兽疫链球菌的改良及其发酵生产透明质酸论文.docx

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1、学号：00810091117 常 州 大 学学硕 士 学 位位 论 文兽疫链球球菌的改改良及其其发酵生生产透明明质酸研究生孙晓慧指 导 教 师王利群 副教授授学科、专专业名称称有机化学学研究方向向生物有机机化学20100年3 月ImprroveedSttrepptoccocccusZZooeepiddemiicuss Foor PProdduciing Hyalluroonicc Accid By FerrmenntattionnA Diisseertaatioon SSubmmittted toChanngzhhouUUnivverssityyBySunXXiaoo-HuuiOrgaanic

2、c ChhemiistrryDissserttatiion Suppervvisoor:PProff. WWangg Li-QuunMarcch，220111常州大学学学位论论文原创性声声明本人郑重重声明：所呈交交的学位位论文是是本人在在导师指指导下独独立进行行的研究究工作及及取得的的研究成成果。除除文中已已经注明明引用的的内容外外，本论文不不含任何何其他个人或集体体已经发发表或撰撰写过的的作品成果果。对本文的的研究做做出重要要贡献的的个人和和集体，均已在论文中以明确方式标明。本人已完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名名：签字字日期：年月日学位论文文版权使使用授权权的说明明本学位论论

3、文作者者完全了了解常州州大学有有关保留留、使用用学位论论文的规规定，即即：研究究生在校校攻读学学位期间间论文工工作的知知识产权权单位属属常州大大学。学学校有权权保留并并向国家家有关部部门或机机构送交交论文的的复印件件和磁盘盘，允许许论文被被查阅和和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学位论文。保密论文文注释：本学位位论文属属于保密密范围，在在年解密后后适用本本授权书书。非保保密论文文注释：本学位位论文不不属于保保密范围围，适用用本授权权书。学位论文文作者签签名：签签字日期期：年月日导师签名名：签字字日期：年月日中文摘要要透明质酸酸(hyya

4、luuronnic aciid, HA)是由(-1,4)-D-葡葡糖醛酸酸-(-1,3)-N-乙乙酰-DD-氨基基葡糖的的双糖单单位重复复连接组组成的高高分子链链状聚合合物。HHA因其其特殊的的生物功功能学、独独特的流流体力学学特性和和极强的的持水保保湿性，广泛应用于医药、化妆品、食品等领域。本研究旨在筛选HA产生菌株，通过多种诱变育种的方法提高透明质酸的产量，并建立发酵液透明质酸含量的快速检测方法，对改良后菌种的培养条件进行优化，最后对菌种的透明质酸合成酶基因进行克隆和序列分析，为通过基因工程技术手段提高菌种HA产量打下基础。从1600份牛鼻鼻粘膜中中成功筛筛选到一一株野生生型产透透明质酸酸

5、菌株。样样品经梯梯度稀释释后涂布布血琼脂脂平板，观察菌菌落的形形态特征征和溶血血特征，筛筛选到一一株有荚荚膜的乙乙型溶血血链球菌菌。将该该菌株的的发酵液液多糖精提物和和HA标准准样的红红外谱图图进行对对比，特特征吸收收峰的位位置和形形状基本本相同，峰峰的相对对强度相相似，说说明该菌菌株为产产HA菌菌株。对透明质质酸含量量检测方方法CTTAB比比浊法和和Bittterr-Muuir法法进行优优化和比比较，并并用于发发酵液中中透明质质酸含量量的检测测，成功功建立了了一种更更快速、更精确确、更准确确、更高效效的透明明质酸检检测方法法。线性性回归方方程为y=0.000711x-0.110188，R=0

