吸附中心未达饱和，K一定，与溶质浓度无关 固定

41、相表面吸附中心活性不均，溶质分子先占据强吸附中心再占据弱吸附中心，K随着溶质浓度的增加而减小 溶质与固定相作用，改变其表面性质，K随着溶质浓度的增加而增加 第57页，此课件共153页哦斜率斜率斜率斜率=K=K线性：线性：线性：线性：对称峰对称峰对称峰对称峰凹形：凹形：凹形：凹形：前沿峰前沿峰前沿峰前沿峰凸形：凸形：凸形：凸形：拖尾峰拖尾峰拖尾峰拖尾峰第58页，此课件共153页哦对称因子对称因子：（拖尾因子）：（拖尾因子）正常峰（对称）正常峰（对称）非正常峰非正常峰 前沿峰前沿峰 拖尾峰拖尾峰色谱峰色谱峰fs在0.951.05之间fs小于0.95fs大于1.05p 对称因子对称因子(symmet

42、ry factor)衡量色谱峰对称性衡量色谱峰对称性第59页，此课件共153页哦8.分离因子和分离度：分离因子和分离度：分离参数 描述相邻组分分离状态的指标描述相邻组分分离状态的指标（1）分离因子（分配系数比或选择性系数）定义：两种物质调整保留值之比p分离因子1是色谱分离的必需条件第60页，此课件共153页哦（2）分离度（）分离度（resolution,R）：衡量色谱分离条件优劣的参数定义：相临两组分间峰顶间距离是峰底宽平均值的几倍定义：相临两组分间峰顶间距离是峰底宽平均值的几倍第61页，此课件共153页哦讨论讨论p设色谱峰为正常峰，W1W2=4 第62页，此课件共153页哦第三章第三章 HP

43、LC仪器介绍仪器介绍第63页，此课件共153页哦第64页，此课件共153页哦第65页，此课件共153页哦p高压输液系统：高压输液系统：储液罐、吸滤器、高压储液罐、吸滤器、高压 输液泵、输液泵、脱气装置脱气装置及梯度洗脱装置及梯度洗脱装置p进样系统：进样系统：进样器，进样阀进样器，进样阀p分离系统：分离系统：色谱柱，恒温箱色谱柱，恒温箱p检测系统：检测系统：检测器检测器p数据处理和计算机控制系统数据处理和计算机控制系统：记录装置、色谱工记录装置、色谱工作站作站第66页，此课件共153页哦1、贮液器和吸滤器：、贮液器和吸滤器：一、一、高压输液系统高压输液系统贮液器贮液器:0.5-2L的玻璃瓶的玻璃

44、瓶溶剂吸滤器溶剂吸滤器:Ni合金，孔合金，孔约约0.45 m，防止颗粒物，防止颗粒物进入泵内。进入泵内。第67页，此课件共153页哦p流动相贮器俗称贮液瓶，它对大多数有机化合物呈流动相贮器俗称贮液瓶，它对大多数有机化合物呈化学惰性，耐酸碱腐蚀。常见质地为玻璃或塑料，化学惰性，耐酸碱腐蚀。常见质地为玻璃或塑料，容量约为容量约为0.50.5L L2.0L2.0L，通常无色透明，若流动相需通常无色透明，若流动相需避光，有棕色瓶供选择。贮液瓶放置位置要高于泵避光，有棕色瓶供选择。贮液瓶放置位置要高于泵体，以便保持一定的输液静压差。使用过程贮液瓶体，以便保持一定的输液静压差。使用过程贮液瓶应密闭，以防溶

45、剂蒸发引起流动相组成的改变和防应密闭，以防溶剂蒸发引起流动相组成的改变和防止空气中的止空气中的O O2 2、COCO2 2重新溶解于已脱气的流动相中。重新溶解于已脱气的流动相中。第68页，此课件共153页哦2、高压输液泵、高压输液泵一、一、高压输液系统高压输液系统要求要求p流量准确可流量准确可调调、可调范围宽可调范围宽：流：流动动相流速在相流速在0.5-1.5mL/min，输输液液泵泵的最大流量的最大流量5-10mL/minp耐高耐高压压：输出压力常达输出压力常达30-60MPap液流稳定。液流稳定。p结构材料应耐化学腐蚀结构材料应耐化学腐蚀 第69页，此课件共153页哦第70页，此课件共15

