实验三线粒体及叶绿体的提取讲稿.ppt

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1、 关于实验三线粒体及叶绿体的提取第一页，讲稿共二十五页哦 分离叶绿体和线粒体的意义分离叶绿体和线粒体的意义1.分离和制备有活性的离体叶绿体分离和制备有活性的离体叶绿体是研究叶绿体的结构功能、光合作是研究叶绿体的结构功能、光合作用原理及遗传控制机理的前提。用原理及遗传控制机理的前提。2.对线粒体结构与功能的研究通常是在对线粒体结构与功能的研究通常是在离体的线粒体离体的线粒体上进行的。上进行的。第二页，讲稿共二十五页哦 实验目的实验目的1.掌握掌握差速离心技术分离细胞器差速离心技术分离细胞器的一般原理和方的一般原理和方法。法。2.对分离得到的对分离得到的叶绿体及线粒体进行观察叶绿体及线粒体进行观察

2、及及活活性鉴定性鉴定。第三页，讲稿共二十五页哦 实验原理实验原理1.差速离心差速离心匀浆、超声、研磨使细胞膜破裂，释放各种细胞器匀浆、超声、研磨使细胞膜破裂，释放各种细胞器在一定的离心力下，不同细胞器的沉降速度不同。在一定的离心力下，不同细胞器的沉降速度不同。用用不同的离心力不同的离心力，将各种不同亚细胞组分分离。，将各种不同亚细胞组分分离。第四页，讲稿共二十五页哦 细胞核细胞核/叶绿体、线粒体叶绿体、线粒体/溶酶体溶酶体/过氧化物酶体、微体、核糖体等。过氧化物酶体、微体、核糖体等。由于细胞核与叶绿体的沉降速度相近，二者通过离心的方法较难分离。由于细胞核与叶绿体的沉降速度相近，二者通过离心的方

3、法较难分离。第五页，讲稿共二十五页哦 2.细胞器的分离介质和条件细胞器的分离介质和条件采用缓冲溶液采用缓冲溶液,接近细胞质的分散相接近细胞质的分散相,保持细胞器的结保持细胞器的结构和酶的活性；构和酶的活性；叶绿体用叶绿体用0.35 M氯化钠氯化钠或或0.4 M蔗糖溶液；蔗糖溶液；线粒体用线粒体用0.25 M蔗糖溶液；蔗糖溶液；整个操作过程样品要保持在整个操作过程样品要保持在0-4,避免酶失活。避免酶失活。第六页，讲稿共二十五页哦 3.对分离的细胞器进行鉴定对分离的细胞器进行鉴定叶绿体叶绿体用用0.01%吖啶橙吖啶橙荧光染料荧光染料线粒体线粒体用用1%詹纳斯绿詹纳斯绿B染液染液鉴定活性和纯度。鉴

4、定活性和纯度。第七页，讲稿共二十五页哦 实验材料实验材料（一）器材：（一）器材：普通离心机,研钵,天平,载玻片,盖玻片,滤纸,试管,试管架,移液管,滴管,烧杯,离心管（二）材料：（二）材料：菠菜叶片,玉米黄化苗（三）（三）试剂试剂：提取缓冲液：2 mM Na2-EDTA;50 mM 三羟甲基氨基甲烷(Tris)-盐酸缓冲液(pH7.4),0.5%BSA(用前加入)0.35 M 氯化钠-提取缓冲液,0.25 M 蔗糖-提取缓冲液，1%詹纳斯绿B(Janus green B)染液0.3 M甘露醇溶液第八页，讲稿共二十五页哦 实验步骤实验步骤.菠菜叶绿体的分离菠菜叶绿体的分离1.选取新鲜的菠菜嫩叶选

5、取新鲜的菠菜嫩叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称称3 g置于研钵中，加入置于研钵中，加入15 ml 0.35 M氯化钠提取缓冲溶液氯化钠提取缓冲溶液。2.研磨成匀浆。研磨成匀浆。3.用用6层纱布过滤层纱布过滤,滤液盛于烧杯中。滤液盛于烧杯中。4.取滤液取滤液12ml在在1000 r/min下离心下离心 2 min，弃去沉淀弃去沉淀。5.将上清液在将上清液在3000 r/min下离心下离心 5 min，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）。沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）。6.沉淀用沉淀用1 ml 0.35 M氯化钠提取缓冲液氯化钠提取缓冲液悬浮。悬浮。7.取叶绿体悬液取叶绿体

6、悬液1滴置于载玻片上，加盖玻片后用普通光学显微镜观察。滴置于载玻片上，加盖玻片后用普通光学显微镜观察。使用荧光显微镜观察时，使用荧光显微镜观察时，将叶绿体悬液滴在无荧光的载玻片上，再滴加将叶绿体悬液滴在无荧光的载玻片上，再滴加1滴滴0.01%吖啶橙荧光染料，盖上无荧光的吖啶橙荧光染料，盖上无荧光的盖玻片。盖玻片。第九页，讲稿共二十五页哦 菠菜菠菜叶绿体叶绿体的分离实验流程图的分离实验流程图洗净、剪碎洗净、剪碎研磨，过滤研磨，过滤两次离心两次离心沉淀悬浮沉淀悬浮1000 rpm 2 min 取上清取上清3000 rpm 5 min叶绿体叶绿体15 ml 0.35 M氯化钠氯化钠-buffer1