6、.999987。以筛选到到的菌株株为出发发菌株，经经过紫外外诱变得得到溶血血突变型菌菌株UVV1。以以突变菌株株作为出出发菌株株进行NNTG、微微波复合合诱变，筛筛选出一一株HAA产量明明显提高高的菌株株W2，产产量达到到1.4446gg/L，并并且遗传传稳定性性优良。对突变菌株的摇瓶发酵条件进行了初步优化，确定了最佳发酵条件为：温度35，初始pH值8.0，装液量50mL/250mL，转速180r/min，发酵时间20h时，HA产量达到1.86 g/L，比初始条件下提高了29%。在发酵过程中添加脯氨酸和葡萄糖酸钠可以提高HA产量，发酵10h时添加1g/L的脯氨酸，HA的产量提高至1.986g/

7、L；发酵12h时加入12.5 g/L葡萄糖酸钠作为补充碳源，HA的产量提高至2.267g/L。从筛选到到的产透透明质酸酸原始菌菌株中获获得其基基因组DDNA，以此为模板通过PCR扩增获得透明质酸合酶基因has A序列，用限制性内切酶EcoRI和BamHI对目的基因和质粒pET-22b进行双酶切，然后将目的基因与质粒pET-22b进行连接，转入E.coliDH5，得到转化子pET-22b-hasA，对转化子插入片段进行核酸序列分析，并与基因库中has A基因序列进行比对，为进一步通过基因工程手段改良菌种打下了良好的基础。关键词：透明质质酸；筛筛选；诱诱变；发发酵；基基因工程程ABSTTRACCT

8、Hyalluroonicc accid is a llineear maccrommoleecullar pollymeer wwhicch iis ccompprissed of altternnateed diisaccchaaridde uunitts oof DD-gllucuuronnic aciid aand N-aacettyl gluucossamiine by-1,3 aand-1, 4 glyycossidiic bbondds. Deppenddingg onn itts sspecciall phhysiioloogiccal chaaraccterrs, uniiqu

9、ee hyydroomecchannicaal ppropperttiess annd eexceelleent abiilitty oof hholddingg waaterr, HHA iis wiidellyussed in thee fiieldds oofphharmmacyy, ccosmmetiics andd foood etcc.Thhe ppurpposee off thhis stuudy wass tooscrreenn HAA- prroduucinng sstraain, too ennhannce thee yiieldd off HAAthrrouggh mmu

10、taatioon bbreeedinng, to esttabllishh a rappidmmethhod to anaalyzze tthe conncenntraatioon oof hhyalluroonicc accid in ferrmenntattionn brrothh,to opttimiize thee feermeentaatioon ccondditiionssof impprovved strrainn,annd tto cclonne aand anaalyzze tthe hyaalurroniidasse AA geene (haasA) seequeencee

11、 whhichh iss heelpfful to impprovve HHA yyeilld bby ggeneeticc ennginneerringg.One strrainn off hyyaluuronnic aciid-pprodduciing baccterria wass isslollateed ssucccesssfullly froom 1160 colllecctedd caattlle ttuniica muccosaa saamplles. Saamplles werre ccoatted on bloood agaar fflatt pllateesaftter

12、graadieent dillutiion, a strrainn off -hemmolyyticc sttrepptoccocccus witth ccapssulee waas iidenntiffieddby oobseervaatioon oof mmorpphpllogiicall annd hhemoolyttic prooperrtiees oof ccolooniees oon tthe plaatess.The inffrarred speectrrosccopyy off hyyaluuronnic aciid sstanndarrd aand ferrmenntatti

13、onn brrothh exxtraact of thee sccreeenedd baacteeriuumwaas ccomppareed, andd thhe ssizee, sshappe aand rellatiive inttenssityy off thheirr tyypiccal IRpeeakss arre ssimiilarr. TThesse rresuultss deemonnstrrateed tthatt thhe -heemollytiic sstreeptoococccussprooducces HA.The Bittterr-Muuir metthodd an

14、nd CCTABB tuurbiidimmetrric metthodd weere opttimiizedd too meeasuure thee coonceentrratiion of hyaalurroniic aacidd inn feermeentaatioon bbrotth. Thee reesullts shhoweed tthatt CTTAB metthodd iss suuperriorr too Biitteer-MMuirr meethood iin ttermms oof aaccuuraccy, preecisssioon aand effficiienccy.