46、3页哦活塞型往复泵活塞型往复泵液相色谱仪中使用最广泛的恒流泵液相色谱仪中使用最广泛的恒流泵 第71页，此课件共153页哦双活塞型往复泵双活塞型往复泵第72页，此课件共153页哦一、一、高压输液系统高压输液系统p在线真空脱气装置在线真空脱气装置3、脱气装置、脱气装置：将相对分子量小的气体从溶剂中除去将相对分子量小的气体从溶剂中除去第73页，此课件共153页哦p流动相在使用前必须进行脱气处理，目的是除去其流动相在使用前必须进行脱气处理，目的是除去其中溶解的气体。中溶解的气体。在装入贮液瓶之前必须经过在装入贮液瓶之前必须经过0.450.45m m或或0.220.22m m滤膜过滤。滤膜过滤。在洗脱过

47、程中如存在气泡会增在洗脱过程中如存在气泡会增加基线噪音，严重时使分析灵敏度降低。此外溶解加基线噪音，严重时使分析灵敏度降低。此外溶解在流动相中的氧气，会造成荧光猝灭，影响荧光检在流动相中的氧气，会造成荧光猝灭，影响荧光检测器的检测，还可能导致样品中某些组分被氧化或测器的检测，还可能导致样品中某些组分被氧化或使柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。常用使柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。常用的脱气方法有如下几种：的脱气方法有如下几种：第74页，此课件共153页哦p1 1超声波振动脱气超声波振动脱气 将欲脱气的流动相置放于超声将欲脱气的流动相置放于超声波提取器中，用超声波振荡波提取器中，用超声

48、波振荡10103030minmin。此法较简单、此法较简单、常用。常用。p2 2抽真空脱气抽真空脱气 用微型真空泵，降压至用微型真空泵，降压至0.050.050.070.07MpaMpa既可除去溶解的气体，使用水泵连接抽滤瓶和既可除去溶解的气体，使用水泵连接抽滤瓶和G G4 4微孔玻璃漏斗可以一起完成过滤机械杂质和脱气的微孔玻璃漏斗可以一起完成过滤机械杂质和脱气的双重任务。由于抽真空会引起混合溶剂组成的变化，双重任务。由于抽真空会引起混合溶剂组成的变化，故此法适用于单一溶剂的体系脱气。对于多元溶剂体故此法适用于单一溶剂的体系脱气。对于多元溶剂体系，每种溶剂应预先脱气后再进行混合，以保证混合系，

49、每种溶剂应预先脱气后再进行混合，以保证混合后的比例不变。后的比例不变。第75页，此课件共153页哦p3.3.加热回流脱气加热回流脱气 用于需要彻底脱气的流动相（电化学用于需要彻底脱气的流动相（电化学检测器），因为使用了回流冷凝器可减少挥发性组分的检测器），因为使用了回流冷凝器可减少挥发性组分的损失。此法的脱气效果较好，不提倡用于混合流动相。损失。此法的脱气效果较好，不提倡用于混合流动相。p4.4.吹氦脱气吹氦脱气 使用在液体中比空气溶解度低的氦气在使用在液体中比空气溶解度低的氦气在0.10.1MpaMpa压力下，以压力下，以6060mL/minmL/min的流速缓缓地通过流动相的流速缓缓地通过

50、流动相10101515minmin，赶去溶入的气体。此法适用于所有的溶剂，赶去溶入的气体。此法适用于所有的溶剂，脱气效果较好，但价格较贵。脱气效果较好，但价格较贵。p5 5真空在线脱气真空在线脱气 把真空脱气装置串接到贮液系统中，把真空脱气装置串接到贮液系统中，并结合膜过滤器，实现流动相在进入输液泵前的连续真并结合膜过滤器，实现流动相在进入输液泵前的连续真空脱气。此法可适用于多元溶剂体系。空脱气。此法可适用于多元溶剂体系。第76页，此课件共153页哦一、一、高压输液系统高压输液系统4、梯度洗脱装置：、梯度洗脱装置：为什么要进行梯度洗脱？为什么要进行梯度洗脱？使保留值相差很大的多种成分在合理使保