7、ml0.35 M氯化钠-buffer3 g菠菜菠菜第一步低速离心：去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞光光学学显显微微镜镜第十页，讲稿共二十五页哦 玉米黄化幼苗玉米黄化幼苗线粒体线粒体的分离的分离1.玉米幼苗约玉米幼苗约5克克，加三倍体积（约，加三倍体积（约8 ml）0.25 M蔗糖蔗糖-提取缓冲提取缓冲液液，在预冷的研钵内，在预冷的研钵内快速快速研磨成匀浆。研磨成匀浆。2.8层纱布过滤层纱布过滤，滤液经，滤液经4 3000 g 离心离心 10 min,去除核和杂质。去除核和杂质。3.上清液用上清液用4 10000 g 离心离心10 min，沉淀为线粒体。沉淀为线粒体。4.沉淀用沉淀用

8、2 ml 0.25 M蔗糖蔗糖-提取缓冲液重悬提取缓冲液重悬，同上离心一次，同上离心一次(4 10000 g 离心离心10 min)。5.沉淀存于沉淀存于200 l 0.3M甘露醇甘露醇中。中。6.取分离的线粒体滴在载玻片上取分离的线粒体滴在载玻片上，滴加滴加 1%詹纳斯绿詹纳斯绿B溶液染色溶液染色10分钟后分钟后,用光学显微镜观察。用光学显微镜观察。第十一页，讲稿共二十五页哦 玉米黄化幼苗线粒体的分离实验流程图玉米黄化幼苗线粒体的分离实验流程图玉米黄化幼苗玉米黄化幼苗剪碎、研磨，过滤剪碎、研磨，过滤分成小管离心分成小管离心取上清离心取上清离心沉淀悬浮离心沉淀悬浮离心3000g 10min 1

9、0000g 10min200 l 0.3M 甘露醇甘露醇 5 g+8 ml 0.25M 蔗糖蔗糖-buffer詹纳斯绿詹纳斯绿B溶液染色溶液染色,观察观察4度10000g 10min沉淀悬浮沉淀悬浮第十二页，讲稿共二十五页哦 注意事项注意事项4人人/组组 2人人/叶绿体，叶绿体，2人人/线粒体线粒体注意：注意：离心机的平衡离心机的平衡!请用天平平衡！请用天平平衡！第十三页，讲稿共二十五页哦 小型常温离心机小型冷冻离心机第十四页，讲稿共二十五页哦 小型常温离心机小型冷冻离心机第十五页，讲稿共二十五页哦 第十六页，讲稿共二十五页哦 第十七页，讲稿共二十五页哦 取新鲜叶片，从叶片的下表面撕取表皮制成

10、装片，在普通显微镜及荧光显微镜下分别观察气孔及气孔周围的叶绿体。第十八页，讲稿共二十五页哦？线粒体詹纳斯绿？线粒体詹纳斯绿B染色染色第十九页，讲稿共二十五页哦 第二十页，讲稿共二十五页哦 结果与讨论结果与讨论结结果：果：1.绘图绘图并描述光并描述光镜镜下分离的叶下分离的叶绿绿体的形体的形态态及菠菜下表及菠菜下表皮中叶皮中叶绿绿体的形体的形态态。2.描述提取到的描述提取到的线线粒体的形状及染色情况（如粒体的形状及染色情况（如实验实验结结果不理想，分析造成果不理想，分析造成实验实验失失败败的原因。）的原因。）第二十一页，讲稿共二十五页哦 思考题思考题1.植物中分离纯化的叶绿素的酒精溶液在透射光下为

11、翠绿色，而在反射光下为棕红色。植物中分离出的叶绿体是否也有同样的现象？请从叶绿体的功能的角度解释为什么。2.在细胞器分级分离的实验中，叶绿体分离所用的等渗溶液势0.4 M的蔗糖，而分离线粒体却用0.25 M的蔗糖，请从两种细胞器功能上的差异解释为什么用不同浓度的等渗溶液。第二十二页，讲稿共二十五页哦 如何区别线粒体?Rcf(g）=1.118 X 10-5 X R（转子半径cm）X N 2（转速rpm）第二十三页，讲稿共二十五页哦 渗透压恰好能够阻止水分子通过半透膜从浓度较低的溶液移向浓度较高的溶液的在较高浓度溶液的液面上施加的额外压强称为渗透压。第二十四页，讲稿共二十五页哦 感谢大家观看第二十五页，讲稿共二十五页哦