15、 Thee reegreessiion equuatiion is y=0.000711x-0.110188, RR=0.9999887.Usinng tthe scrreenned baccterria as oriiginnal strrainn, aa heemollysiin ddefiicieent muttantt naamedd UVV1 wwas obttainned by ulttravviollet irrradiiatiion. UVV1 wwasmmutaateddsubbseqquenntlyy byy thhe ccombbinaatioon oof NNTG tr

16、eeatmmentt annd mmicrrowaave irrradiiatiion. A muttanttnammed W2 witth hhighherprroduuctiion cappaciity of hyaalurroniic aacidd waas sseleecteed ffromm alll mmutaantss byy annalyyzinng tthe HA conncenntraatioon iin ffermmenttatiion brooth. Thhe yyielld oof HHA wwas staablee affterr trranssferrrinng

17、ffivee geenerratiionss annd rreacchedd too 1.4466g/L. Itts ffermmenttatiion conndittionnsin shaakinng fflasskweere opttimiizeddpriimarrilyy. UUndeer tthe conndittionns off 355, ppH8.0, 50mmL ffermmenttatiion meddiumm inn 2550mLL fllaskk, sstirringg sppeedd 1880 rrpm andd thhe ffermmenttatiion timme

18、220 hh,the yieeld of HA reaacheed tto 11.866g/L. Coompaaredd too thhe oorigginaal ccondditiionss, tthe yieeld wass inncreeaseed bby 229%. Thhe aaddiing of proolinne aand soddiumm gllucoonatte dduriing thee feermeentaatioon pproccesss coouldd ehhancce tthe HA yieeld. Thhe HHA yyielld ccoulld rreacch

19、11.9886g/L thrrougghthhe aaddiitioon oof1g/L proolinne bby tthe timme oof 110 hhferrmenntattionn, aand couuld reaach 2.2267gg/L thrrouggh aaddiing112.55g/L ssodiium gluuconnatee ass a carrbonn soourcce ccompplemmentt byy thhe ttimee off 122 hffermmenttatiion.The gennomee DNNA wwas exttracctedd frrom

20、 thee orrigiinall sttraiin, andd thhegeene hassA waas oobtaaineed bby PPCR. Thhe rresttricctioon eenzyymessBammH Iandd EccoRIwerre sseleecteed tto ddigeest thee aiimedd geene DNAA seequeencee annd tthe vecctorr pEET-222b. Thenn thhe hhasAA geenewwas inssertted intto tthe vecctorr pEET-222b, annd tth

21、e reccombbinaant plaasmiid ppET-22bb-hassA wwas traansfformed intto EE.cooli DH55. Thee sequuencceoff innserrt ffraggmennt wwas anaalizzedaand commparred wwithh ottherrhassA ggenee seequeencees iin ggenee baank.Thee reesullts proovidded a ggoodd baasiss foor ffurttherr immproovinng sstraainss byy ge

22、enettic enggineeeriing.KEYWWORDDS:Hyalluroonicc accid; Sccreeeninng; Muttageenessis; Feermeentaatioon ; Geenettic enggineeeriing V目录1 绪论论11.1 透明质质酸的理理化性质质11.2 透明质质酸的分分布及生生理功能能11.2.1 透透明质酸酸的分布布11.2.2 透透明质酸酸生理功功能21.3 透明酸酸的应用用21.3.1在化化妆品中中的应用用21.3.2 在在医学方方面的应应用31.4 透明质质酸生产产现状331.4.1 获获得高产产菌株441.4.2 培培养

23、基及及发酵条条件优化化51.4.3 发发酵液中中透明质质酸含量量检测方方法51.4.4 透透明质酸酸的提取取61.5 课题研研究内容容和目的的61.5.1 本本课题研研究内容容61.5.2 本本课题主主要目的的72 透明明质酸产产生菌的的分离、筛筛选与初初步鉴定定82.1 实验材材料82.1.1 采采样82.1.2 主主要培养养基及溶溶液组成成82.2 实验方方法92.2.1 透透明质酸酸的分离离纯化992.2.2 菌菌种的筛筛选1002.2.3 菌菌种的初初步鉴定定102.3 实验结结果与讨讨论1112.3.1 菌菌种的筛筛选1112.3.2 菌菌种的分分类鉴定定132.4 本章小小结133

24、3 透明明质酸含含量检测测方法建建立1443.1 实验材材料1443.1.1 主主要仪器器143.1.2 主主要试剂剂143.2 实验方方法1553.2.1 透透明质酸酸的初步步纯化1153.2.2 CCTABB比浊法法153.2.3 改改良Biitteer-MMuirr法153.3 结果与与讨论1153.3.1 CCTABB比浊法法153.3.2 BBittter-Muiir法203.3.3 两两种方法法准确性性比较2223.3.4两种种方法精精确性比比较2223.3.5 两两种方法法直接测测定发酵酵液中HHA含量量的比较较233.4 本章小小结2334 透明明质酸高高产菌的的诱变选选育24

25、44.1 实验材材料2444.1.1 菌菌种2444.1.2 主主要培养养基及溶溶液2444.1.3 主主要仪器器254.2 实验方方法2554.2.1 LLiCll处理2554.2.2 紫紫外诱变变254.2.3 NNTG诱诱变2554.2.4 微微波诱变变264.2.5 紫紫外+NNTG诱诱变2664.2.6 紫紫外+NNTG+微波诱诱变2664.2.7 中中间培养养264.2.8 稀稀释涂板板264.2.9 突突变菌株株筛选2274.3.10 分析方方法2774.3 结果与与讨论2274.3.1 紫紫外诱变变最佳时时间的选选择2774.3.2 NNTG诱诱变最佳佳条件2284.3.3 微

26、微波诱变变最佳条条件选择择304.3.4 诱诱变结果果分析3304.4 本章小小结3335 透明明质酸发发酵法生生产工艺艺条件的的初步研研究3555.1 实验材材料3555.1.1 菌菌种3555.1.2 培培养基3355.2 实验方方法3665.2.1 发发酵条件件的优化化365.2.2 添添加剂对对发酵的的影响3375.3 结果与与讨论3375.3.1 发发酵条件件优化结结果3775.3.2 添添加剂的的影响4405.4 本章小小结4226 透明明质酸合合成酶基基因克隆隆与载体体构建初初步研究究436.1.1 菌菌株、质质粒4336.1.2培养养基4336.1.3 酶酶、化学学试剂4446

27、.1.4主要要实验试试剂配方方446.1.5 PPCR扩扩增用引引物4446.2 实验方方法4556.2.1 提提取兽疫疫链球菌菌总DNNA4556.2.2 目目的基因因的PCCR扩增增456.2.3 PPCR扩扩增DNNA片段段的回收收纯化4466.2.4感受受态细胞胞的制备备466.2.5 质质粒DNNA（PETT-222b）的的提取与与检测4476.2.6目的的基因片片段和质质粒的双双酶切4476.2.7 双双酶切产产物回收收476.2.8 双双酶切后后的目的的基因和和质粒连连接4886.2.9 重重组质粒粒PETT-222b导入入E.ccolii DHH5感感受态细细胞4886.2.1

28、0 重组质质粒的提提取4886.3 结果与与讨论4486.3.1 基基因组总总DNAA提取结结果4886.3.2 hhasAA片段的的PCRR扩增4996.3.3质粒粒DNAA（PETT-222b）的的提取结结果5006.3.4 hhasAA基因和和PETT-222b双酶酶切电泳泳检测5516.3.5 重重组质粒粒的表达达516.3.6 转转化子的的测序验验证5226.4 本章小小结5337 结论论与展望望54参考文献献56攻读硕士士学位期期间研究究成果660致谢6111 绪论1绪论透明质酸酸（Hyyaluuronnic aciid，简简称HAA），是是一种高高分子量量的直链链酸性粘多多糖11

29、。19334年，美美国Meeyerr 和Pallmerr2首次从从牛眼玻玻璃体中中分离提提取到透透明质酸酸，它是是由(-1,4)-D-葡葡糖醛酸酸-(-1,3)-N-乙乙酰-DD-氨基基葡糖的的双糖单单位重复复连接组组成的高高分子链链状聚合合物33,4。透明质质酸可以以吸收并并保持自自身重量量几千倍倍的水分分，是保保水性最最好的天天然物质质。透明明质酸主主要分布布在动物物和人体体组织的的细胞外外基质中中，对细细胞的稳稳定和运运动、增增殖、分分化以及及组织的的表现型型等都有有重要作作用。透透明质酸酸存在于于结缔组组织中，可可以满足足很多重重要功能能，如韧性性、支持持结构以以及细胞胞的代谢谢调节。

30、作为一种可吸收，可降解的生物材料，HA因其高度的黏弹性、可塑性、渗透性和良好的生物相容性，在医药、化妆品、食品领域中广泛应用5。我国每年透明质酸的需求量很大，但产量较低，供需缺口很大，其在国内外市场是一种紧俏产品，市场前景非常广阔。1.1透透明质酸酸的理化化性质HA具有有许多天天然粘多多糖共有有的性质质，有强强吸水性性，易溶于水而而不溶于于有机溶溶剂。在氯化化钠溶液液中会产生氢离离子（葡葡萄糖醛醛酸中的的-COOOH解离），从从而赋予予了HAA酸性粘粘多糖的的性质。透明质酸酸的相对对分子质质量约为为106，分子中中含有2200l00000个双糖糖。电子子显微镜镜下观察察HA呈线性性单链状状，在

31、水溶溶液中会会扩展为为随机的的线圈状状其直径径约为5500nnm。由由于直链链轴上单单糖之间间氢键相相互作用用，HAA分子在在空间上上呈刚性性的螺旋旋柱型，柱内侧因有大量羟基而产生强亲水性6。因螺旋空间外侧具有疏水性使这些水在螺旋柱内相对固定，不易流失。HA由于其大分子链的柔顺性而具有较强的成膜能力，可以形成一层保水薄膜。HA水溶溶液是一一种非牛牛顿型流流体，有有独特的的粘弹性性和应变变性77。GGibbbs88等发发现，低低浓度的的HA溶液液主要体体现为粘粘性，而而高浓度度溶液主主要体现现其弹性性。1.2透透明质酸酸的分布布及生理理功能1.2.1透明明质酸的的分布HA广泛泛存在于于人和动动物

32、的各各种组织织间质中中，如皮皮肤、脐脐带、眼眼玻璃体体、鸡冠冠、关节节滑液等等。HA也也是链球球菌和绿绿脓杆菌菌等菌株株荚膜的的主要成成份。不不同组织织获得的的HA分子子量可能能不同，但但它们之之间无种种属差异异并且对对人及动动物无抗抗原性。1.2.2透明明质酸生生理功能能HA是构构成细胞胞外基质质（ECCM）和和细胞间间质（IICM）的的主要成成分99。HA分分子中的的羧基和和其他极极性基团团可以与与水形成成氢键而而结合大大量水分分，可吸吸收和保保持其自自身重量量上千倍倍的水分分，有“天然保保湿因子子”(NMMF)的的美称。HA是天然存在于人体皮肤中的具保水功能的聚合物，具有较高的理论保水值

33、10。 HA的亲水作用使组织有一定的渗透压，从而维持组织的正常状态。HA作为为药物载载体111，具具有缓释释药物作作用和促促进药物物透皮吸吸收功能能。溶液液中HAA分子交交联形成成的网状状结构能能够粘附附药物分分子，减减缓药物物在体内内扩散速速度，产产生长效效、延效效作用。HA具有有促进创创面伤口口的愈合合122的作作用，低分子子量的HHA可以以促进血血管生成成，高分分子量的的HA可可以抗炎炎并调节节炎性细细胞，进进而促进进伤口愈愈合。小分子量量的HAA具有抑抑制病菌菌生长、抑抑制病原原反应的的功能，产产生抗菌菌消炎作作用。而而大分子子量的HHA由于于其成膜膜能力可可以在皮皮肤表面面形成一一层

34、水化化膜，将将皮肤与与细菌隔隔离开，阻阻止细菌菌侵入皮皮肤，间间接产生生抗菌消消炎作用用。HA对细细胞具有有多种作作用113,114如如保护细细胞并对对细胞的的吞噬功功能有一一定影响响，同时可可以屏蔽蔽细胞膜膜上的机机械感受受器，影影响细胞胞移动、增增殖和分分化等。1.3透透明酸的的应用透明质酸酸因其具具有特殊殊的生理理功能、独独特的流流变力学学特性以以及优良良的保湿湿能力，在在化妆品品工业、医医学临床床研究、食食品美容容保健品品行业等等领域有有着广泛泛的应用用。不同同分子量量的透明明质酸有有着不同同的用途途，中等等分子量量的HAA主要应应用于化化妆品，而而高分子子量的HHA可用用于眼科科粘性

35、手手术、治治疗关节节病、软软组织修修复和作作为药物物载体，特特别是在在预防和和减少外外科手术术后组织织粘连中中具有很很高的应应用价值值。1.3.1 在在化妆品品中的应应用水是生命命的源泉泉，是构构成生物物机体的的重要物物质，如如果没有有水，任任何生命命过程都都无法进进行。衰衰老的身身体会逐逐渐失去去水分，而而人体组组织保持持水分最最重要的的物质就就是透明明质酸，它它与蛋白白质的水水合作用用让人体体组织保保持大量量水分。当当在皮肤肤表面涂涂上含有有HA的的化妆品品时，HHA能快快速形成成一层具具有粘弹弹性的水水化膜，主主要作用用是保持持皮肤水水分并润润湿角质质层，对对促进皮皮肤吸收收护肤品品中其

36、它它活性营营养成分分有良好好的作用用，从而而保持皮皮肤年轻轻延缓衰衰老115。透明质质酸的天天然保湿湿特性，使使其成为为化妆品品中不可可缺少的的重要保保湿成分分166。阳光中的的紫外线线会使皮肤肤变红、变变黑、脱脱皮等，含透明质酸的护肤品可以通过促进表皮细胞的增殖和分化，清除自由基的作用，可促进受太阳灼伤部位皮肤的再生17。1.3.2在医医学方面面的应用用作为一种种天然降降解且具具吸收性性的生物物医学材材料，透透明质酸酸在医学学的各个个领域用用途非常常广泛。透明质酸酸含量在在很多疾疾病中会会出现明明显的升升高，可可以作为为诊断一一些疾病病的指标标。血清清中透明明质酸含含量水平平与肝脏脏疾病以以

37、及肝细细胞损害害程度呈呈密切相相关118。HA广泛泛应用于于眼科、鼻鼻科、喉喉科、骨骨科和普普外科等等方面19。HA稀溶溶液可用用于治疗疗干性角角膜炎综综合症20,21，因其其具有铺铺展湿润润能力，对对眼球起起润滑和和保护作作用。HA制剂剂可有效效治疗鼻鼻鼾和嗓音嘶嘶哑222。在外科科手术中中HA具具有术后后防粘连连的作用用，另外外，还可可用于耳耳鼓膜修修补手术术。HAA是关节节润滑和和关节软软骨基质质内的重重要成分分，可用用于骨关关节炎、肩肩周炎、类类风湿关关节炎的的治疗23。HA作为为一种药药物载体体，可将将各种药药物导向向各病理理部位并并定位释释放。并且可可以添加加透明质质酸酶抑抑制剂，

38、通通过抑制制透明质质酸酶的的活性而而使HAA不被分分解，达达到缓释释控释的的作用，从而维持正常的生理功能24。江德臣25等根据HA的电敏特性，设计了一种免疫传感器，在一定的离子强度和酸性范围内有较好的生物稳定性，有应用于临床医学的可能。1.4透透明质酸酸生产现现状目前国内内外常用用的制备备透明质质酸的方方法是动动物组织织提取法法和微生生物发酵酵法生产产HA。还还有一些些其它方方法，比比如，酶酶聚人工工合成法法、动物物胎细胞胞分离法法、蛋壳壳膜提取取法226等。国国内现有有的透明明质酸生生产厂家家大都是是用动物物组织提提取法，其其工艺过程程为脱水水、磨碎碎、浸泡泡、提取取、除杂杂、沉淀淀和分离离

39、。动物物组织提提取法工工艺流程程简单，但动物组织来源有限，且原料中HA含量低，产品收率低，提纯难，成本过高，产品质量差，难以用于大规模生产27。为了满足HA日益增长的市场需求，必须寻找HA的新来源，降低生产成本，这就促进了微生物发酵法生产HA的研究。发酵法生产HA生产成本低，产品的分子量和质量高，可工业化生产规模不受动物组织原料限制。发酵液中HA以游离状态存在，易于分离纯化，提纯效率高。HA产品无动物来源的致病菌污染的危险，增强了市场竞争力。发酵法生产HA的质量主要取决于三个方面：高产菌株的筛选，培养基成分及发酵条件优化，高效的分离提纯工艺28。1.4.1获得得高产菌菌株1.4.1.11 诱变

40、变育种诱变的目目的是为为了获得得HA产产量高、优优良性状状稳定的的菌株29。野生生型的链链球菌作作为HAA产生菌菌，首先先要经过过诱变使使其成为为溶血素素和透明明质酸分分解酶双双缺陷型型菌株。链链球菌基基本都会会产生溶溶血素，溶溶血素能能溶解红细细胞并杀杀死白细细胞，对对心脏也也有一定定的毒害害。目前前报道的的用作产产HA菌菌株的诱诱变剂主主要有紫紫外线，射线，NTG等30，为了使菌株稳定，不易发生回复突变，诱变剂应使遗传物质发生较大变化。Kim31等人用NTG诱变兽疫链球菌得到高产菌株，发酵产量为6g/L-7g/L。邓开野32筛选出一株溶血缺陷型的突变菌株，产量也比原始出发菌株有很大提高。野

41、生型产HA的链球菌在代谢分泌透明质酸的同时还会产生透明质酸分解酶，而透明质酸分解酶会将HA降解，或者降低透明质酸的分子量，因此在发酵生产HA过程中应去除透明质酸分解酶的影响。魏甲乾33利用重离子和紫外线相结合诱变筛选出溶血性和透明质酸酶双缺陷型变异菌株。1.4.1.22构建工工程菌传统的诱诱变存在在诱变率率低，工工作量大大，对产产量和分分子量提提高有限限，或者者不能兼兼顾的缺缺点。目目前国内内外从传传统的诱诱变育种种到定向向更为准准确的原原生质体体融合34和基因因工程技技术，实实现构建建HA产产量更高高的工程程菌。构构建工程程菌的方方法主要要有DNNA重组组、转基基因技术术和原生生质体融融合等

42、。基因工程程菌是采采用现代代生物工工程技术术加工出出来的菌菌株，具具有多功功能、高高效、遗遗传性状状稳定和和适应性性强等特特点。在在发酵过过程中工工程菌发发挥着重重要的功功能，大大大提高高了发酵酵效率。郝郝宁335等运用用基因诱诱变育种种将vggb基因因导入兽兽疫链球球菌以促促进细胞胞在低氧氧状态下下生长，同时在兽疫链球菌中过表达HA合成酶基因，增加HA合成的前体，使HA产量增加31%。曲凯36通过兽疫链球菌中与透明质酸合成有关的基因进行研究，分析了透明质酸生物合成途径，并分离了相关基因，为基因工程方法改造兽疫链球菌，提高其透明质酸产量提供了理论依据。Weigel37-39等先后从S. equ

43、lsinilis和S. pyogenes中克隆了HA合成酶基因，并将此基因转入大肠杆菌等宿主细胞中，用来生产HA。目前用于工业化生产的产HA基因工程菌是诺维信公司使用的枯草杆菌，该工程菌含HA合成酶基因和UDP-葡萄糖脱氢酶基因，产量为6.5g/L-7.5g/L，处于国际领先水平。1.4.2培养养基及发发酵条件件优化链球菌对对营养条条件要求求比较苛苛刻，HHA发酵酵培养基基包括碳碳源、氮氮源、无无机盐、维维生素、生长因子和添加剂等40。一般碳源使用葡萄糖41，而姚敏杰42选择不同碳源进行发酵生产HA对比，结论是只有蔗糖不能被利用，高海军43等发现蔗糖仅比葡萄糖的利用率低。氮源不仅为菌体生长提供

44、氮元素，很多有机氮源还能为微生物提供生长因子，从而促进其生长代谢。在氮源的选择上，培养基中添加复配的氮源比单一氮源效果更好，因为复配的氮源能提供不同生长因子进行互补，利于细胞生长。菌株不同，其最适的培养基也可能不一样，需要根据实验而定，但也要结合考虑成本及工业化等问题来选择培养基成分。发酵条件件是影响响HA产产量和相相对分子子质量的的关键因因素，适适宜的发发酵条件件不仅有有利于菌菌体的生生长，而而且可以以提高微微生物对对底物的的利用能能力，使使代谢向向着有利利于产物物合成的的方向进进行。发发酵条件件主要包包括温度度、pHH值、转转速、发发酵时间间、添加加剂和培培养方式式等。AArmsstroo

45、ng44等发现现，温度度高于或或低于337，HAA的产量量和相对对分子质质量都会会下降。根根据Miichaael45等人研研究，ppH为66.70.22时，HHA产量量最高。搅搅拌可以以强化气气-液间间氧的传传递，增增加发酵酵液中的的溶氧量量，发酵酵过程中中搅拌并并不明显显促进细细菌的生生长，但但能提高高HA的的产量。LLin Lonng446等报道道，通过过分批培培养和补补料分批批培养22种方式式结合培培养来提提高HAA的产量量。发酵酵过程中中，添加加表面活活性剂和和溶菌酶酶分别可可以提高高HA的的产量和和相对分分子质量量。1.4.3发酵酵液中透透明质酸酸含量检检测方法法目前，HHA含量量测

46、定普普遍采用用硫酸咔咔唑法和和CTAAB（十十六烷基基三甲基基溴化铵铵）比浊浊法。随随着对CCTABB比浊法法更多的的探讨和和探讨的的不断深深入，CCTABB比浊法法越来越越显示了了它独特特的优势势，并将将逐步取取代硫酸酸咔唑法法。各自自的实验验步骤也也随着人人们对实实验的不不断深入入和探索索不断简简化，测测量的精精确度和和效率也也大幅度度提高。（1）CCTABB比浊法法早在19956年年，Feerraantee等就利利用透明明质酸和和CTAAB络合合可生成成复合物物的性质质，开发发了CTTAB比比浊法测测定溶液液中透明明质酸的的含量。CTAB比浊法是十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液与HA溶液反应产生混浊的特性，通过反应体系的吸光度来反映其浊度47-49，进而通过浊度与HA浓度的线性相关性，建立起一种快速、安全、准确地测定HA的方法。在溶液中中，CTABB的氮原原子可以以与HAA中羧基基的氧原原子配对对，形成成不溶于于水的HHA-CCTABB络合物物。而CTAAB不会会与生成成HA的单单体UDDP-葡葡萄糖酸酸和UDDP-NN-乙酰酰-D-氨基葡葡萄糖胺胺作用，从从而保证证